本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用产虾青素酯酶生产菌株胞外粗酶制剂高效快速制备游离虾青素的方法。
背景技术：
天然虾青素(astaxanthin，又称3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素)是萜烯类不饱和化合物，是一种类胡萝卜素，主要来源于雨生红球藻、红发夫酵母、虾、蟹等甲壳类动物，为紫红色，易氧化成虾红素(astacene)。虾青素可以淬灭单线态氧、清除自由基，其抗氧化能力是其他类胡萝卜素的10倍，维生素e的500倍。虾青素具有良好的生理功能，主要功能包括：抗氧化、抗衰老、保护视神经、增强人体免疫功能、减轻脑梗塞危害、消炎作用、预防癌症、心血管疾病和糖尿病等。由于天然虾青素生物功能显著，因此其在食品、水产养殖、医药及化妆品等行业具有良好的应用前景。
雨生红球藻(haematococcuspluvialis)是一种单细胞微藻，是自然界中虾青素含量最丰富的生物，其虾青素含量可达干重的3.0％甚至更高。虾青素具有多种几何异构体，如9-顺式(9-cis-astaxanthin)、13-顺式(13-cis-astaxanthin)和全反式(all-trans-astaxanthin)，其中全反式构型是最稳定的结构(图1)。雨生红球藻提取的虾青素主要为左旋虾青素(3s、3s’)，左旋虾青素抗氧化性最强，利于吸收，与人体、动物体内所需虾青素结构一致，能最大程度上发挥虾青素的生物功效。雨生红球藻中的虾青素主要以酯类形式存在，约占总虾青素的95％，含有70％的虾青素单酯分子，25％的双酯分子和5％的游离虾青素分子。而虾青素酯的应用受到严重限制，因为虾青素酯中的脂肪酸成分非常复杂，难以对其进行分析鉴定，而且不同脂肪酸链构成的虾青素酯在色素沉积等方面也存在显著的差异。通过水解虾青素酯，制备成游离全反式虾青素具有非常实用的应用价值。
目前水解虾青素酯主要采用皂化法，皂化法反应时间长，反应过程过于剧烈，产物难以控制，并且高浓度碱会对虾青素造成破坏，产生较多类似虾红素和半虾红素等副产物，而且反应过程中的碱和有机溶剂会对环境造成巨大的破坏。另一种方法是酶解法，目前酶解法制备游离虾青素存在水解效率低下、反应时间过长、反应过程较复杂等问题，而且，研究大都集中于单一酯酶或脂肪酶的水解法上。鉴于雨生红球藻中虾青素酯的成分比较复杂，不同脂类水解酶对脂肪酸的特异性存在一定差异，尝试研究使用不同脂肪酸和酯酶间的协同作用水解虾青素酯，将更有利于游离虾青素的制备。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种虾青素酯酶生产菌株胞外粗酶制剂高效快速制备游离虾青素的方法。建立了一种高效、快速、绿色、安全和经济地制备游离全反式虾青素的方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明提供的菌株为铜绿假单胞菌，可利用铜绿假单胞菌产生的胞外粗酶制剂用来催化水解反应。
一种高效快速制备游离虾青素的方法，按照如下步骤进行：
(1)将铜绿假单胞菌甘油管接种到种子培养液中，35-40℃摇床培养12-48h，然后将0.5-2.0％的种子培养液接种到发酵培养基中，35-40℃摇床震荡培养36-72h；
(2)将培养后的发酵液取出，2-6℃条件下离心处理6-15min，保留上清，去除沉淀，将上清置于-80℃预冻后，放入冷冻干燥机中，冻干后取出酶粉放入干燥器中保藏备用；
(3)取雨生红球藻，用无水乙醇溶解，加入胞外粗酶制剂，溶解于ph为8.5-9.5的缓冲液中，加入到反应容器中，充氮气，避光在35-40℃条件下反应20-40min；
(4)采用有机溶剂萃取制备游离虾青素。
所述种子培养液由如下重量百分比的物质组成：蛋白胨，1.0％；酵母粉，0.5％；nacl，1.0％；水，100ml；调ph7.0；121℃灭菌20min。
所述发酵培养基由如下重量百分比的物质组成：蛋白胨，1.0％；酵母粉，0.5％；nacl，1.0％；水，1l；调ph7.0；121℃灭菌20min。
步骤(3)所述无水乙醇与缓冲液的比例为1:(8-16)。
所述缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液。
所述步骤(4)有机溶剂为乙酸乙酯：乙醇混合物。
步骤(2)所述离心的速率为5439×g。
步骤(3)所述缓冲液中加入黄芪苷。
本发明的有益效果：本发明提供了一种高效、快速、绿色、安全和经济地制备游离全反式虾青素的方法。该工艺既克服了传统皂化法制备虾青素过程易产生副产物虾红素和半虾红素的缺点，又改善了单一酶解法制备虾青素效率低、成本高等弊端。提高了虾青素酯的转化率。本发明制备得到的虾青素可用于水产、畜禽等饲料的添加剂；可以用作虾青素标品的制备；可以作为食品着色剂用；还可作为功能性成分用于保健食品的开发。
附图说明
图1：虾青素及其几何异构体，9-cis、13-cis和全反式。
图2：游离虾青素的tlc检测，lane1：雨生红球藻油(虾青素酯)，lane2：生物催化反应产物，lane3：游离虾青素标准品。
图3：虾青素产品hplc检测图谱。
图4：虾青素产品lc-ms/ms检测图谱。
图5：不同溶剂对虾青素酯和虾青素提取效率的影响。
图6：反应ph值对每毫克雨生红球藻油制备游离全反式虾青素量的影响。
图7：乙醇和缓冲溶液的比例对每毫克雨生红球藻油制备游离全反式虾青素量的影响。
图8：温度对每毫克雨生红球藻油制备游离全反式虾青素量的影响。
图9：时间对每毫克雨生红球藻油制备游离全反式虾青素量及虾青素酯水解率的影响。
图10：胞外粗酶制剂量对每毫克雨生红球藻油制备游离全反式虾青素量及虾青素酯水解率的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
水解虾青素酯菌株的筛选：
本实施例所使用的培养基配方如下:
筛选平板固体培养基：
雨生红球藻油，0.05％；tritonx-100，1.0％；kno3，0.1％；k2hpo4，0.05％；mgso4·7h2o，0.05％；nacl，0.05％；feso4·7h2o，0.001％；蛋白胨，1.0％；琼脂粉，2.0％；h2o，100ml；ph7.0。
种子培养基：
蛋白胨，1.0％；酵母粉，0.5％；nacl，1.0％；水，100ml；ph7.0；121℃灭菌20min。
发酵培养基：
蛋白胨，1.0％；酵母粉，0.5％；nacl，1.0％；水，1l；ph7.0；121℃灭菌20min。
富集培养：
将保藏的甘油管菌液接入种子培养基中，混合均匀后，在37℃摇床180rpm下培养24h。
平板筛菌：
取活化后的菌液进行100倍的适度稀释，涂布于固体筛选平板上；置于菌的不同最适温度培养箱中，静置培养48h。通过观察平板，可以发现铜绿假单胞菌涂布的平板上，有明显的水解环，因此进行铜绿假单胞菌的后续发酵研究。
发酵产酶：
将保存在-20℃的铜绿假单胞菌甘油管菌株接种到培养基中，37℃摇床培养24h，然后将1.0％的种子液接种到发酵培养基中，37℃摇床200rpm下震荡培养48h。
胞外粗酶粉制备：
将培养48h后的发酵液取出，进行5439×g，10min，4℃离心处理，保留上清，去除沉淀，将上清置于-80℃预冻后，放入冷冻干燥机中，冻干后取出酶粉放入干燥器中保藏备用。
表征胞外酶制剂中酯酶和脂肪酶活性：
采用分光光度计法检测酯酶酶活，对硝基苯酚丁酸酯(pnpb)作为反应底物，在405nm下检测酯酶水解作用产生的对硝基苯酚(pnp)的量，来确定酯酶酶活。20mmpnpb溶于异丙醇:二甲基亚砜(3:1)混合有机溶剂中，将25μl底物溶液添加到1mltris-hcl(100mm，ph8.0)的缓冲溶液中，置于37℃水浴孵育5min后，添加5μl酶液开始反应，反应5min后，添加500μlsds溶液(1.0％)终止反应。酶活单位定义；在一定的反应条件下，每分钟水解pnpb释放1μmolpnp所需的酶量定义为1个酯酶酶活单位，即1u。脂肪酶酶活检测方法与酯酶检测方法类似，脂肪酶酶活检测使用的底物为对硝基苯酚棕榈酸酯(pnpp)。检测胞外粗酶粉活性，其中脂肪酶和酯酶活性分别为0.017u/mg和0.176u/mg。酶制剂中的蛋白质含量通过考马斯亮蓝方法测量。
薄层色谱(thinlayerchromatography,tlc)检测：
水解反应结束后，用有机溶剂进行萃取，即加入适量乙酸乙酯和乙醇，比例为1：1(v/v)，薄层层析法检测虾青素。用毛细管点样于硅胶板上，点样后置于用层析液(丙酮/正己烷＝1/4,v/v)密封平衡好的层析缸中，待溶剂前沿距硅胶板上边缘1cm时，取出硅胶板，室温条件下自然显色。以游离全反式虾青素标准品作为对照以确认虾青素酯水解成虾青素。
如图2所示，泳道1：雨生红球藻油(底物)；泳道2：生物催化产物；泳道3：游离全反式虾青素。通过tlc分析比较标准游离虾青素与反应产物和底物，证明虾青素酯几乎完全转化成游离虾青素。
高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，hplc)检测：
将上面萃取处理后的样品用氮气吹干，然后用高效液相色谱流动相复溶，即甲醇和甲基叔丁基醚各加500ml(1/1，v/v)进行溶解，过0.22μm有机膜收集备用分析。液相色谱色谱柱：ymc-carotenoid-c30色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：a是甲醇，b是甲基叔丁基醚；采用线性梯度洗脱：0-15min，b为10％；15-25min，b由10％升至60％；25-35min，b由60％降回10％。流速：1ml/min；dad检测波长476nm；温度：35℃；进样量：20μl。由相应的色谱峰面积按下式计算虾青素酯的水解率：
通过hplc对相同样品进行比较分析来确认tlc结果。图3是游离的全反式虾青素样品的hplc分析结果。游离虾青素对应的峰值出现在7.2min左右。20min后检测到对应于虾青素酯的峰。通过对比分析可以看出，经过30min的水解反应，虾青素酯完全水解成游离虾青素，而且与传统皂化法比较，可以看出，反应时间较短，全反式虾青素的降解更少，几乎没有副产物产生。生物催化是快速制备游离虾青素的有效方法，因此它可能是传统皂化水解虾青素的替代方案。
液相色谱-质谱/质谱联用(lc-ms/ms)分析：
液相色谱-质谱/质谱联用(lc-ms/ms)技术用来鉴定反应后的游离全反式虾青素。ms仪器采用brukermaxisii，检测采用大气压化学电离源(apci)。电晕针的电压设置为35ev，氮气流速为5l/min。扫描范围为200到800(m/z)。通过lc-ms/ms分析证实了反应产物的表征。从图4a可以看出，混合物中游离的全反式虾青素的保留时间(保留时间7.7min)与标准一致。在图4b中表示来自图4a的峰(7.7分钟)的ms结果，在m/z597.3942处存在强的准分子离子，其对应于全反式虾青素[m+h]+。如图4c所示，m/z147.1273和173.1408处的峰是典型的游离全反式虾青素片段。因此，峰值(保留时间7.7min)最终被鉴定为游离全反式虾青素。
水解虾青素酯：
利用制备好的胞外粗酶制剂，进行水解虾青素酯反应，生物催化水解反应体系为：先称取了2mg雨生红球藻油，用无水乙醇溶解，再称取3.7、7.3、11.0、14.7、18.3和22.0mg不同蛋白含量的胞外粗酶制剂，将酶粉用缓冲溶液溶液(100mm，ph5.0-10.0)溶解后倒入反应瓶，其中总反应体系为5.5ml，无水乙醇与缓冲溶液的比例为1:(8-16)，充氮气，避光分别放入20、25、30、35、37、40、45和50℃水浴摇床中反应10-50min。反应完毕后进行有机溶剂萃取。
不同溶剂对反应溶液萃取效率的影响：
分别使用二氯甲烷，丙酮，甲醇：二氯甲烷，异丙醇：二氯甲烷，乙酸乙酯：乙醇和正己烷：乙醇分别从反应介质中提取虾青素。萃取后，通过薄层色谱(tlc)(丙酮/正己烷＝1/4，v/v作为展开剂)分析有机相。使用游离的全反式虾青素标准品作为对照以确认虾青素酯水解成虾青素。通过hplc定量分析不同有机溶剂从反应介质中提取虾青素酯和虾青素的效果，结果乙酸乙酯：乙醇混合物的提取产率最高(图5)。游离全反式虾青素的产量是每毫克雨生红球藻油82.83μg。
实施例2
水解虾青素酯工艺优化：
1)反应ph值对水解虾青素酯的影响
称取2mg雨生红球藻油，用0.5ml无水乙醇溶解，再称取适量胞外粗酶制剂，将酶粉溶解于不同ph值的缓冲溶液，采用的缓冲溶液如下：柠檬酸缓冲溶液(100mm，ph5.0-6.0),磷酸钠缓冲溶液(100mm，ph6.0-8.0)，tris-hcl缓冲溶液(100mm，ph7.0-9.0)和甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(100mm，ph9.0-10.0)，加入到反应瓶中，充氮气，避光放入37℃水浴摇床中反应30min，即无水乙醇：缓冲溶液＝1：10(v/v)，总共5.5ml反应体系。
如图6所示，反应体系中通过添加不同缓冲溶液，研究不同ph值对酶法水解虾青素酯的影响，在ph为9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液下，其水解效果最好，故将ph为9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液定为最佳的反应缓冲溶液。
2)乙醇和缓冲溶液比例对水解虾青素酯的影响
其他条件不变，在5.5ml反应体系的情况下调整无水乙醇：缓冲溶液的比例，即无水乙醇与缓冲溶液的比例为1:8、1:10、1:12、1:14、1:16(v/v)。
如图7所示，在无水乙醇:缓冲溶液＝1:10(v/v)的时候，反应效果最佳，因此确定最佳反应条件无水乙醇与缓冲溶液的比例为1:10(v/v)。
3)反应温度对水解虾青素酯的影响
在其他条件不变的情况下，分别在20、25、30、35、37、40、45和50℃下反应。研究不同反应温度下，制备游离虾青素的产量。
如图8所示，在反应温度37℃时，水解效果最佳，在37℃之后，水解效率逐渐降低，故酶促反应体系最佳的反应温度为37℃。
在不同反应时间和酶制剂剂量下评估全反式虾青素的水解：
在探索和优化上述三个因素对虾青素酯生物催化水解的影响后，在最佳反应条件下，使用14.7mg(蛋白质含量)的冻干胞外粗酶制剂加入水解反应体系，分别反应0、10、20、30、40和50min。然后，为了具有更可调的反应体系，我们还研究了在30min时，添加不同剂量胞外粗酶制剂(3.7、7.3、11.0、14.7、18.3和22.0mg)对水解虾青素酯的影响。
当添加14.7mg(蛋白质含量)的冻干胞外粗酶制剂时，虾青素酯在30min内几乎完全水解(98.7％)(图9)。因此，这种胞外粗酶制剂能够在短时间内催化虾青素酯的水解，是一种有效制备低稳定性虾青素产品的方法。
在添加不同量胞外粗酶制剂的情况下，反应30min(图10)。发现加入的酶制剂的量对水解反应具有显着的影响。随着添加酶制剂量的增加，每mg雨生红球藻油产生游离虾青素的量也增加，当添加14.7mg或更多的生物催化剂时，虾青素酯基本被水解完全。
4)缓冲溶液中加入黄芪苷对水解虾青素酯的影响
1ml甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中加入5mm的黄芪苷，对缓冲液的ph影响不大，采用上述同样的方法水解虾青素酯，虾青素酯在15分钟内几乎完全水解(99.3％)；游离全反式虾青素的产量是每毫克雨生红球藻88.91μg，产量有显著提高。
本发明提供了一种高效且快速的生物催化方法，用于在相对温和的反应条件下高效和快速地制备游离全反式虾青素。通过单因素实验和box-behnken实验，最终确定最佳反应条件为：使用14.7mg(蛋白质含量)来自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)的冻干胞外粗酶制剂溶于5.01mlph值为9.16的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，同时添加2mg溶于0.49ml无水乙醇中雨生红球藻油作为底物，在氮气和黑暗条件下，36.01℃下反应30min。虾青素酯的水解率高达98.72％，每mg雨生红球藻油游离全反式虾青素的产量为82.83μg。与传统的皂化方法相比，生物催化方法绿色经济，不会造成环境破坏，产品副产物少。与已有的发酵法和单一脂肪酶、胆固醇酯酶的酶法水解相比，不仅反应时间大大减少，而且有利于简化工艺流程节省成本，也适用于雨生红球藻源以外的其他来源水解虾青素酯。此外，通过生物催化反应来水解虾青素酯可以快速制备高纯度的游离虾青素，而且可以检测含有虾青素产品(例如食品)中的虾青素含量，并作为确保其安全食用的辅助步骤。本发明也为后续研究虾青素和虾青素酯的生物活性奠定基础，对促进雨生红球藻源虾青素的生产和发展具有重要意义。