一种早期诊断喉鳞状细胞癌的血浆基因检测试剂盒的制作方法

本发明属于基因检测领域，涉及一种早期诊断喉鳞状细胞癌的血浆基因检测试剂盒。

背景技术

头颈癌是全世界第六大常见肿瘤类型，其中喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，而喉鳞状细胞癌(laryngealsquamouscellcarcinoma,lscc)是喉癌中最常见的组织学类型(约85％～90％)。随着医学的发展，喉癌的治疗方式也越来越多，但喉癌的死亡率并没有明显改善，其主要原因是目前缺乏简单适用的筛查方法。

微小rna(microrna,mirna)是指长度约22个核苷酸的内源性微小非编码rna，是多种生物学过程的有效调节子。对mirna的研究表明：mirna参与了人体细胞内多种重要的调节过程。其中mirnas与肿瘤发生、发展的关系已成为目前研究的热点。近年来，有关mirna在lscc诊断及转移等方面的研究层出不穷，已有多项研究发现lscc患者的组织和血液(包括血清和血浆)中有特别的mirna表达谱，并能提示lscc的诊断。

目前尚无有效早期诊断喉鳞状细胞癌的基因检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术不足，提供一种早期诊断喉鳞状细胞癌的血浆基因检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

试剂盒1：

一种早期诊断喉鳞状细胞癌的血浆基因检测试剂盒，含有检测血浆中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-135a-5p的引物；其中，hsa-mir-544a的特异正向引物序列如seq.no.1所示，hsa-mir-4726的特异正向引物序列如seq.no.2所示，hsa-mir-135a-5p的特异正向引物序列如seq.no.3所示，各基因的通用反向引物序列如seq.no.8所示。

进一步地，还含有检测内参cel-mirna-39的引物，其特异正向引物序列如seq.no.7所示。当然，也可以使用其他常用的内参基因作为内参。

进一步地，还含有rt-pcr所需的酶和试剂等。

试剂盒2：

一种早期诊断喉鳞状细胞癌的血浆基因检测试剂盒，含有检测血浆中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-2278的引物；其中，hsa-mir-544a的特异正向引物序列如seq.no.1所示，hsa-mir-4726的特异正向引物序列如seq.no.2所示，hsa-mir-2278的特异正向引物序列如seq.no.4所示，各基因的通用反向引物序列如seq.no.8所示。

进一步地，还含有检测内参cel-mirna-39的引物，其特异正向引物序列如seq.no.7所示。当然，也可以使用其他常用的内参基因作为内参。

进一步地，还含有rt-pcr所需的酶和试剂等。

试剂盒3：

一种早期诊断喉鳞状细胞癌的血浆基因检测试剂盒，含有检测血浆中hsa-mir-544a、hsa-mir-636和hsa-mir-597-5p的引物；其中，hsa-mir-544a的特异正向引物序列如seq.no.1所示，hsa-mir-636的特异正向引物序列如seq.no.5所示，hsa-mir-597-5p的特异正向引物序列如seq.no.6所示，各基因的通用反向引物序列如seq.no.8所示。

进一步地，还含有检测内参cel-mirna-39的引物，其特异正向引物序列如seq.no.7所示。当然，也可以使用其他常用的内参基因作为内参。

进一步地，还含有rt-pcr所需的酶和试剂等。

有益效果：

hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-135a-5p联合预测的准确率为91.67％(88/96)；hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-2278联合预测的准确率为90.63％(87/96)；hsa-mir-544a、hsa-mir-636和hsa-mir-597-5p联合预测的准确率为94.79％(91/96)。

附图说明

图1为hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-135a-5p联合诊断lscc的roc曲线；

图2为hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-2278联合诊断lscc的roc曲线；

图3为hsa-mir-544a、hsa-mir-636和hsa-mir-597-5p联合诊断lscc的roc曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1：mirna标志物对lscc诊断效能的初步验证

一、实验对象

本研究纳入2015年6月～2017年6月江苏省人民医院75例经who病理组织学确诊的初诊lscc患者。有其他肿瘤或急性感染的lscc患者被排除。患者中男性45例，女性30例。同时纳入75例江苏省人民医院健康体检中心进行体检的年龄、性别相匹配的健康人作为对照，其中男性45例，女性30例，年龄与lscc患者无统计学差异。

二、实验方法

1、血浆收集

采集静脉血2ml置于经乙二胺四乙酸二钾处理的抗凝管中，抗凝处理后分装到2ml无酶离心管中，4℃条件下1600×g离心10min，将上清液转移到另一个新的2ml无酶离心管中，4℃条件下16000×g再次离心10min，吸取上层血浆转移到新的2ml无酶离心管中，即为处理好的血浆标本，于-80℃冻存备用。二次离心后即可将血浆中的细胞碎片等物质除去，离心过程中使用的移液器和离心管均不含dna酶和rna酶，标本处理均在离体3h内完成。

2、总rna提取及cdna合成

提取试剂为德国qiagen公司的血清/血浆mirna提取试剂(mirneasyserum/plasma)试剂盒。按照说明书，取解冻的血浆上清液200μl，加入1000μl裂解液(qiazollysisreagent)，剧烈震荡后室温下(15℃～25℃)放置5min；加入3.5μlqiagen公司的血清/血浆纯化试剂盒外参(mirneasyserum/plasmaspike-incontrol)(cel-39)作为外参，混匀，再加200μl氯仿，剧烈摇动15s，室温保存2～3min；4℃、12000g离心15min；吸上层无色水相，移入另一ep管中(约400μl)；加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀；吸700μl样品到抽提微量rna(rneasyminelute)离心柱中；10000g，室温离心15s，弃去收集管中的液体；分别用700μl缓冲液rwt、缓冲液rpe、80％乙醇洗脱后，总rna结合到膜上，苯酚和其他污染物被有效洗去；最后加入14μl无酶水将离心柱上的rna洗脱下来。使用分光光度计检测评价所提取总rna的质量，总rna的od260/od280值在1.8～2.1之间为合格的rna样品，说明样品rna制备较纯，无蛋白质污染，样品可进行下一步操作。

取12μl提取的合格的rna以qiagen公司的mirna反转录(miscriptrt试剂盒)进行反转录，该试剂采用poly(a)聚合酶多腺苷酰化成熟mirna，并利用反转录酶及oligo-dt引物扩增将其转变为cdna。按照试剂盒说明操作如下：加入2μlmirna反转录混合物(miscriptreversetranscriptasemix)(一种经优化的poly(a)聚合酶和反转录酶混合物)、2μlmirna反转录核酸混合物(10×miscriptnucleicsmix)(包括dntps、ratp、oligo-dt引物等)、4μl缓冲液(5×miscripthispecbuffer)，然后进行反转录，反应体积为20μl，反应条件为37℃60min，95℃5min。反转录中加样过程置于冰上操作。反转录反应完成后cdna用无酶水以1:10稀释后置-20℃保存。

3、rt-pcr检测mirna

以qiagen公司mirna定量(miscriptsybrgreenpcr)试剂盒，按照25μl反应体系进行rt-pcr检测。检测体系包括：2.5μl稀释后的cdna、2.5μl特异正向引物(序列如下，由上海生工生物工程有限公司合成；外参引物包含在qiagen公司的提取试剂血清/血浆mirna提取试剂(mirneasyserum/plasma)试剂盒中、2.5μl10×miscriptuniversalprimer(通用反向引物)、12.5μlmirna定量混合物(2×quantitectsybrgreenpcrmastermix)、5μl无酶水。rt-pcr条件为：95℃15min后，94℃15s，55℃30s，70℃30s，40个循环。同时做溶解曲线是判断基因扩增的特异性。扩增采用abi7500仪器进行。所有样品做3复孔，对测量的ct值取平均值，排除掉ct值大于35的数据。根据待测标本的ct值，以cel-mirna-39作为外参，用2^-δδct法对目的基因进行相对定量。最后，扩增结束后将扩增产物置于1％的琼脂糖凝胶中以110v电压电泳30min，凝胶成像系统做电泳结果分析。

hsa-mir-544a特异正向引物：5'-uaugucuugcacuccuccgugg-3'(seq.no.1)

hsa-mir-4726特异正向引物：5'-uucugucaccuuugcucccuua-3'(seq.no.2)

hsa-mir-135a-5p特异正向引物：5'-cgtctcaggagtgtgcggactgt-3'(seq.no.3)

hsa-mir-2278特异正向引物：5'-tcagtguctgatgagtgcgcaagc-3'(seq.no.4)

hsa-mir-636特异正向引物：5'-ccagggtgtgctggagcgtcaccg-3'(seq.no.5)

hsa-mir-597-5p特异正向引物：5'-tgggtcgtggcaacagtcggatga-3'(seq.no.6)

内参cel-mirna-39特异正向引物：5'-ucaccggguguaaaucagcu-3'(seq.no.7)

通用反向引物：5'-gctccgcgattggagtggtgt-3'(seq.no.8)

4、统计学方法

采用spss17.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以(均值±标准偏差)表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以m(qr)表示，两组间比较采用mann-whitneyu检验；计数资料比较采用fisher's确切概率法；采用二元logistic回归分析计算mirna标志物联合的logistic回归方程；绘制mirna标志物单个及其联合诊断lscc的受试者工作特征曲线(roc曲线)，计算roc曲线下面积(auc)、灵敏度、特异度、约登指数。以p＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-135a-5p在lscc患者与健康人血浆中的表达水平比较及联合诊断lscc的roc曲线

lscc患者组血浆中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726表达水平低于健康人组，lscc患者组血浆中hsa-mir-135a-5p表达水平高于健康人组，差异有统计学意义(p＜0.05)。

以lscc为因变量(赋值：是＝1，否＝0)，hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-135a-5p为自变量(连续型变量)，进行二元logistic回归分析，结果显示，logit(p)＝－0.177+23.605×hsa-mir-135a-5p－34.283×hsa-mir-4726－49.659×hsa-mir-544a，其诊断lscc的auc为0.951，截断值为0.125。roc曲线如图1所示。

2、hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-2278在lscc患者与健康人血浆中的表达水平比较及联合诊断lscc的roc曲线

lscc患者组血浆中hsa-mir-544a、hsa-mir-4726表达水平低于健康人组，lscc患者组血浆中hsa-mir-2278表达水平高于健康人组，差异有统计学意义(p＜0.05)。

以lscc为因变量(赋值：是＝1，否＝0)，hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-2278为自变量(连续型变量)，进行二元logistic回归分析，结果显示，logit(p)＝－0.086+27.052×hsa-mir-2278－37.187×hsa-mir-4726－52.052×hsa-mir-544a，其诊断lscc的auc为0.959，截断值为0.133。roc曲线如图2所示。

3、hsa-mir-544a、hsa-mir-636和hsa-mir-597-5p在lscc患者与健康人血浆中的表达水平比较及联合诊断lscc的roc曲线

lscc患者组血浆中hsa-mir-544a、hsa-mir-636表达水平低于健康人组，lscc患者组血浆中hsa-mir-597-5p表达水平高于健康人组，差异有统计学意义(p＜0.05)。

以lscc为因变量(赋值：是＝1，否＝0)，hsa-mir-544a、hsa-mir-636和hsa-mir-597-5p为自变量(连续型变量)，进行二元logistic回归分析，结果显示，logit(p)＝－0.195+32.045×hsa-mir-597-5p－40.383×hsa-mir-636－55.605×hsa-mir-544a，其诊断lscc的auc为0.962，截断值为0.154。roc曲线如图3所示。

hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-135a-5p联合或hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-2278联合或hsa-mir-544a、hsa-mir-636和hsa-mir-597-5p联合诊断lscc的roc曲线下面积均在0.9以上，诊断效能高，显著优于hsa-mir-544a(auc为0.698)、hsa-mir-4726(auc为0.703)、hsa-mir-135a-5p(auc为0.686)、hsa-mir-2278(auc为0.655)、hsa-mir-636(auc为0.695)、hsa-mir-597-5p(auc为0.676)单独诊断效能。

实施例2：mirna标志物对lscc诊断效能的进一步多中心验证

一、实验对象

本研究纳入2015年6月～2017年6月西南医科大学附属医院48例经who病理组织学确诊的初诊lscc患者。有其他肿瘤或急性感染的lscc患者被排除。患者中男性30例，女性18例。同时纳入48例西南医科大学附属医院健康体检中心进行体检的年龄、性别相匹配的健康人作为对照，其中男性30例，女性18例，年龄与lscc患者无统计学差异。

二、实验方法和结果

1、血浆收集

采集静脉血2ml置于经乙二胺四乙酸二钾处理的抗凝管中，抗凝处理后分装到2ml无酶离心管中，4℃条件下1600×g离心10min，将上清液转移到另一个新的2ml无酶离心管中，4℃条件下16000×g再次离心10min，吸取上层血浆转移到新的2ml无酶离心管中，即为处理好的血浆标本，于-80℃冻存备用。二次离心后即可将血浆中的细胞碎片等物质除去，离心过程中使用的移液器和离心管均不含dna酶和rna酶，标本处理均在离体3h内完成。

2、总rna提取及cdna合成

提取试剂为德国qiagen公司的血清/血浆mirna提取试剂(mirneasyserum/plasma)试剂盒。按照说明书，取解冻的血浆上清液200μl，加入1000μl裂解液(qiazollysisreagent)，剧烈震荡后室温下(15℃～25℃)放置5min；加入3.5μlqiagen公司的血清/血浆纯化试剂盒外参(mirneasyserum/plasmaspike-incontrol)(cel-39)作为外参，混匀，再加200μl氯仿，剧烈摇动15s，室温保存2～3min；4℃、12000g离心15min；吸上层无色水相，移入另一ep管中(约400μl)；加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀；吸700μl样品到抽提微量rna(rneasyminelute)离心柱中；10000g，室温离心15s，弃去收集管中的液体；分别用700μl缓冲液rwt、缓冲液rpe、80％乙醇洗脱后，总rna结合到膜上，苯酚和其他污染物被有效洗去；最后加入14μl无酶水将离心柱上的rna洗脱下来。使用分光光度计检测评价所提取总rna的质量，总rna的od260/od280值在1.8～2.1之间为合格的rna样品，说明样品rna制备较纯，无蛋白质污染，样品可进行下一步操作。

取12μl提取的合格的rna以qiagen公司的mirna反转录(miscriptrt试剂盒)进行反转录，该试剂采用poly(a)聚合酶多腺苷酰化成熟mirna，并利用反转录酶及oligo-dt引物扩增将其转变为cdna。按照试剂盒说明操作如下：加入2μlmirna反转录混合物(miscriptreversetranscriptasemix)(一种经优化的poly(a)聚合酶和反转录酶混合物)、2μlmirna反转录核酸混合物(10×miscriptnucleicsmix)(包括dntps、ratp、oligo-dt引物等)、4μl缓冲液(5×miscripthispecbuffer)，然后进行反转录，反应体积为20μl，反应条件为37℃60min，95℃5min。反转录中加样过程置于冰上操作。反转录反应完成后cdna用无酶水以1:10稀释后置-20℃保存。

3、rt-pcr检测mirna

以qiagen公司mirna定量(miscriptsybrgreenpcr)试剂盒，按照25μl反应体系进行rt-pcr检测。检测体系包括：2.5μl稀释后的cdna、2.5μl特异正向引物(序列如下，由上海生工生物工程有限公司合成；外参引物包含在qiagen公司的提取试剂血清/血浆mirna提取试剂(mirneasyserum/plasma)试剂盒中、2.5μl10×miscriptuniversalprimer(通用反向引物)、12.5μlmirna定量混合物(2×quantitectsybrgreenpcrmastermix)、5μl无酶水。rt-pcr条件为：95℃15min后，94℃15s，55℃30s，70℃30s，40个循环。同时做溶解曲线是判断基因扩增的特异性。扩增采用abi7500仪器进行。所有样品做3复孔，对测量的ct值取平均值，排除掉ct值大于35的数据。根据待测标本的ct值，以cel-mirna-39作为外参，用2^-δδct法对目的基因进行相对定量。最后，扩增结束后将扩增产物置于1％的琼脂糖凝胶中以110v电压电泳30min，凝胶成像系统做电泳结果分析。

hsa-mir-544a特异正向引物：5'-uaugucuugcacuccuccgugg-3'(seq.no.1)

hsa-mir-4726特异正向引物：5'-uucugucaccuuugcucccuua-3'(seq.no.2)

hsa-mir-135a-5p特异正向引物：5'-cgtctcaggagtgtgcggactgt-3'(seq.no.3)

hsa-mir-2278特异正向引物：5'-tcagtguctgatgagtgcgcaagc-3'(seq.no.4)

hsa-mir-636特异正向引物：5'-ccagggtgtgctggagcgtcaccg-3'(seq.no.5)

hsa-mir-597-5p特异正向引物：5'-tgggtcgtggcaacagtcggatga-3'(seq.no.6)

内参cel-mirna-39特异正向引物：5'-ucaccggguguaaaucagcu-3'(seq.no.7)

通用反向引物：5'-gctccgcgattggagtggtgt-3'(seq.no.8)

4、数据处理与结果

分别测定各血浆样本中目的mirna标志物的相对表达量，然后代入对应的logit(p)方程，高于截断值的预测为lscc患者，低于截断值的预测为健康人，然后用预测正确的例数除以总例数，计算得到预测准确率。结果：hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-135a-5p联合预测的准确率为91.67％(88/96)；hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-2278联合预测的准确率为90.63％(87/96)；hsa-mir-544a、hsa-mir-636和hsa-mir-597-5p联合预测的准确率为94.79％(91/96)。

实施例3：lscc诊断试剂盒

lscc诊断试剂盒中可以含有检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-135a-5p，或检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-2278，或检测hsa-mir-544a、hsa-mir-636和hsa-mir-597-5p的引物，还含有内参及rt-pcr所需的酶和试剂。

检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-135a-5p，或检测hsa-mir-544a、hsa-mir-4726和hsa-mir-2278，或检测hsa-mir-544a、hsa-mir-636和hsa-mir-597-5p的引物序列及内参引物序列如下：

hsa-mir-544a特异正向引物：5'-uaugucuugcacuccuccgugg-3'(seq.no.1)

hsa-mir-4726特异正向引物：5'-uucugucaccuuugcucccuua-3'(seq.no.2)

hsa-mir-135a-5p特异正向引物：5'-cgtctcaggagtgtgcggactgt-3'(seq.no.3)

hsa-mir-2278特异正向引物：5'-tcagtguctgatgagtgcgcaagc-3'(seq.no.4)

hsa-mir-636特异正向引物：5'-ccagggtgtgctggagcgtcaccg-3'(seq.no.5)

hsa-mir-597-5p特异正向引物：5'-tgggtcgtggcaacagtcggatga-3'(seq.no.6)

内参cel-mirna-39特异正向引物：5'-ucaccggguguaaaucagcu-3'(seq.no.7)

通用反向引物：5'-gctccgcgattggagtggtgt-3'(seq.no.8)。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于上述具体实施例。

序列表

<110>邱长友

<120>一种早期诊断喉鳞状细胞癌的血浆基因检测试剂盒

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

uaugucuugcacuccuccgugg22

<210>2

<211>22

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

uucugucaccuuugcucccuua22

<210>3

<211>23

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgtctcaggagtgtgcggactgt23

<210>4

<211>24

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcagtguctgatgagtgcgcaagc24

<210>5

<211>24

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ccagggtgtgctggagcgtcaccg24

<210>6

<211>24

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tgggtcgtggcaacagtcggatga24

<210>7

<211>20

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ucaccggguguaaaucagcu20

<210>8

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gctccgcgattggagtggtgt21