本发明属于生物
技术领域：
，具体地说，涉及特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属vkorc1基因编码区的引物组和方法。
背景技术：
抗凝血类灭鼠剂是目前防控鼠类的主要化学灭鼠剂，它们可以与维生素k循环中的vkor酶相结合，阻止还原型维生素k的生成，从而进一步阻止凝血因子的活化，导致凝血功能障碍。研究表明抗凝血类灭鼠剂8-10年之后就出现了抗性鼠，抗药性的产生极大降低了灭鼠剂的使用效率。因此，在实际鼠害防控过程中应及时检测鼠类种群的抗性水平，根据抗性水平选择合适的抗凝血类灭鼠剂，即在抗性水平较低的地区优先使用低毒的第一代灭鼠剂，在出现抗性的地区要使用毒性更强的第二代抗凝血类灭鼠剂，防止抗性种群的继续扩散。田鼠类是危害我国农田和草原的主要害鼠种类之一，常见的田鼠种类包括仓鼠科田鼠属的东方田鼠(microtusfortis)、莫氏田鼠(microtusmaximowiczii)，以及毛足田鼠属的布氏田鼠(lasiopodomysbrandtii)、棕色田鼠(lasiopodomysmandarinus)等，这些田鼠会对农田和草原造成巨大损失，主要危害作物约有16科近40种，危害严重时可造成小麦减产15％以上，苹果损失10～15％。vkorc1基因是抗凝血类灭鼠剂的靶基因，该基因上的变异是鼠类对抗凝血类灭鼠剂产生抗药性的重要机制之一。目前，在ncbi、uniprot以及各种文献上公开了褐家鼠、小家鼠等33种鼠的vkorc1基因，褐家鼠、小家鼠、黄胸鼠、黄毛鼠等鼠种已经有发表的引物，然而，这些引物并不能用来扩增布氏田鼠(lasiopodomysbrandtii)、棕色田鼠(lasiopodomysmandarinus)、莫氏田鼠(microtusmaximowiczii)、东方田鼠(microtusfortis)等鼠类的vkorc1。ncbi中田鼠类仅有橙腹草原田鼠(microtusochrogaster)的基因组参考序列，包含vkorc1基因的注释，但用于扩增橙腹草原田鼠的vkorc1引物未见报道。仓鼠科田鼠属至少包含65种不同的物种，barbosa等(2018)认为田鼠属至少分为两个主要的支系，一支以橙腹草原田鼠(m.ochrogaster)为代表的向北美辐射进化产生的田鼠类，另一支以根田鼠(m.oeconomus)为代表的从亚洲向欧洲以及北美辐射进化产生的田鼠类，因此橙腹草原田鼠与亚洲的田鼠类已经产生较大的遗传分化。galewski等(2006)通过建立田鼠亚科不同鼠类的线粒体细胞色素b的系统发育树，发现毛足田鼠属的棕色田鼠与橙腹草原田鼠的亲缘关系较远。发明人通过实验发现，根据橙腹草原田鼠的vkorc1序列设计的引物并不能完全的扩增出我国田鼠属和毛足田鼠属的鼠类vkorc1序列全长。目前，对于我国常见的田鼠属和毛足田鼠属的鼠类的vkorc1序列及扩增的引物还未见报道，对于田鼠属的莫氏田鼠(microtusmaximowiczii)、东方田鼠(microtusfortis)和毛足田鼠属的布氏田鼠(lasiopodomysbrandtii)和棕色田鼠(lasiopodomysmandarinus)等可产生严重危害的田鼠类的vkorc1基因尚属未知，且目前尚未见到针对上述田鼠的抗凝血类灭鼠剂产生抗药性的研究报道。因此，亟待开发对仓鼠科田鼠属和毛足田鼠属的vkorc1基因进行特异性扩增的引物和方法，进而为其抗药性研究提供基础。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属vkorc1基因编码区的引物组和方法。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：第一方面，本发明提供特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属vkorc1基因编码区的引物组，所述引物组包括3对用于分别扩增vkorc1基因3个外显子的引物，扩增第1外显子的引物序列如seqidno.1～2所示，扩增第2外显子的引物序列如seqidno.3～4所示，扩增第3外显子的引物序列如seqidno.5～6所示。应当理解，含有本发明所述引物组的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。第二方面，本发明提供一种特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属vkorc1基因编码区的方法，以田鼠属和毛足田鼠属的基因组dna为模板，利用前述引物组进行pcr扩增，即可扩增得到vkorc1基因的3个外显子序列。其中，所述pcr扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃～60℃退火30s，72℃延伸1分钟，循环34次；最后72℃延伸5分钟。进一步地，本发明对3对引物的退火温度进行优化，在50℃～60℃的退火温度范围内，筛选出最适合的退火温度，最后得到的不同引物对应的退火温度。具体体现为一种特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属vkorc1基因第1外显子的方法，以田鼠属和毛足田鼠属的基因组dna为模板，利用seqidno.1～2所示的引物进行pcr扩增，所述pcr扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，59.9℃退火30s，72℃延伸1分钟，循环34次；最后72℃延伸5分钟。以及一种特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属vkorc1基因第2和/或第3外显子的方法，以田鼠属和毛足田鼠属的基因组dna为模板，利用seqidno.3～4和/或seqidno.5～6所示的引物进行pcr扩增，所述pcr扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56.3℃退火30s，72℃延伸1分钟，循环34次；最后72℃延伸5分钟。其中，上述pcr扩增的pcr反应体系包括引物3对(浓度为10um)，10×缓冲液2.5μl，dntp2.5mμ，加taq酶2.5u；dna模板40-100ng，加水至25μl。第三方面，本发明提供了所述引物组在田鼠属和毛足田鼠属鼠类抗药性研究方面的应用，利用本发明所述引物组对多种田鼠属和毛足田鼠属鼠类的vkorc1基因编码区进行特异性扩增，并对扩增产物进行测序，比对测序结果，依据变异情况和突变频率判断抗药性水平。本发明的有益效果在于：本发明提供了特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属vkorc1基因编码区的引物组，并通过优化了扩增条件提供了基于该引物组的扩增方法。为田鼠属和毛足田鼠属鼠类的vkorc1基因扩增，及其与抗药性之前的相关研究提供了良好的基础。附图说明图1为4种田鼠的pcr产物电泳后的结果，以marker为间隔，从左到右分别对应第一、二、三编码区分别对应microtus_e1fµtus_e1r,microtus_e2fµtus_e2r，microtus_e3fµtus_e3r扩增的产物，每段pcr产物从左向右依此为布氏田鼠、东方田鼠、莫氏田鼠、棕色田鼠。图2为4种田鼠类的vkorc1基因编码区的核苷酸序列。图3为vkorc1氨基酸序列以及抗性相关位点。**标记的氨基酸位点表示在其他鼠或人类中发现的与抗性相关或该位点的突变会对vkor的活性产生影响，其中一些抗性突变位点具有趋同进化的特点，能引起不同鼠类物种的抗性，#表示在人(homosapiens)、褐家鼠(rattusnorvegicus)、小家鼠(musmusculus)、屋顶鼠(rattusrattus)、黄胸鼠(rattusflavipectus)、黄毛鼠(rattuslosea)、太平洋鼠(rattusexulans)等多种鼠类中，至少有两种鼠类在该位点发生突变的位点，其中一些已经被验证为抗性位点；*标记的氨基酸位点表示在人或是其它鼠类中可能与抗性相关，但是没有明确实验证据能表明突变对鼠类抗药性的产生或是vkor的活性有影响。图4为7种不同属的鼠类pcr产物电泳的结果，从左到右分别对应第一、二、三编码区分别对应microtus_e1fµtus_e1r,microtus_e2fµtus_e2r，microtus_e3fµtus_e3r扩增的产物，每段pcr产物从左向右依此为褐家鼠、板齿鼠、小家鼠、黑线仓鼠、大仓鼠、黑线姬鼠、红尾沙鼠。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例11、基因组dna的提取收集东方田鼠的尾巴(0.5～1cm)或其它组织，剪大约20mg样品，置于1.5ml离心管中。加裂解液600μl(含tris-hcl580μl，蛋白酶k20μg)，56℃热溶过夜，去上清，加入tris饱和酚600μl，上下摇匀5min，静置10min，12000r/min离心10min，取上清加1:1tris饱和酚：氯仿(300μl：300μl)，取上清，加入2倍4℃预冷的无水乙醇，12000r/min离心10min后将dna沉淀重新用1ml75％酒精漂洗沉淀，12000r/min离心10min后，将dna沉淀晾干加入te缓冲液50-100μl，溶解后放入-20℃冰箱保存。2、引物设计与反应条件的探索(1)从ncbi数据库获得橙腹草原田鼠(microtusochrogaster)的vkorc1基因序列(nc_022015.1)。(2)鼠类的vkorc1基因都包含3个外显子，编码161个氨基酸。以橙腹草原田鼠的vkorc1基因为模板序列，将序列导入软件primerpremier5中，设计引物。在设计引物时考虑的条件是：引物的长度为22±3bp；产物长度为800～1300bp；上下游引物的cg％相差不要超过10％；引物的3’端不允许错配；尽量避开引物二聚体和发夹结构；退火温度控制在50～60℃之间。最终进过一系列筛选，得到特异性引物microtus_e1fµtus_e1r,microtus_e2fµtus_e2r，microtus_e3fµtus_e3r。(3)pcr扩增反应条件的摸索：对三对引物的退火温度进行筛选，退火温度的范围控制在50℃～60℃，筛选出最适合的退火温度，最后得到的不同引物对应的退火温度。pcr扩增条件如下：95℃变性5分钟后，按照95℃30秒，54～60℃退火30s，72℃延伸1分钟的步骤，循环34次，最后72℃延伸5分钟。(4)凝胶电泳检测参考上述方法，对布氏田鼠、莫氏田鼠和棕色田鼠进行相同操作。将扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，发现第二段和第三段产物单一，无其他非特异性条带，可直接送测序；第一段除目的片段外有两条微弱的杂带，在1100bp处切胶回收后再进行测序。目的片段长度：第一段1100bp；第二段布氏田鼠1050bp，东方田鼠892bp，莫氏田鼠912bp，棕色田鼠1000bp；第三段850bp。检测抗性突变位点将pcr产物测序后与图2中的东方田鼠的参考序列进行比对，如果发现能引起氨基酸变异的突变，则与图3中突变的位点进行比对，如果突变发生在标双星(**)的位点并且有趋同进化的趋势(标#的点)，尤其是发生在128，139位点，表示该位点的变异可以引起东方田鼠抗性；如果发生在标(*)的位点，表示可能引起抗性，要明确该位点的抗性，可以参照致死期食毒法(oepp/eppo,1995)或血液凝集法(prescott&buckle,2007)检测该突变是否可以引起抗性，如果为抗性，则可以利用该突变的频率来评估种群的抗性水平。实施例2本实施例用于说明本发明所述引物组的特异性。针对鼠科大鼠属的褐家鼠(rattusnorvegicus)、鼠科板齿鼠属的板齿鼠(bandicotaindica)、鼠科小鼠属的小家鼠(musmusculus)、仓鼠科仓鼠属的黑线仓鼠(cricetulusbarabensis)、鼠科大仓鼠属的大仓鼠(tscherskiatriton)、鼠科姬鼠属的黑线姬鼠(apodemusagrarius)、鼠科沙鼠属的红尾沙鼠(merioneslibycus)的基因组dna利用实施例1设计的引物组进行pcr扩增。扩增结果显示(图4)，上述7种不同属的鼠(每一编码区从左往右依次为：褐家鼠、板齿鼠、小家鼠、黑线仓鼠、大仓鼠、黑线姬鼠、红尾沙鼠)经过pcr扩增之后均没有产生目的条带，而本发明设计的引物对毛足田鼠属和田鼠属的鼠种扩增效果较好(图1)。实施例3在设计引物的时候，因为需要得到不同鼠vkorc1基因完整的cds区域，最初考虑设计兼并引物。在codehop网站在线设计兼并引物，引物序列如下：volevk1f：5’-gcgcctgctgcgcntgytgyac-3’；volevk1r：5’-cggtggtgcagcaggcrcangcngt-3’。尝试各种温度和反应体系之后发现该引物并不能扩增出目的条带。因此，重新设计引物。参照橙腹草原田鼠的vkorc1基因全长，用primerpremier5软件设计引物，结果只能扩增四种鼠类的部分vkorc1序列，包括第一和第二段外显子区域，然而在其它鼠类中特别容易发生抗性变异的第三段外显子区域无法扩增出来。更换过的引物序列如下所示：随后根据新扩增出来的四种田鼠的第一段和第二段的vkorc1基因序列，通过clustalx软件比对找到一个保守区，然后在这个保守区上设计第三段引物的5’端，在橙腹草原田鼠vkorc1基因的第三段外显子区域的末端设计引物的3’端。最终得到引物如下：microtus_e3f5’-ctatgtagccctggttactc-3’microtus_e3r5’-ggcaaagcaggttacatta-3’microtus_e4f5’-ttttgtcaggtggtagtggtg-3’microtus_e4r5’-tagccaagagcagaaagcagt-3’microtus_e5f5’-gtgctgggattaaagcatgg-3’microtus_e5r5’-gaaagactgacaccccgaag-3’microtus_e6f5’-cctggttgtcattgaaact-3’microtus_e6r5’-gccctccatgctctgactcatc-3’microtus_e7f5’-agttcaggaagccagagg-3’microtus_e7r5’-ggcaaagcaggttacatta-3’microtus_e8f5’-tactaaatgcgtactctacca-3’microtus_e8r5’-ggcaaagcaggttacatta-3’microtus_e9f5’-caagaggcactaggctgac-3’microtus_e9r5’-aagcaacatcaagcccac-3’尝试各种反应体系和退火温度，最终发现引物microtus_e3f和microtus_e3r在56℃～60℃退火温度范围内扩增效果良好。经过测序发现该条带包含我们需要的四种田鼠的vkorc1基因的第三段外显子区域。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国农业科学院植物保护研究所<120>特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属vkorc1基因编码区的引物组和方法<141>2018-05-30<160>24<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctgccttgcctaagaacg18<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aagccactcacctaacaaca20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agcgtcctcaaccaatcc18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aaccagggctacatagaaa19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ctatgtagccctggttactc20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggcaaagcaggttacatta19<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ttgtcaggtggtagtggtg19<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ggcaaagcaggttacatta19<210>9<211>13<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cggcagacaaagc13<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10caaagcaggttacatta17<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11actcacatggtggcttaa18<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12aaggcaaagcagatgacg18<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ttttgtcaggtggtagtggtg21<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tagccaagagcagaaagcagt21<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gtgctgggattaaagcatgg20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gaaagactgacaccccgaag20<210>17<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17cctggttgtcattgaaact19<210>18<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gccctccatgctctgactcatc22<210>19<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19agttcaggaagccagagg18<210>20<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ggcaaagcaggttacatta19<210>21<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21tactaaatgcgtactctacca21<210>22<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22ggcaaagcaggttacatta19<210>23<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23caagaggcactaggctgac19<210>24<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24aagcaacatcaagcccac18当前第1页12