用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的引物、探针、设备及方法与流程

本发明涉及生物技术，具体涉及一种用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的引物、探针、设备及方法。
背景技术：
骨巨细胞瘤是常见的侵袭性原发骨肿瘤，其高发于青壮年，而且复发率高，5-50％的患者手术后会复发(salernom,avnets,alberghinim,giuntia,baldinin.histogeneticcharacterizationofgiantcelltumorofbone.clinorthoprelatres2008；466:2081-91)。2013年，behjatis等在naturegenetics上报道骨巨细胞瘤和软骨细胞瘤分别是由h3f3a和h3f3b基因的不同突变造成的(behjatis,tarpeyps,presneaun,etal.distincth3f3aandh3f3bdrivermutationsdefinechondroblastomaandgiantcelltumorofbone.naturegenetics2013；45:1479-82)。另外，据文献(presneaun,baumhoerd,behjatis,etal.diagnosticvalueofh3f3amutationsingiantcelltumourofbonecomparedtoosteoclast-richmimics.jpatholclinres2015；1:113-23)报道，92％的骨巨细胞瘤(49/53)由h3f3ag34w突变导致，而95％(73/77)的软骨母细胞瘤由h3f3bk36m突变导致。另外一项研究(clevenah,hockers,briaire-debruijni,szuhaik,cleton-jansenam,boveejv.mutationanalysisofh3f3aandh3f3basadiagnostictoolforgiantcelltumorofboneandchondroblastoma.amjsurgpathol2015；39:1576-83)也证实了93％(85/91)的骨巨细胞瘤是由h3f3ag34w突变导致。这两项研究中均采用全基因组测序或者全外显子组测序的技术，高通量测序技术能够同时对人体的所有基因进行大规模平行测序，适用于未知基因突变的寻找。但是，这些高通量测序技术成本高，耗时耗力，数据分析周期长，难以应用于临床检测，特别是对于骨巨细胞瘤这种已经明确了的突变基因和位点的疾病。随后的另一项研究(pekind,skhiriy,baretjc,etal.quantitativeandsensitivedetectionofraremutationsusingdroplet-basedmicrofluidics.labonachip2011；11:2156-66)采用了一代sanger测序技术对骨巨细胞瘤进行h3f3a突变分析，其突变检出率却较低(69％)。分析其原因可能主要在于：1.骨巨细胞瘤由肿瘤细胞和大量反应细胞密切混合在一起构成，在肿瘤细胞比例较低时就难以用一代sanger测序技术检出；2.sanger测序是针对所有dna样品的同时测序，没法实现对单个dna分子的并行测序，因此测序结果经常出现双峰、杂峰等，难以判读结果；3.引物设计可能不太恰当。技术实现要素：本发明针对现有技术的上述缺陷，提供一种用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的引物、探针、设备及方法，其可检测到极低含量的突变；检测成本低，适宜于临床开展；相较于二代高通量测序，本发明特异性针对h3f3ag34w位点的检测，特异性高，成本较低。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一方面，提供一种用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的引物及探针，其包括如下引物和探针：上游引物seqidno：1：5’-taaagcacccaggaagcaac-3’；下游引物seqidno：2：5’-caagagagactttgtcccattttt-3’，；野生型探针seqidno：3:5’-ttcacccctccagtaga-3’；突变型探针seqidno：4:5’-ttcacccatccagtaga-3；或包括：与所述上游引物具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有60％以上同源性的核苷酸序列。优选的，所述g34w位点突变为缺失/插入/替换突变。优选的，所述野生型探针和突变型探针均包括荧光基团以及淬灭基团。优选的，所述荧光基团选自fam、vic、hex、cy3以及cy5中的一种；所述淬灭基团选自bqh1、bqh2、mgb以及tamara中的一种。优选的，所述引物和探针包括：与所述上游引物具有80％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有80％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有80％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有80％以上同源性的核苷酸序列。优选的，所述引物和探针包括：与所述上游引物具有90％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有90％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有90％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有90％以上同源性的核苷酸序列。另一方面，还提供一种用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的试剂盒，其包括上述引物和探针。另一方面，还提供一种用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的方法，其包括如下步骤：s1、准备如权利要求1-6任一项所述的上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针；s2、从待测样品中提取待检测的dna模板；s3、配制对待检测的dna模板进行荧光pcr扩增的反应体系，并进行pcr扩增，且所述pcr扩增的反应条件为：92-96℃预变性5min，共1个循环；92-96℃变性8-15s，共50个循环；55-65℃延伸40s，共50个循环；98℃10min，共1个循环；以及s4、检测荧光pcr扩增过程后的荧光信号变化，并根据所述荧光信号判断是否发生有基因突变，和/或，确定发生基因突变的dna模板的数量和/或含量。优选的，所述待测样品包括：手术切除组织、石蜡包埋组织切片、穿刺组织、胸水、全血、外周血、口腔黏膜、血浆以及血清中的一种或几种。另一方面，还提供一种用于检测基因突变的设备，其包括：pcr反应体系制备单元，其用于将上述上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针和待检测的dna模板、pcr预混液进行混合，以制备数字pcr混合液；数字pcr反应单元，其用于利用所述数字pcr混合液制作pcr微反应液滴，且针对所述pcr微反应液滴进行pcr扩增；以及数据处理单元，其用于对pcr扩增产物的信号进行收集，并根据所述信号判断是否发生有基因突变，和/或，确定发生基因突变的dna模板的数量和/或含量。本发明技术方案的有益效果在于：1)灵敏度高，可检测到极低含量的突变，避免一代测序中容易误诊漏诊的缺陷；2)检测成本低，适宜于临床开展；相较于二代高通量测序，本发明特异性针对h3f3ag34w位点的检测，特异性高，成本较低。附图说明下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：图1a是实施例三中通过sanger测序法检测野生型g34w位点结果图；图1b是实施例三中通过数字pcr法检测野生型g34w位点结果图；图2a是实施例三中通过sanger测序法检测突变型g34w位点结果图；图2b是实施例三中通过数字pcr法检测突变型g34w位点结果图；图3a是实施例三中肿瘤细胞突变比例为3.7％时，通过sanger测序法检测g34w位点突变的结果图；图3b是实施例三中肿瘤细胞突变比例为3.7％时，通过数字pcr法检测g34w位点突变的结果图；图4a是实施例三中肿瘤细胞突变比例为9.7％时，通过sanger测序法检测g34w位点突变的结果图；图4b是实施例三中肿瘤细胞突变比例为9.7％时，通过数字pcr法检测g34w位点突变的结果图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案以及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。实施例一：本实施例提供了一种用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的引物及探针，其包括如下两组引物和两组探针：上游引物seqidno：1：5’-taaagcacccaggaagcaac-3’；下游引物seqidno：2：5’-caagagagactttgtcccattttt-3’；野生型探针seqidno：3:5’-ttcacccctccagtaga-3’；突变型探针seqidno：4:5’-ttcacccatccagtaga-3；或包括：与所述上游引物具有60％以上、优选80％以上、更优选90％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有60％以上、优选80％以上、更优选90％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有60％以上、优选80％以上、更优选90％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有60％以上、优选80％以上、更优选90％以上同源性的核苷酸序列；并且，所述人h3f3a基因g34w位点的突变为缺失/插入/替换突变，所述上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针中的一项或几项通过primer3.0软件设计获得。当基因检测区域内未发生突变时，所述野生型探针可与通过所述上游引物、下游引物扩增获得的基因检测区域结合；当基因检测区域内发生突变时，所述突变型探针可与通过所述上游引物、下游引物扩增获得的基因检测区域结合，并通过结算结合的野生型探针与结合的突变型探针的比例来确定发生基因突变的比例。具体实施时，所述野生型探针和突变型探针均包括荧光基团以及淬灭基团，其中，所述荧光基团选自fam、vic、hex、cy3以及cy5中的一种；所述淬灭基团选自bqh1、bqh2、mgb以及tamara中的一种。实施例二：本实施例提供可一种用于检测待测样品中、人h3f3a基因g34w位点突变的试剂盒，其包括如实施例一所述的引物和探针。其中，通过所述上游引物、下游引物扩增获得的片段长为131bp，引物设计简单，由此适用于小片段dna样本的扩增，且无需标准品或内参参照，使用流程简便、成本低；所述待测样品包括：手术切除组织、石蜡包埋组织切片、穿刺组织、胸水、全血、外周血、口腔黏膜、血浆以及血清中的一种或几种。实施例三：本实施例提供一种用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的方法，其包括如下步骤：s1、准备如实施例一所述的上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针；s2、采用qiagen公司的ffpe样本dna提取试剂盒从待测样品中提取待检测的dna模板，且提取的dna模板通过nanodrop1000(thermofisher,inc)进行浓度测定；其中，所述待测样品包括：手术切除组织、石蜡包埋组织切片、穿刺组织、胸水、全血、外周血、口腔黏膜、血浆以及血清中的一种或几种；s3、配制对待检测的dna模板进行荧光pcr扩增的反应体系，将配制的pcr反应体系转移至8连管后，放入raindancesouce微滴制备仪等数字pcr反应平台中进行微滴制备，制备完成后，将8连管取出封口，置于proflextmpcr仪中进行pcr扩增，以及通过所述野生型探针以及突变型探针与扩增产物进行杂交；其中，所述反应体系包括：如实施例一所述的上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针、酶、dntp、预混液、微滴稳定剂等，其具体的反应体系组成如表1：表1pcr扩增反应体系试剂体积(μl)taqpath2×pcr预混液12.5上游引物(10μm)1.25下游引物(10μm)1.25野生型探针(10μm)0.5突变型探针(10μm)0.5dna模板200ng微滴稳定剂(25×)1h2o补至总体积25μl所述pcr扩增的反应条件为：92-96℃(优选为95℃)预变性5min，共1个循环；92-96℃(优选为95℃)变性8-15s(优选为10s)，共50个循环；55-65℃(优选为60℃)延伸40s，共50个循环；98℃10min，共1个循环；整个扩增过程中，每一阶段的升降温速率为0.5℃/s；以及s4、pcr扩增完成后，将8连管取出置于检测装置中进行荧光信号检测，并根据所述荧光信号判断是否发生有基因突变，和/或，确定发生基因突变的dna模板的数量和/或含量，优选的，所述检测装置包括raindancesence。数字pcr为一种核酸分子绝对定量方法，其采用微乳滴制备的方法，可将待测dna分子分散到数百万个微滴中，从而保证一个微滴中最多有1个dna模板分子，由此可在进行pcr扩增后，对微滴的荧光信号逐个分析统计，其根据相对比例和反应器的体积推算出原始溶液中的核酸浓度，以及根据阴性反应的比例对样品中的目标分子数目进行绝对计数，而不必参照标准品或内参，由此具有高灵敏度、所需样本量少等特点，尤其适用于临床珍贵样本(包括穿刺样本、胸腹水、外周血等)中目标基因的微量检测需求。本实施例中还采用数字pcr方法和现有的一代sanger测序方法对同一样品分别进行检测，其检测结果见图1a-4b。从图1a-1b、2a-2b中可以看出，在均为野生型，无g34w突变以及均有g34w突变的情况下，本实施中的检测方法与sanger测序方法的定性检测结果100％一致；而sanger测序只能检测突变比例10％以上的基因突变，而数字pcr能检测到0.01％以下的突变，因此，在肿瘤细胞突变比例较低(如分别为3.7％和9.7％时)时，如图3a、4a所示，sanger测序结果突变峰值较低，无法判断是否是真正的突变，其存在极大的可能产生漏诊、错诊，而如图3b、4b所示，数字pcr方法能检测出明显的g34w突变，且是绝对定量，即，可以定量计算出肿瘤细胞所占的比例，由此可大大提高了突变检测的灵敏度和结果判读的准确性，能够避免漏诊、错诊的发生，尤其适用于监测肿瘤进展和对药物治疗的效果。实施例四：本实施例提供了一种用于实现上述实施例三中的检测方法的检测基因突变的设备，其包括：pcr反应体系制备单元，其用于将如实施例一中所述的上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针和待检测的dna模板、pcr预混液进行混合，以制备数字pcr混合液；数字pcr反应单元，其用于利用所述数字pcr混合液制作pcr微反应液滴，且对所述pcr微反应液滴进行pcr扩增；其中，制作pcr微反应液滴的方法包括：将所述数字pcr混合液加入到微滴发生器中，生成至少10000个pcr微反应液滴；以及数据处理单元，其用于对pcr扩增产物的信号进行收集，并根据所述信号判断是否发生有基因突变，和/或，通过相关软件(如quantasoft)确定发生基因突变的dna模板的数量和/或含量。综上所述，本发明中，一个反应中仅包含一对引物以及一对探针即可高效检测出人h3f3a基因g34w位点的突变，且引物、探针设计、使用简单，不需要标准品或内参影响，检测成本低；所需dna模板极小，有利于珍贵微量样本的检测；可检测到极低含量的突变，避免一代测序中容易误诊漏诊的缺陷。上述实施例一至四中的技术特征可进行任意组合，且组合获得的技术方案均属于本发明的保护范围。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>北京大学<120>用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的引物、探针、设备及方法<141>2018-07-03<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>1taaagcacccaggaagcaac20<210>2<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>2caagagagactttgtcccattttt24<210>3<211>17<212>dna<213>artificialsequence<400>3ttcacccctccagtaga17<210>4<211>17<212>dna<213>artificialsequence<400>4ttcacccatccagtaga17当前第1页12