本发明属于基因检测领域，涉及一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒。
背景技术：
头颈癌是全世界第六大常见肿瘤类型，其中喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，而喉鳞状细胞癌(laryngealsquamouscellcarcinoma,lscc)是喉癌中最常见的组织学类型(约85％～90％)。随着医学的发展，喉癌的治疗方式也越来越多，但喉癌的死亡率并没有明显改善，其主要原因是目前缺乏简单适用的筛查方法。
微小rna(microrna,mirna)是指长度约22个核苷酸的内源性微小非编码rna，是多种生物学过程的有效调节子。对mirna的研究表明：mirna参与了人体细胞内多种重要的调节过程。其中mirnas与肿瘤发生、发展的关系已成为目前研究的热点。近年来，有关mirna在lscc诊断及转移等方面的研究层出不穷，已有多项研究发现lscc患者的组织和血液(包括血清和血浆)中有特别的mirna表达谱，并能提示lscc的诊断。
目前尚无有效早期诊断喉鳞状细胞癌的基因检测试剂盒。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术不足，提供一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
试剂盒1：
一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒，含有检测唾液中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-154-3p的引物；其中，hsa-mir-544a的特异正向引物序列如seq.no.1所示，hsa-mir-4726的特异正向引物序列如seq.no.2所示，hsa-mir-154-3p的特异正向引物序列如seq.no.3所示，各基因的通用反向引物序列如seq.no.7所示。
进一步地，还含有检测内参cel-mirna-39的引物，其特异正向引物序列如seq.no.6所示。当然，也可以使用其他常用的内参基因作为内参。
进一步地，还含有rt-pcr所需的酶和试剂等。
试剂盒2：
一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒，含有检测唾液中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-655-5p的引物；其中，hsa-mir-544a的特异正向引物序列如seq.no.1所示，hsa-mir-4726的特异正向引物序列如seq.no.2所示，hsa-mir-655-5p的特异正向引物序列如seq.no.4所示，各基因的通用反向引物序列如seq.no.7所示。
进一步地，还含有检测内参cel-mirna-39的引物，其特异正向引物序列如seq.no.6所示。当然，也可以使用其他常用的内参基因作为内参。
进一步地，还含有rt-pcr所需的酶和试剂等。
试剂盒3：
一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒，含有检测唾液中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-552-3p的引物；其中，hsa-mir-544a的特异正向引物序列如seq.no.1所示，hsa-mir-4726的特异正向引物序列如seq.no.2所示，hsa-mir-552-3p的特异正向引物序列如seq.no.5所示，各基因的通用反向引物序列如seq.no.7所示。
进一步地，还含有检测内参cel-mirna-39的引物，其特异正向引物序列如seq.no.6所示。当然，也可以使用其他常用的内参基因作为内参。
进一步地，还含有rt-pcr所需的酶和试剂等。
有益效果：
唾液中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-154-3p联合诊断lscc的准确率为96.88％(93/96)；唾液中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-655-5p联合诊断lscc的准确率为92.71％(89/96)；唾液中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-552-3p联合诊断lscc的准确率为95.83％(92/96)。
附图说明
图1为hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-154-3p联合诊断lscc的roc曲线；
图2为hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-655-5p联合诊断lscc的roc曲线；
图3为hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-552-3p联合诊断lscc的roc曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：mirna标志物对lscc诊断效能的初步验证
一、实验对象
本研究纳入2015年6月～2017年6月江苏省人民医院75例经who病理组织学确诊的初诊lscc患者。有其他肿瘤或急性感染的lscc患者被排除。患者中男性45例，女性30例。同时纳入75例江苏省人民医院健康体检中心进行体检的年龄、性别相匹配的健康人作为对照，其中男性45例，女性30例，年龄与lscc患者无统计学差异。
二、实验方法
1、唾液收集
唾液收集前，所有患者和健康人需禁食、禁饮至少2h。使用50ml无菌无酶离心管收集5ml自然流出的唾液，30min内收集完。唾液收集完后，4℃、2000g离心8min取上层上清液至1.5mlep管，再以4℃、16000g离心10min后再弃沉淀取上清液，将所获上清液以每管250μl分装后置-80℃保存。从采集唾液到-80℃冻存的过程在2h内完成。
2、总rna提取及cdna合成
提取试剂为德国qiagen公司的血清/血浆mirna提取试剂(mirneasyserum/plasma)试剂盒。按照说明书，取解冻的唾液上清液200μl，加入1000μl裂解液(qiazollysisreagent)，剧烈震荡后室温下(15℃～25℃)放置5min；加入3.5μlqiagen公司的血清/血浆纯化试剂盒外参(mirneasyserum/plasmaspike-incontrol)(cel-39)作为外参，混匀，再加200μl氯仿，剧烈摇动15s，室温保存2～3min；4℃、12000g离心15min；吸上层无色水相，移入另一ep管中(约400μl)；加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀；吸700μl样品到抽提微量rna(rneasyminelute)离心柱中；10000g，室温离心15s，弃去收集管中的液体；分别用700μl缓冲液rwt、缓冲液rpe、80％乙醇洗脱后，总rna结合到膜上，苯酚和其他污染物被有效洗去；最后加入14μl无酶水将离心柱上的rna洗脱下来。使用分光光度计检测评价所提取总rna的质量，总rna的od260/od280值在1.8～2.1之间为合格的rna样品，说明样品rna制备较纯，无蛋白质污染，样品可进行下一步操作。
取12μl提取的合格的rna以qiagen公司的mirna反转录(miscriptrt试剂盒)进行反转录，该试剂采用poly(a)聚合酶多腺苷酰化成熟mirna，并利用反转录酶及oligo-dt引物扩增将其转变为cdna。按照试剂盒说明操作如下：加入2μlmirna反转录混合物(miscriptreversetranscriptasemix)(一种经优化的poly(a)聚合酶和反转录酶混合物)、2μlmirna反转录核酸混合物(10×miscriptnucleicsmix)(包括dntps、ratp、oligo-dt引物等)、4μl缓冲液(5×miscripthispecbuffer)，然后进行反转录，反应体积为20μl，反应条件为37℃60min，95℃5min。反转录中加样过程置于冰上操作。反转录反应完成后cdna用无酶水以1:10稀释后置-20℃保存。
3、rt-pcr检测mirna
以qiagen公司mirna定量(miscriptsybrgreenpcr)试剂盒，按照25μl反应体系进行rt-pcr检测。检测体系包括：2.5μl稀释后的cdna、2.5μl特异正向引物(序列如下，由上海生工生物工程有限公司合成；外参引物包含在qiagen公司的提取试剂血清/血浆mirna提取试剂(mirneasyserum/plasma)试剂盒中、2.5μl10×miscriptuniversalprimer(通用反向引物)、12.5μlmirna定量混合物(2×quantitectsybrgreenpcrmastermix)、5μl无酶水。rt-pcr条件为：95℃15min后，94℃15s，55℃30s，70℃30s，40个循环。同时做溶解曲线是判断基因扩增的特异性。扩增采用abi7500仪器进行。所有样品做3复孔，对测量的ct值取平均值，排除掉ct值大于35的数据。根据待测标本的ct值，以cel-mirna-39作为外参，用2-δδct法对目的基因进行相对定量。最后，扩增结束后将扩增产物置于1％的琼脂糖凝胶中以110v电压电泳30min，凝胶成像系统做电泳结果分析。
hsa-mir-544a特异正向引物：5'-uaugucuugcacuccuccgugg-3'(seq.no.1)
hsa-mir-4726特异正向引物：5'-uucugucaccuuugcucccuua-3'(seq.no.2)
hsa-mir-154-3p特异正向引物：5'-caaucuccuuagaugcuggauu-3'(seq.no.3)
hsa-mir-655-5p特异正向引物：5'-agagguagcagugaaguugugu-3'(seq.no.4)
hsa-mir-552-3p特异正向引物：5'-ugauacagguagugguuaguuu-3'(seq.no.5)
内参cel-mirna-39特异正向引物：5'-ucaccggguguaaaucagcu-3'(seq.no.6)
通用反向引物：5'-gctccgcgattggagtggtgt-3'(seq.no.7)
4、统计学方法
采用spss17.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以(均值±标准偏差)表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以m(qr)表示，两组间比较采用mann-whitneyu检验；计数资料比较采用fisher's确切概率法；采用二元logistic回归分析计算mirna标志物联合的logistic回归方程；绘制mirna标志物单个及其联合诊断lscc的受试者工作特征曲线(roc曲线)，计算roc曲线下面积(auc)、灵敏度、特异度、约登指数。以p＜0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1、hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-154-3p在lscc患者与健康人唾液中的表达水平比较及联合诊断lscc的roc曲线
lscc患者组唾液中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726表达水平低于健康人组，lscc患者组唾液中hsa-mir-154-3p表达水平高于健康人组，差异有统计学意义(p＜0.05)。
以lscc为因变量(赋值：是＝1，否＝0)，hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-154-3p为自变量(连续型变量)，进行二元logistic回归分析，结果显示，logit(p)＝－0.035+9.615×hsa-mir-154-3p－48.773×hsa-mir-4726－65.386×hsa-mir-544a，其诊断lscc的auc为0.949，截断值为0.0991。roc曲线如图1所示。
2、hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-655-5p在lscc患者与健康人唾液中的表达水平比较及联合诊断lscc的roc曲线
lscc患者组唾液中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726表达水平低于健康人组，lscc患者组唾液中hsa-mir-655-5p表达水平高于健康人组，差异有统计学意义(p＜0.05)。
以lscc为因变量(赋值：是＝1，否＝0)，hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-655-5p为自变量(连续型变量)，进行二元logistic回归分析，结果显示，logit(p)＝－0.049+11.354×hsa-mir-655-5p－44.658×hsa-mir-4726－63.908×hsa-mir-544a，其诊断lscc的auc为0.953，截断值为0.0936。roc曲线如图2所示。
3、hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-552-3p在lscc患者与健康人唾液中的表达水平比较及联合诊断lscc的roc曲线
lscc患者组唾液中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726表达水平低于健康人组，lscc患者组唾液中hsa-mir-552-3p表达水平高于健康人组，差异有统计学意义(p＜0.05)。
以lscc为因变量(赋值：是＝1，否＝0)，hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-552-3p为自变量(连续型变量)，进行二元logistic回归分析，结果显示，logit(p)＝－0.067+8.437×hsa-mir-552-3p－53.565×hsa-mir-4726－61.722×hsa-mir-544a，其诊断lscc的auc为0.941，截断值为0.0985。roc曲线如图3所示。
hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-154-3p联合或hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-655-5p联合或hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-552-3p联合诊断lscc的roc曲线下面积均在0.9以上，诊断效能高，显著优于hsa-mir-544a(auc为0.753)、hsa-mir-4726(auc为0.694)、hsa-mir-154-3p(auc为0.635)、hsa-mir-655-5p(auc为0.611)、hsa-mir-552-3p(auc为0.705)单独诊断效能。
实施例2：mirna标志物对lscc诊断效能的进一步多中心验证
一、实验对象
本研究纳入2015年6月～2017年6月西南医科大学附属医院48例经who病理组织学确诊的初诊lscc患者。有其他肿瘤或急性感染的lscc患者被排除。患者中男性30例，女性18例。同时纳入48例西南医科大学附属医院健康体检中心进行体检的年龄、性别相匹配的健康人作为对照，其中男性30例，女性18例，年龄与lscc患者无统计学差异。
二、实验方法和结果
1、唾液收集
唾液收集前，所有患者和健康人需禁食、禁饮至少2h。使用50ml无菌无酶离心管收集5ml自然流出的唾液，30min内收集完。唾液收集完后，4℃、2000g离心8min取上层上清液至1.5mlep管，再以4℃、16000g离心10min后再弃沉淀取上清液，将所获上清液以每管250μl分装后置-80℃保存。从采集唾液到-80℃冻存的过程在2h内完成。
2、总rna提取及cdna合成
提取试剂为德国qiagen公司的血清/血浆mirna提取试剂(mirneasyserum/plasma)试剂盒。按照说明书，取解冻的唾液上清液200μl，加入1000μl裂解液(qiazollysisreagent)，剧烈震荡后室温下(15℃～25℃)放置5min；加入3.5μlqiagen公司的血清/血浆纯化试剂盒外参(mirneasyserum/plasmaspike-incontrol)(cel-39)作为外参，混匀，再加200μl氯仿，剧烈摇动15s，室温保存2～3min；4℃、12000g离心15min；吸上层无色水相，移入另一ep管中(约400μl)；加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀；吸700μl样品到抽提微量rna(rneasyminelute)离心柱中；10000g，室温离心15s，弃去收集管中的液体；分别用700μl缓冲液rwt、缓冲液rpe、80％乙醇洗脱后，总rna结合到膜上，苯酚和其他污染物被有效洗去；最后加入14μl无酶水将离心柱上的rna洗脱下来。使用分光光度计检测评价所提取总rna的质量，总rna的od260/od280值在1.8～2.1之间为合格的rna样品，说明样品rna制备较纯，无蛋白质污染，样品可进行下一步操作。
取12μl提取的合格的rna以qiagen公司的mirna反转录(miscriptrt试剂盒)进行反转录，该试剂采用poly(a)聚合酶多腺苷酰化成熟mirna，并利用反转录酶及oligo-dt引物扩增将其转变为cdna。按照试剂盒说明操作如下：加入2μlmirna反转录混合物(miscriptreversetranscriptasemix)(一种经优化的poly(a)聚合酶和反转录酶混合物)、2μlmirna反转录核酸混合物(10×miscriptnucleicsmix)(包括dntps、ratp、oligo-dt引物等)、4μl缓冲液(5×miscripthispecbuffer)，然后进行反转录，反应体积为20μl，反应条件为37℃60min，95℃5min。反转录中加样过程置于冰上操作。反转录反应完成后cdna用无酶水以1:10稀释后置-20℃保存。
3、rt-pcr检测mirna
以qiagen公司mirna定量(miscriptsybrgreenpcr)试剂盒，按照25μl反应体系进行rt-pcr检测。检测体系包括：2.5μl稀释后的cdna、2.5μl特异正向引物(序列如下，由上海生工生物工程有限公司合成；外参引物包含在qiagen公司的提取试剂血清/血浆mirna提取试剂(mirneasyserum/plasma)试剂盒中、2.5μl10×miscriptuniversalprimer(通用反向引物)、12.5μlmirna定量混合物(2×quantitectsybrgreenpcrmastermix)、5μl无酶水。rt-pcr条件为：95℃15min后，94℃15s，55℃30s，70℃30s，40个循环。同时做溶解曲线是判断基因扩增的特异性。扩增采用abi7500仪器进行。所有样品做3复孔，对测量的ct值取平均值，排除掉ct值大于35的数据。根据待测标本的ct值，以cel-mirna-39作为外参，用2-δδct法对目的基因进行相对定量。最后，扩增结束后将扩增产物置于1％的琼脂糖凝胶中以110v电压电泳30min，凝胶成像系统做电泳结果分析。
hsa-mir-544a特异正向引物：5'-uaugucuugcacuccuccgugg-3'(seq.no.1)
hsa-mir-4726特异正向引物：5'-uucugucaccuuugcucccuua-3'(seq.no.2)
hsa-mir-154-3p特异正向引物：5'-caaucuccuuagaugcuggauu-3'(seq.no.3)
hsa-mir-655-5p特异正向引物：5'-agagguagcagugaaguugugu-3'(seq.no.4)
hsa-mir-552-3p特异正向引物：5'-ugauacagguagugguuaguuu-3'(seq.no.5)
内参cel-mirna-39特异正向引物：5'-ucaccggguguaaaucagcu-3'(seq.no.6)
通用反向引物：5'-gctccgcgattggagtggtgt-3'(seq.no.7)
4、数据处理与结果
分别测定各唾液样本中目的mirna标志物的相对表达量，然后代入对应的logit(p)方程，高于截断值的预测为lscc患者，低于截断值的预测为健康人，然后用预测正确的例数除以总例数，计算得到预测准确率。结果：hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-154-3p联合预测的准确率为96.88％(93/96)；hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-655-5p联合预测的准确率为92.71％(89/96)；hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-552-3p联合预测的准确率为95.83％(92/96)。
实施例3：lscc诊断试剂盒
lscc诊断试剂盒中可以含有检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-154-3p，或检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-655-5p，或检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-552-3p的引物，还含有内参及rt-pcr所需的酶和试剂。
检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-154-3p，或检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-655-5p，或检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-552-3p的引物序列及内参引物序列如下：
hsa-mir-544a特异正向引物：5'-uaugucuugcacuccuccgugg-3'(seq.no.1)
hsa-mir-4726特异正向引物：5'-uucugucaccuuugcucccuua-3'(seq.no.2)
hsa-mir-154-3p特异正向引物：5'-caaucuccuuagaugcuggauu-3'(seq.no.3)
hsa-mir-655-5p特异正向引物：5'-agagguagcagugaaguugugu-3'(seq.no.4)
hsa-mir-552-3p特异正向引物：5'-ugauacagguagugguuaguuu-3'(seq.no.5)
内参cel-mirna-39特异正向引物：5'-ucaccggguguaaaucagcu-3'(seq.no.6)
通用反向引物：5'-gctccgcgattggagtggtgt-3'(seq.no.7)。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于上述具体实施例。
序列表
<110>葛孝锦
<120>一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
uaugucuugcacuccuccgugg22
<210>2
<211>22
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
uucugucaccuuugcucccuua22
<210>3
<211>22
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
caaucuccuuagaugcuggauu22
<210>4
<211>22
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
agagguagcagugaaguugugu22
<210>5
<211>22
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
ugauacagguagugguuaguuu22
<210>6
<211>20
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ucaccggguguaaaucagcu20
<210>7
<211>21
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
gctccgcgattggagtggtgt21