本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌zj316高密度发酵制备细菌素的方法。
背景技术：
细菌素是由乳杆菌产生的一种耐高温、耐酸、在人体中可降解、安全无毒，且具有较强抑菌活性的抗菌短肽。细菌素是由微生物通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或低分子量多肽物质，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素具有自身免疫性。
细菌素作为一种特殊的抗菌抑菌蛋白质，具有抑菌活性强、生物相容性好、性能稳定、可生物降解、可消化吸收、生物安全性高的特点，在预防及治疗畜禽疾病、生产绿色生物食品、饲料添加剂和生物兽药领域具有广阔的开发应用前景。
植物乳杆菌zj316的生长与细菌素的生成具有较强的关联性，可以通过增加菌体的密度来提高细菌素的产量。菌体密度又与补料方式和发酵培养的ph有关，但是补料方式与ph对菌体密度的影响关系有比较复杂，之间不是简单的线性关系，所以目前仍没有一种较好的通过提高菌体密度来提高细菌素产量的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出植物乳杆菌zj316高密度发酵制备细菌素的方法，该种方法通过指数补料的方式进行发酵培养，同时又通过调节底物中碳源和氮源的质量比、培养基的ph来增加植物乳杆菌zj316的密度，从而增加了细菌素的产量。
本发明提出植物乳杆菌zj316高密度发酵制备细菌素的方法，将植物乳杆菌zj316接种至培养基内进行发酵培养，得到细菌素，所述培养采用指数补料的方式进行补料培养，所述指数补料的底物中碳源和氮源的质量比为1：1.9～2.1；所述培养基的ph为5.8～6.2。
由于乳杆菌在培养发酵时，0～2h时菌体生长缓慢，为迟缓期，2h以后菌体生长速度加快，进入对数生长期，16～22h，菌体生长速度减缓，是菌体的生长稳定期。在消耗方面：在迟缓期，发酵液中的营养物质消耗缓慢；进入对数期后发酵液中营养物质含量迅速下降；在稳定期，营养物质的消耗速度有所减缓，发酵结束时营养物质最低。对于产细菌素方面，2h开始细菌素开始产生，6h后，细菌素的生成速度开始加快，在24h发酵液中细菌素的效价值达到最大。随着发酵的继续，细菌素的活性开始下降。
所以，采用采用指数补料的方式最为符合乳杆菌的生长需求，随着菌体的生长，给予所需的补给，这样不仅满足了菌体的生长需要，而且也避免了，菌体在迟缓期时补入大量营养物质，例如引起葡萄糖效应，积累大量有机酸，反而抑制了菌体的生长。
底物中的碳源和氮源比例对乳杆菌的生长以及细菌素的产生也会带来较大的影响，随着底物中氮源比例的增加，菌体数量与产细菌素的量都有所提高。这可能是由于发酵液中缺乏氮源所提供的促进菌体生长与代谢所需要的维生素、游离氨基酸等营养因子；但是，当氮源的比例增加至一定值时，菌体生物量与发酵液中细菌素的效价值都有所降低，此时氮源就转化成了限制性因子。所以，本发明采用的碳源与氮源的比例为1：1.9～2.1，菌体生物量、菌体密度与细菌素的效价值都达到最高值。
偏酸性的环境下有利于乳酸菌的生长与细菌素的产生，较高的ph并不利于乳酸菌的生长与细菌素的产生。这是因为高ph有利于细菌素吸附于细胞，促进了一些没有活性的细菌素的聚合体的形成，同时也会促进了细菌素的降解。菌体生长与生产细菌素的最适ph并不一致，即细菌素的产生与菌体生长之间并不是完全成正相关。因为细菌素的所要求的ph值要比菌体生长所需的ph值偏低一些，所以本发明中将培养基中的ph值设置在5.8～6.2，这样在菌体生长初期，ph值偏高的环境下比较适合菌体的生长和繁殖，当随着指数补料的不断进行，底物的不断增加，ph值也随之降低，这样当菌体进入对数期前后，达到较高密度，也就是细菌素的重要的生成阶段时，ph值偏酸性，这时环境更适合细菌素的生成，提高了细菌素的产量。
进一步的，所述碳源为葡萄糖、糖蜜和乳糖中的一种或者多种。更加优选的，所述糖蜜为甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜中的一种或两种。由于糖类不仅为菌体最为重要的营养物质，为菌体的生长和细菌素的生成提供必要的碳源。糖蜜含有维生素、矿物质、菌体蛋白、核酸、表面活性物及促生长因子（生物活性物质）等成分，可以更好的促菌体和细菌素生长、生成；乳糖在乳酸菌的作用下，分解成半乳糖和葡萄糖，保证了碳源的缓释效果。同时为了满足更多的需求，也可将葡萄糖、糖蜜和乳糖混合使用，已达到目的效果。
进一步的，所述氮源包含大豆蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铵和蚕蛹粉。蚕蛹粉中不仅含有丰富的脂肪，而且含有大量的氨基酸以及钙和磷，这些可以促进菌体的代谢繁殖，增加菌体密度，使其加快细菌素的生成。
进一步的，所述底物中还包含精氨酸和蛋氨酸中的一种或者两种。精氨酸和蛋氨酸可以促进菌体的代谢，使其加快细菌素的生成。
进一步的，所述底物的ph为5.3～5.7。可以在指数补料的过程中，随着底物的加入，环境ph值也随之降低，这时菌体已在培养基最初ph值下得到了更好的生长繁殖，当环境ph值降低后，就会更适合细菌素的生成。
进一步的，所述培养基还包含表面活性剂。所述表面活性剂包括吐温类和司盘类中的一种或者两种。所述吐温类和司盘类的质量比为9：0.5～1.5。
表面活性剂可以降低细菌菌体与培养基接触面之间的表面张力，从而改变乳杆菌细胞膜的通透性，促进营养物质进入细胞及代谢产物排出体外，因而促进细菌素的产生从而使细菌素的活力增强网。除此之外，吐温类可为生成细菌素菌株的生长提供脂肪酸，也可作为一种类似维生素的物质，有助于细菌素的产生。
进一步的，所述植物乳杆菌zj316在接种前进行6～9次传代的纯化培养。这样的目的是为了保证菌体的高纯化处理后，得到优质的菌体进行接种，能够在发酵培养过程中能够更好的繁殖或者细菌素的生成，同时也能提高细菌素的活性。
本发明的植物乳杆菌zj316高密度发酵制备细菌素的方法，该种方法调节控制底物中碳源和氮源的质量比，以及培养基的ph，通过指数补料的方式来进行植物乳杆菌zj316的高密度发酵培养，大大提高了细菌素的产量，同时也保证了细菌素的纯度和活性。
具体实施方式
为下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，本领域技术人员对本发明所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本发明实施例中的配比均为以重量计。
实施例1
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代6次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，培养基组份为蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氢二钾、柠檬酸三胺、乙酸钠、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和司盘20，吐温80与司盘20的质量比为9：0.5，培养基ph值为5.8；发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，底料碳源为葡萄糖；氮源为大豆蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铵、蚕蛹粉、精氨酸和蛋氨酸，底物中碳源和氮源的质量比为1：1.9，底物ph值为5.3；最终得到细菌素。
实施例2
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代8次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，培养基组份为蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氢二钾、柠檬酸三胺、乙酸钠、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和司盘20，吐温80与司盘20的质量比为9：1，培养基ph值为6；发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，底料碳源为葡萄糖；氮源为大豆蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铵、蚕蛹粉、精氨酸和蛋氨酸，底物中碳源和氮源的质量比为1：2，底物ph值为5.5；最终得到细菌素。
实施例3
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代9次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，培养基组份为蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氢二钾、柠檬酸三胺、乙酸钠、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和司盘20，吐温80与司盘20的质量比为9：1.5，培养基ph值为6.2；发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，底料碳源为葡萄糖；氮源为大豆蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铵、蚕蛹粉、精氨酸和蛋氨酸，底物中碳源和氮源的质量比为1：2.1，底物ph值为5.7；最终得到细菌素。
对比例1
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代6次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，培养基组份为蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氢二钾、柠檬酸三胺、乙酸钠、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和司盘20，吐温80与司盘20的质量比为9：5，培养基ph值为5.8；发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，底料碳源为葡萄糖；氮源为大豆蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铵、蚕蛹粉、精氨酸和蛋氨酸，底物中碳源和氮源的质量比为1：1.9，底物ph值为5.3；最终得到细菌素。
对比例2
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代9次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，培养基组份为蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氢二钾、柠檬酸三胺、乙酸钠、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和司盘20，吐温80与司盘20的质量比为9：1.5，培养基ph值为6.5；发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，底料碳源为葡萄糖；氮源为大豆蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铵、蚕蛹粉、精氨酸和蛋氨酸，底物中碳源和氮源的质量比为1：2.1，底物ph值为5.7；最终得到细菌素。
对比例3
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代9次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，培养基组份为蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氢二钾、柠檬酸三胺、乙酸钠、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和司盘20，吐温80与司盘20的质量比为9：1.5，培养基ph值为6.2；发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，底料碳源为葡萄糖；氮源为大豆蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铵、蚕蛹粉、精氨酸和蛋氨酸，底物中碳源和氮源的质量比为1：4，底物ph值为5.7；最终得到细菌素。
对比例4
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代9次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，培养基组份为蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氢二钾、柠檬酸三胺、乙酸钠、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和司盘20，吐温80与司盘20的质量比为9：1.5，培养基ph值为6.2；发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，按照恒速补料方式进行补料，底料碳源为葡萄糖；氮源为大豆蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铵、蚕蛹粉、精氨酸和蛋氨酸，底物中碳源和氮源的质量比为1：2，底物ph值为5.7；最终得到细菌素。
对比例5
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代9次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，培养基组份为蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氢二钾、柠檬酸三胺、乙酸钠、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和司盘20，吐温80与司盘20的质量比为9：1.5，培养基ph值为6.2；发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，按照恒速补料方式进行补料，底料碳源为葡萄糖；氮源为大豆蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸铵、蚕蛹粉、精氨酸和蛋氨酸，底物中碳源和氮源的质量比为1：2，底物ph值为5.7；最终得到细菌素。
评价：
通过对实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3所得到的细菌素进行收集，并对产量和比活力进行检测，检测结果见表1。
通过表1数据对比可知，实施例1、实施例2、实施例3得到的细菌素在产量和比活力均明显优于对比例1、对比例2、对比例3、对比例4。充分说明本发明采用的补料方式、碳源和氮源比值、培养基ph的选择对细菌素的产量具有明显的提高，同时对比例1中表面活性剂吐温类和司盘类的质量比值也对细菌素的产量造成一定的影响。
以上对本发明的实施例进行了示例性说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依据本发明申请范围的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。