作为癌症生物标志物的肿瘤抑制基因REC8的制作方法

本申请要求于2017年5月19日提交的美国专利申请第15/600,366号的优先权，为所有目的将其内容整体并入本文。
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胃癌(gastriccancer)，也称为胃癌(stomachcancer)，是全世界第四大最常见癌症，每年诊断大约1,000,000例。这是一种具有很高死亡率的疾病(每年约800,000的死亡数)，使其成为继肺癌后全世界第二大最常见癌症死亡原因。在男性中以及在发展中国家(包括许多亚洲国家)，胃癌发病率明显较高。胃癌在其早期阶段通常保持无症状或仅表现出非特异性症状，因此在许多情况下在疾病达到晚期阶段之前没有做出诊断。这导致普遍地不良预后：在80-90％的被诊断为胃癌的个体中发生转移，在早期被诊断的那些人中六个月的存活率为65％，以及在晚期被诊断的那些人中六个月的存活率低于15％。由于胃癌的普遍存在及其对患者预期寿命的严重影响，迫切需要新的和更有效的方法来诊断、监测和治疗胃癌。本发明满足了这个需求和其他相关的需求。发明概述为了阐明rec8在胃癌中的表观遗传改变和生物学功能，本申请发明人使用启动子甲基化阵列发现了在胃癌中rec8被倾向性甲基化。通过启动子甲基化，rec8在100％(3/3)的ebv阳性和80％(8/10)的ebv阴性胃癌细胞系中是下调的，但通过去甲基化处理可以恢复表达。在人原发性胃肿瘤中rec8的蛋白表达显著低于相邻的非肿瘤组织中rec8的蛋白表达。在癌症基因组图谱研究的223个胃样品中，观察到rec8的甲基化和mrna表达之间的负相关性(r＝-0.7018，p<0.001)。如通过亚硫酸氢盐基因组测序(77.6[69.3-80.5]对51.4[39.5-62.3]，中位数[四分位距]；p<0.001)所示，ebv阳性的胃肿瘤中rec8启动子的甲基化水平(％)显著高于ebv阴性的胃肿瘤中rec8启动子的甲基化水平(％)；在两种亚型的肿瘤中的甲基化水平显著高于正常胃组织中的甲基化水平(14.8[4.2-24.0])(两者均p<0.001)。多变量分析显示，rec8甲基化是胃癌患者低生存率的独立因素(hr＝1.68，p<0.05)。rec8表达显著抑制细胞活力、克隆形成性和细胞周期进程；它诱导细胞凋亡并抑制ags-ebv(ebv阳性)和bgc823(ebv阴性)胃癌细胞的迁移，并且它抑制裸鼠中的致肿瘤性。相反，在永生化的胃上皮细胞ges-1细胞中敲低rec8显著增加细胞活力，克隆形成性和迁移能力。rec8的肿瘤抑制作用至少部分通过下调参与细胞生长的基因(g6pd、slc2a1、nol3、mcm2、snai1和snai2)以及上调细胞凋亡/迁移抑制因子(gadd45g和ldha)和肿瘤抑制因子(pinx1、igfbp3和ets2)来介导。总之，rec8是一种新型肿瘤抑制因子，其在胃癌(特别是在ebv相关亚型)中通常通过启动子甲基化被下调。rec8的启动子甲基化是胃癌患者缩短的生存期独立危险因素。因此，一方面，本发明提供了用于检测rec8基因甲基化状态的灵敏和非侵入性的方法，其可以用作快速评估各种类型癌症(包括胃癌、肝癌和结肠癌等)的存在或风险的第一步，因此可以早期检测这些潜在的致命疾病。所述方法包括以下步骤：(1)用亚硫酸氢盐处理从取自对象的样品获得的基因组dna；(2)使用包含seqidno:11或12的核苷酸序列的引物进行扩增反应，如pcr，特别是定量pcr(qpcr)，以扩增来自步骤(1)的经处理的基因组dna；(3)分析来自步骤(2)的扩增反应的扩增子或产物，以确定rec8基因的甲基化状态。在一些实施方案中，用于该方法的pcr(特别是qpcr)中的引物对包括第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，所述第一寡核苷酸引物包含如seqidno:11所示的核苷酸序列或由其组成，所述第二寡核苷酸引物包含如seqidno:12所示的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，样品是血液样品(如血浆或血清样品)，或者包括一些或全部血细胞的全血样品的级分。在一些实施方案中，样品可以是组织样品(如取自测试对象的胃、结肠或肝脏的活检组织)、粪便样品或尿液样品。在一些实施方案中，在此方法中分析其样品的对象是被怀疑患有癌症(包括但不限于胃癌、肝癌或结肠癌)或处于稍后发展成癌症的风险中(例如由于强大的家族史)的人类个体。尽管通常分析相应的组织样品(例如，使用肝活组织检查来测试肝癌风险或存在，或者使用胃活组织检查来测试胃癌风险或存在)，但是血液样品(如血浆或血清或血细胞样品)由于其异常高水平的灵敏度和特异性因此也可用于此方法。在一些实施方案中，步骤(3)中的分析可以包括对来自步骤(2)的扩增子进行测序以确定一级多核苷酸序列，从而确定哪些cpg被甲基化，以及哪些cpg未被甲基化。在一些实施方案中，在步骤(3)中使用探针，其被设计为仅与甲基化形式的扩增子特异性杂交(甲基化探针)，例如包含如seqidno:13所示的序列或由其组成的探针。在一些实施方案中，在步骤(3)中使用探针，其被设计为仅与非甲基化形式的扩增子特异性杂交(非甲基化探针)，例如包含如seqidnono:14所示的序列或由其组成的探针。虽然这些探针中的每一种通常用可检测部分标记以便于检测和鉴定，但是甲基化探针和非甲基化探针通常用两种不同的标记物标记，使得可以将它们用于相同的反应混合物中以检测可能存在于相同反应混合物中的两种不同形式(甲基化的和非甲基化的)的扩增子。在实施例中描述了示例性标记物。在此检测方法的另一方面，提供了用于快速且可靠地确定rec8基因甲基化状态的试剂盒。所述试剂盒包含：(1)包含seqidno:11的核苷酸序列的寡核苷酸引物；和(2)包含seqidno:12的核苷酸序列的寡核苷酸引物。在又一方面，提供了(1)包含seqidno:11的核苷酸序列的寡核苷酸引物；和(2)包含seqidno:12的核苷酸序列的寡核苷酸引物在制备用于快速且可靠地确定rec8基因甲基化状态的试剂盒中的用途。可以将两个引物保存在同一个容器中，或者可以将它们保存在两个独立的容器中。在一些情况下，第一引物和第二引物的序列分别由seqidno:11和seqidno:12组成。任选地，在试剂盒中可以包括进行扩增反应(例如pcr)所必需的试剂，诸如dna聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸或dntp，以及扩增反应缓冲液。而且，在试剂盒中可以包括含有亚硫酸氢盐的组合物。在一些实施方案中，试剂盒还包含甲基化探针以在亚硫酸氢盐处理和扩增反应(如pcr)之后特异性检测rec8基因组序列的甲基化形式的存在。示例性的甲基化探针包含如seqidno:13所示的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，试剂盒还包含非甲基化探针以在亚硫酸氢盐转化和扩增反应(如pcr)后特异性检测rec8基因组序列的未甲基化形式的存在。示例性的非甲基化探针包含如seqidno:14所示的核苷酸序列或由其组成。在一具体的实施方案中，试剂盒包括含有seqidno:11的引物、seqidno:12的引物、seqidno:13的探针和seqidno:14的探针的四个独立的容器。任选地，试剂盒包括指导手册以指导用户正确使用用于检测rec8基因甲基化的试剂。附图说明图1.(a)典型的cpg岛存在于rec8的启动子区域。tss，转录起始位点。(b)通过在组织样品上的亚硫酸氢盐基因组测序(bgs)的定量显示，rec8的启动子甲基化水平在胃肿瘤组织中显著高于在非肿瘤胃组织中，很好地区分了肿瘤与非肿瘤组织，具有0.9866的roc曲线下面积。(c)hm450k甲基化阵列数据显示，探针cg06351481覆盖的位点在癌症基因组图谱(tcga)研究中所测试的398个胃肿瘤样品中以最高水平被甲基化。图2.用于定量rec8甲基化的新qpcr方法的性能。(a)使用针对引物-探针设计的具有一对通用引物和两种探针的双重策略，以靶向在hm450k甲基化阵列中被探针cg06351481覆盖的rec8的两个选定的cpg位点。(b&c)尽管可以从未转化的高浓度dna中扩增非特异性扩增子，但是qpcr不能检测到探针信号，而可以使用该qpcr方法通过两种不同的探针来区分从经亚硫酸氢盐修饰的dna(mdna)模板特异性扩增的甲基化的和未甲基化的等位基因。图3.用于rec8甲基化定量的新qpcr方法和常规bgs方法之间的良好相关性。通过混合由bgs确认的完全甲基化(me)的和完全非甲基化的(un)样品来制备标准模板。使用了两种甲基化评分计算方法，两种方法均显示与甲基化百分比呈正相关性，一种为对数的，另一种为线性的。图4.(a)使用新qpcr方法对胃癌细胞系中的rec8甲基化的定量显示，具有完全甲基化的rec8的细胞的rq评分>0.7，并且部分甲基化的snu1细胞和未甲基化的ges-1细胞的评分低。(b)qpcr扩增子的sanger测序确认了通过qpcr进行的定量。图5.(a)使用新qpcr方法对组织样品中rec8甲基化的定量证实，来自香港和北京群组的，在胃肿瘤组织中以显著高于相邻非肿瘤组织的水平甲基化rec8。(b)与来自非gc对象的胃粘膜相比，在来自胃癌(gc)患者的胃肿瘤和相邻非肿瘤组织中均以显著更高的水平甲基化rec8启动子。(c)通过新的qpcr方法定量的rec8启动子甲基化水平，很好地区分了胃肿瘤组织与非gc胃，具有0.9177的roc曲线下面积为(p<0.0001)。图6.使用新qpcr方法对胃肿瘤样品中的rec8甲基化的定量表明，rec8的高甲基化与胃癌患者中的缩短的生存期相关(左图)，这良好地证实了通过常规bgs方法的先前发现(右图)。图7.血浆中甲基化的rec8用作胃癌的非侵入性诊断生物标志物。(a)使用新qpcr方法的定量检测出在来自胃癌患者血浆样品中rec8甲基化水平显著高于在来自健康对照对象的血浆样品中rec8甲基化水平。(b)血浆中甲基化的rec8的水平显著区分了胃癌患者与对照对象，具有0.813的roc曲线下面积(p<0.001)。在使灵敏度和特异性的总和最大化的最佳截断值时，甲基化的rec8诊断胃癌患者的灵敏度为74.6％，特异性为81.8％。图8.来自tcga研究的hm450甲基化阵列数据(从网站：xena.ucsc.edu/下载)显示，除了胃癌(gc)之外，一些其他癌症类型的肿瘤组织在rec8启动子处被高度甲基化，而一些其他的以低水平被甲基化。显示的是代表性的癌症类型。crc，结肠直肠癌；lihc，肝癌；lgg，较低级别胶质瘤；pcpg，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤。序列说明seqidno:1为人rec8减数分裂重组蛋白的mrna的dna序列，其基因id为9985，genbank登录号为nm_005132.2。seqidno:2为rec8蛋白的编码序列。seqidno:3为基因组序列，其中hg38_dna范围＝chr14:24171853-24180257。seqidno:4为rec8蛋白序列，其genbank登录号为np_005123.2。seqidno:5为rec8bgs靶标的未转化的dna靶标序列，其中>hg38_dna范围＝chr14:24171913-24172144，5'填补＝0，3'填补＝0，链＝+，重复掩蔽＝无。seqidno:6为rec8bgs靶标的亚硫酸氢盐转化的靶标序列。seqidno:7为rec8甲基化qpcr靶标的未转化的dna靶标序列，其中>hg38_dna范围＝chr14:24172900-24173062，5'填补＝0，3'填补＝0，链＝+，重复掩蔽＝无。seqidno:8为rec8甲基化qpcr靶标的亚硫酸氢盐转化的靶标序列。seqidno:9为在rec8亚硫酸氢盐基因组测序(bgs)中使用的正向引物rec8-bgs-f的核苷酸序列。seqidno:10为在rec8亚硫酸氢盐基因组测序(bgs)中使用的反向引物rec8-bgs-r的核苷酸序列。seqidno:11为定量rec8甲基化的qpcr中使用的正向引物的核苷酸序列。seqidno:12为定量rec8甲基化的qpcr中使用的反向引物的核苷酸序列。seqidno:13为甲基化探针(m-探针)的核苷酸序列。seqidno:14为非甲基化探针(u-探针)的核苷酸序列。定义如本文所用，术语“rec8基因”或“rec8蛋白”是指人rec8基因或rec8蛋白的任何天然存在的变体或突变体、种间同源物或直向同源物、或人工变体。人野生型rec8mrna的dna序列如genbank登录号第nm_005132.2号(本文被提供为seqidno:1)中所示，其翻译成547个氨基酸的rec8蛋白(如genbank登录号第np_005123.2号中所示，本文被提供为seqidno:4)的编码序列(被提供为seqidno:2，seqidno:1中的所有大字母写部分，参见表5)。在本申请含义内的rec8蛋白，通常与人野生型rec8蛋白(例如seqidno:4)具有至少80％、或90％、或95％、或更高的序列同一性。在本公开中，术语“胃癌(gastriccancer)”和“胃癌(stomachcancer)”具有相同的含义，并且是指胃部或胃细胞的癌症。此类癌症可能是发生在胃内衬(粘膜或胃上皮)中的腺癌，并且可能位于胃的幽门、体部或贲门(下部、体部和上部)部分。“胃癌细胞”是具有胃癌特征的胃上皮细胞，并且其包含处于转化为癌细胞的早期阶段或倾向于转化为癌细胞的癌症前期细胞。此类细胞可以展现出癌性细胞的一种或多种表型性状特征。在本公开中，术语“或(者)”通常以其包括“和/或”的意义被使用，除非内容另有明确规定。如本文所用，术语“基因表达”被用于指dna转录以形成编码特定蛋白(例如，人rec8蛋白)的rna分子，或由多核苷酸序列所编码的蛋白的翻译。换句话说，在本公开中术语“基因表达水平”包含由目标基因(例如，人rec8基因)编码的mrna水平和蛋白水平两者。在本公开中，术语“生物样品”或“样品”包括组织切片(如活检样品和尸检样品)，以及用于组织学目的而取得的冷冻切片，或任何此类样品的加工形式。生物样品包括血液和血液级分或产品(例如血清、血浆、血小板、红血细胞等)、痰或唾液、淋巴和舌组织、培养的细胞(例如原代培养物、分离块和转化细胞)、粪便、尿液、胃活检组织等。生物样品通常获自真核生物，其可以是哺乳动物，可以是灵长类动物，并且可以是人类对象。在本公开中，术语“活组织检查/活检”是指为了诊断或预后评估而移除组织样品的过程，并且是指组织标本本身。可以将本领域已知的任何活检技术应用于本发明的诊断和预后方法。所应用的活检技术将取决于待评估的组织类型(例如，舌、结肠、前列腺、肾脏、膀胱、淋巴结、肝脏、骨髓、血细胞、胃组织等)和其他因素。代表性的活检技术包括但不限于：切除活检、切开活检、穿刺活检、手术活检和骨髓活检，并且可以包含内窥镜检查。各种活检技术对于本领域技术人员来说是众所周知的，他们将在它们之间进行选择并用最少的试验来实施它们。在本公开中，术语“分离的”核酸分子是指与通常与分离的核酸分子相关的其他核酸分子分离的核酸分子。因此，“分离的”核酸分子包括但不限于不含以下核苷酸序列的核酸分子(例如通过pcr或限制性内切酶消化产生的cdna或基因组dna片段)：其天然侧接于衍生出所述分离的核酸的生物体基因组中的核酸的一个或两个末端。通常将此类分离的核酸分子引入载体(例如克隆载体或表达载体)中，以便于操作或产生融合核酸分子。另外，分离的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，如重组核酸分子或合成的核酸分子。在例如含有限制性消化的基因组dna的核酸文库(例如cdna或基因组文库)或凝胶(例如琼脂糖或聚丙烯酰胺)内部的数百至数百万个其他核酸分子中存在的核酸分子，不是“分离的”核酸。术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及它们的聚合物。除非特别限制，否则该术语包含含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸类似的结合性质并以类似于天然存在的核苷酸的方式被新陈代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列也隐含地包含其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、单核苷酸多态性(snp)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(batzer等人,nucleicacidres.19：5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260：2605-2608(1985)；和rossolini等人,mol.cell.probes8：91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cdna和由基因编码的mrna互换使用。术语“基因”是指参与产生多肽链的dna片段；它包括在参与基因产物转录/翻译和转录/翻译调控的编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)，以及各个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。在本申请中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所用，术语包含任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及稍后被修饰的那些氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸)。为了本申请的目的，氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和r基团结合的碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的r基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。为了本申请的目的，氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。如wo01/12654中所公开的，氨基酸可以包括具有非天然存在的d-手性的那些氨基酸，其可改善包含一种或多种此类d-氨基酸的多肽的稳定性(例如半衰期)、生物利用度和其他特征。在一些情况下，治疗性多肽的一个或多个且可能全部氨基酸具有d-手性。在本文中氨基酸可以通过由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的公知的三字母符号或单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过它们通常被接受的单字母代码来提及。如本文所用，在描述两个或更多个多核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，术语“同一的”或百分比“同一性”是指当通过比较窗口或指定区域进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的，两个或更多个序列或子序列相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，用于本发明方法的变体rec8蛋白(例如用于治疗胃癌)，与参考序列(例如野生型人rec8蛋白)具有至少80％的序列同一性，优选85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。此类序列然后被认为是“基本上同一的”。关于多核苷酸序列，该定义还涉及测试序列的互补物。优选地，同一性存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地在长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上。为了序列比较，通常一个序列充当参考序列，并将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代性参数。然后该序列比较算法基于程序参数来计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。对于核酸和蛋白的序列比较，使用blast和blast2.0算法以及下面讨论的默认参数。如本文所用，“比较窗口”包括提及选自以下连续位置的数目中任何一个的片段：20至600个，通常约50至约200个，更通常约100至约150个的，其中可以将序列与具有相同数目连续位置的参考序列在这两个序列被最佳比对后进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。可以例如通过以下方法来进行用于比较的序列的最佳比对：smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法，needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比对算法，pearson&lipman,proc.nat’l.acad.sci.usa85:2444(1988)的搜索相似性方法，计算机化实现这些算法(wisconsingeneticssoftwarepackage,geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi中的gap、bestfit、fasta和tfasta)，或人工比对和目视检查(参见例如currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人编辑1995增刊))。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法实例是blast算法和blast2.0算法，其分别描述于altschul等人,(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschul等人(1977)nucleicacidsres.25:3389-3402。用于进行blast分析的软件可以在国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)的网站ncbi.nlm.nih.gov上公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为w的短字符来识别高评分序列对(hsp)，所述短字符在与数据库序列中相同长度的字符比对时匹配或满足一些正值阈值评分t。t被称为邻近词评分阈值(altschul等人,同上)。这些最初的邻近词命中作为启动搜索的种子，以找到含有它们的更长hsp。然后沿着每个序列在两个方向上延伸所述字符命中，直到可以增加累积比对评分。对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和n(错配残基的处罚评分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。当在以下情况下时，停止词命中在每个方向上的延伸：累计比对评分从其最大达到值下降x的量；由于一个或更多个负值评分残基比对的积累，累积评分为零或低于零；或者达到任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度。blastn程序(对于核苷酸序列)默认使用28的字长(w)，10的期望值(e)，m＝1，n＝-2，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用3的字长(w)，10的期望值(e)和blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff，proc.natl.acad.sci.usa89:10915(1989))。blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如karlin和altschul，proc.nat'l.acad.sci.usa90:5873-5787(1993))。由blast算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(p(n))，其提供了概率的指示，通过所述概率的指示两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为所述核酸与参考序列类似。如以下所述，两个核酸序列或多肽基本上同一的指示是，由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫交叉反应。因此，多肽通常基本上与第二多肽是同一的，例如，其中两个肽仅通过保守取代不同。如以下所述，两个核酸序列基本上同一的另一指示是，两个分子或它们的互补物在严格条件下彼此杂交。两个核酸序列基本上同一的又一指示是，可以使用相同的引物来扩增该序列。在本公开中，术语“严格杂交条件”和“高严格性”是指通常在核酸的复杂混合物中探针将与它的靶子序列杂交，但不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖的，并且在不同情况下将会不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指南，参见tijssen,techniquesinbiochemistryandmolecularbiology—hybridizationwithnucleicprobes，“overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays”(1993)，并且将很容易被本领域技术人员理解。通常，将严格条件选择为比在限定的离子强度ph下特定序列的热熔点(tm)低约5-10℃。tm是在平衡时50％的与靶标互补的探针与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、ph和核酸浓度下)(因为靶序列过量存在，在平衡时在tm，50％的探针被占用)。严格条件也可以通过加入去稳定剂(如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景杂交的两倍，优选是背景杂交的10倍。示例性的严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺，5×ssc和1％sds于42℃孵育，或5×ssc、1％sds于65℃孵育，并于65℃在0.2×ssc和0.1％sds中洗涤。如果它们编码的多肽基本上是同一的，则在严格条件下不相互杂交的核酸仍然是基本上同一的。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，就会发生这种情况。在这种情况下，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。示例性的“中等严格杂交条件”包括于37℃在40％甲酰胺、1mnacl、1％sds的缓冲液中杂交，并于45℃在1xssc中洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。普通技术人员将容易认识到，可以利用替代性杂交和洗涤条件来提供类似严格性条件。在许多参考文献中提供了确定杂交参数的其他指导方针，例如currentprotocolsinmolecularbiology，编辑ausubel等人。“表达盒”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有允许特定多核苷酸序列在宿主细胞中进行转录的一系列特定核酸元件。表达盒可以是质粒、病毒基因组或核酸片段的一部分。通常，表达盒包括可操作地连接至启动子的待转录的多核苷酸。在本文中“可操作地连接”是指两个或更多个遗传元件(如多核苷酸编码序列和启动子)被放置在允许元件(如指导编码序列转录的启动子)的适当生物功能的相对位置。可以存在于表达盒中的其他元件包括增强转录(例如增强子)和终止转录(例如终止子)的那些元件，以及赋予从表达盒产生的重组蛋白一定的结合亲和力或抗原性的那些元件。本文使用的术语“亚硫酸氢盐”包含所有类型的亚硫酸氢盐(如亚硫酸氢钠)，其能够化学地将胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)而没有化学修饰甲基化的胞嘧啶，并因此可以被用于差异修饰基于dna的甲基化状态的dna序列。如本文所用，“差异修饰”甲基化的或非甲基化的dna的试剂，包含在以下过程中与甲基化的和未甲基化的dna差异性反应的任何试剂：即通过该过程从甲基化的和非甲基化的dna产生可区别的产物或可定量区别的结果(例如结合或沉淀程度)，从而允许鉴定dna甲基化状态。此类过程可以包括但不限于：化学反应(如通过亚硫酸氢盐的未甲基化的c→u转化)、酶处理(如通过甲基化依赖的核酸内切核酸酶的切割)、结合和沉淀。因此，优先切割甲基化的dna的酶是当dna被甲基化时能够以高得多的效率切割dna分子的酶，而当dna未被甲基化时优先切割未甲基化的dna的酶展现出显著更高的效率。在本发明的上下文中，“差异修饰”甲基化的和未甲基化的dna的试剂，还指根据它们的甲基化状态在其与dna序列结合或沉淀dna序列中展现出差异能力的任何试剂。一类这样的试剂由甲基化的dna结合蛋白组成。如本文所用的“含cpg的基因组序列”是指在个体基因组中限定位置处的dna序列片段。通常，“含cpg的基因组序列”的长度为至少15个连续的核苷酸，并且含有至少一个cpg对。在一些情况下，其长度可以为至少18、20、25、30、50、80、100、150、180、200、250或300个连续的核苷酸，并且含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个cpg对。对于在给定位置处(例如在人rec8基因组序列的区域(如含有启动子和外显子1-3的区域，例如图1所示的序列片段)内)的任何一个“含cpg的基因组序列”，核苷酸序列变异可以从个体到个体以及从等位基因到等位基因，甚至对于同一个体存在。此外，“含cpg的基因组序列”可以包括用于蛋白质产生的转录或不转录的核苷酸序列，并且核苷酸序列可以是蛋白编码序列、非蛋白编码序列(如转录启动子)或它们的组合。术语“免疫球蛋白”或“抗体”(本文中可互换使用)是指具有由两个重链和两个轻链(所述链例如通过链间二硫键来稳定)组成的基本的四多肽链结构的抗原结合蛋白，其具有特异性结合抗原的能力。重链和轻链都被折叠成结构域。术语“抗体”还指可被用于免疫亲和力测定的抗体的抗原结合片段和表位结合片段(例如fab片段)。有很多良好表征的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中抗体的c-末端至二硫键以产生f(ab)'2(fab的二聚体)，其本身是通过二硫键与vh-ch1连接的轻链。在温和条件下可以将f(ab)'2分解以打断铰链区中的二硫键，从而将(fab')2二聚体转化为fab'单体。fab'单体本质上是具有部分铰链区的fab(参见，例如fundamentalimmunology，paul,编辑,ravenpress,n.y.(1993)，用于其他抗体片段的更详细描述)。虽然根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是技术人员将会理解，可以化学地或通过利用重组dna方法从头合成片段。因此，术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生的或使用重组dna方法合成的抗体片段。当在描述特定分子与蛋白或肽的结合关系的上下文中被使用时，短语“特异性结合”是指决定蛋白和其他生物制剂的异源群体中蛋白的存在的结合反应。因此，在指定的结合测定条件下，特定结合剂(例如抗体)与特定蛋白结合至少两倍于背景，并且基本上不大量与样品中存在的其他蛋白结合。在这样的条件下抗体的特异性结合可能需要针对特定蛋白或蛋白而不是其相似的“姐妹”蛋白来选择其特异性的抗体。可以将多种免疫测定模式用于选择与特定蛋白进行特异性免疫反应或以特定形式的抗体。例如，常规使用固相elisa免疫测定法来选择与蛋白进行特异性免疫反应的抗体(参见例如harlow&lane，antibodies，alaboratorymanual(1988)，用于描述可被用于确定特异性免疫反应性的免疫测定模式和条件)。典型地，特异性或选择性结合反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更典型地超过10至100倍的背景。另一方面，当在提及与另一多核苷酸序列形成双链复合物的多核苷酸序列的上下文中被使用时，术语“特异性结合”描述了如术语“多核苷酸杂交方法”的定义中所提供的基于沃森-克里克(watson-crick)碱基配对的“多核苷酸杂交”。如本申请中所用，“增加”或“减少”是指相比比较对照，例如已建立的标准对照(如在非癌性胃组织中发现的rec8mrna或rec8蛋白的平均表达水平)的可检测的正的或负的数量变化。增加是通常至少10％，或至少20％，或50％，或100％，并且可以高达对照值的至少2倍，或至少5倍，或甚至10倍的正变化。类似地，减少是通常为对照值的至少10％，或至少20％，30％或50％，或者甚至高达至少80％或90％的负变化。表示与比较基础相比的数量变化或差异的其他术语(如“更多”、“更少”、“更高”和“更低”)在本申请中以如上述相同的方式被使用。相反，术语“基本上相同”或“基本上没有变化”表示相比标准对照值的数量变化很小或不变，通常在标准对照的±10％内，或相比标准对照在±5％、2％内或甚至更小的变化。如本文所用，“多核苷酸杂交方法”是指用于采用已知序列的多核苷酸探针，在适当的杂交条件下基于其形成沃森-克里克碱基配对的能力来检测预定的多核苷酸序列的存在和/或量的方法。此类杂交方法的实例包括southern印迹、northern印迹和原位杂交。如本文所用，“引物”是指可以被用于扩增方法(如聚合酶链式反应(pcr))中以基于对应于目标基因(例如，人rec8或其部分的cdna或基因组序列)的多核苷酸序列扩增核苷酸序列的寡核苷酸。通常用于扩增多核苷酸序列的至少一个pcr引物对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和所使用的方法。例如，对于诊断和预后应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少10、或15、或20、或25、或更多个核苷酸，尽管它可以含有更少的核苷酸或更多的核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域的普通技术人员是容易知晓的。在本公开的表中显示了在具体实施方案中使用的引物，其中指出了它们的特定应用。在本公开中，术语“引物对”是指一对引物，其与相反链(靶dna分子)杂交或与侧接于待扩增核苷酸序列的靶dna区域杂交。在本公开中，术语“引物位点”是指引物与其杂交的靶dna或其它核酸的区域。“标记物”、“可检测的标记物”或“可检测的部分”是通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段的可检测的成分。例如，有用的标记物包括：32p、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在elisa中常用的)、生物素、地高辛、或可以被制成(例如通过将放射性成分掺入肽)可检测的或被用于检测与肽特异性反应的抗体的半抗原和蛋白。通常将可检测的标记物连接到具有确定的结合特征的探针或分子(例如，具有已知结合特异性的多肽或多核苷酸)，以便允许探针的存在(和因此其结合靶标)是容易检测的。如本文所用，“标准对照”是指预定量或浓度的多核苷酸序列或多肽(例如rec8mrna或蛋白)，其存在于已建立的正常无病组织样品(例如正常胃上皮组织样品)中。标准对照值适合于使用本发明的方法，以作为比较测试样品中存在的rec8mrna或蛋白的量的基础。用作标准对照的已建立的样品提供平均量的rec8mrna或rec8蛋白，其对于没有任何如通常所定义的胃病，特别是胃癌的普通健康人的胃上皮组织样品(例如胃粘膜)是典型的，。标准对照值可能根据样品的性质以及其他因素(如基于其建立此类对照值对象的性别、年龄、种族)而改变。在描述健康，无如通常所定义的任何胃病(特别是胃癌)的人的上下文中使用的术语“平均”，是指发现于人的胃组织(例如上皮组织或胃粘膜)的某些特征，特别是人rec8mrna或蛋白的量，其代表随机选择的无任何胃病(特别是胃癌)的健康人的组。该选择的组应包含足够数量的人，使得这些个体中的胃粘膜中rec8mrna或蛋白的平均量，以合理的准确度反映普通健康人群中相应量的rec8mrna/蛋白。另外，所选择组的人通常与其胃组织样品被测试胃癌指征的对象具有类似的年龄。此外，还考虑了诸如性别、种族、病史的其他因素，并且优选地在测试对象的简况与所选择的建立“平均”值的个体组之间密切匹配的。本申请中使用的术语“量”是指存在于样品中的目标多核苷酸或目标多肽(例如人rec8mrna或rec8蛋白)的量。可以将这样的量以绝对术语(即样品中多核苷酸或多肽的总量)或以相对术语(即样品中多核苷酸或多肽的浓度)表示。本申请中使用的术语“治疗(treat/treating)”描述了导致相关病况的任何症状的消除、减少、缓和、逆转、或预防、或延迟发作或复发的行为。换句话说，“治疗”病况包括针对该病况的治疗性和预防性干预。如本文所用，术语“有效量”是指量上足够产生期望效果的给定物质的量。例如，编码rec8mrna的多核苷酸的有效量是实现rec8蛋白表达或生物学活性水平增加的所述多核苷酸的量，使得在为治疗目的而被给予了所述多核苷酸的患者中胃癌症状被减少、被逆转、被消除、被预防或被延迟发作。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。给药范围随着所施用治疗剂的性质和其他因素(如施用途径和患者病况的严重程度)而变化。如本文所用，术语“对象”或“需要治疗的对象”包括因胃癌的风险或实际患有胃癌而寻求医疗照顾的个体。对象还包括寻求治疗方案的操作的目前正在经受治疗的个体。需要治疗的对象或个体包括那些表现出胃癌症状或处于患胃癌或其症状的风险中的对象或个体。例如，需要治疗的对象包括具有胃癌遗传倾向或家族史的个体，过去已经遭受过相关症状的那些个体，已经被暴露于触发物质或事件的那些个体，以及患有慢性或急性病况的症状的那些个体。“需要治疗的对象”可能处于寿命的任何年龄段。rec8蛋白的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”分别被用于指使用rec8蛋白结合或信号转导的体外和体内测定法鉴定的抑制性、激活性或调节性分子，例如，配体、激动剂、拮抗剂及它们的同源物和模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。抑制剂是例如部分或完全阻断碳水化合物结合，降低、预防、延迟激活、灭活、脱敏或下调rec8蛋白活性的试剂。在一些情况下，抑制剂直接或间接地结合rec8蛋白，诸如中和抗体。如本文所用，抑制剂与灭活剂和拮抗剂同义。激活剂是例如刺激、增加、促进、增强激活、敏化或上调rec8蛋白活性的试剂。调节剂包括rec8蛋白配体或结合伴侣，包括天然存在的配体和合成设计的配体、抗体和抗体片段、拮抗剂、激动剂、包括含碳水化合物的分子的小分子、sirna，rna适体等的修饰。发明详述i.引言由于胃癌在其早期发展阶段缺乏特定症状的性质，胃癌患者常常面临糟糕的预后。因此，胃癌的早期检测对于提高患者生存率至关重要。此外，在初始诊断后，在已经接受任何时间段的胃癌诊断的患者中预测胃癌死亡的可能性也具有实际重要性。本发明人首次发现，rec8在mrna和蛋白水平的表达在胃癌细胞中被抑制。rec8蛋白这种被抑制的表达是由于在rec8基因组序列中(尤其是在该基因的启动子区域中)甲基化增加，这导致rec8mrna的转录减少。这一发现为检测、监测和治疗胃癌提供了重要手段。通常，在可能展现出或不可能展现出消化道相关病症或病况的任何病症的测试对象中观察到低于正常的rec8mrna/蛋白水平，表明对象已经患胃癌或将稍后发展成胃癌的可能性很高。类似地，rec8基因序列中(特别是在启动子区域中)高于正常水平的甲基化，表明对象已经患胃癌或将稍后发展成胃癌的可能性很高。此外，在胃癌患者中，具有较低的rec8mrna或蛋白表达水平或具有较高的rec8dna甲基化水平的个体在诊断后时间周期内由胃癌导致死亡的可能性高于具有正常或较高的rec8mrna或蛋白表达水平或具有正常或较低的rec8dna甲基化水平的对应个体。ii.普通方法学利用分子生物学领域的常规技术来实施本发明。公开本发明使用的一般方法的基本文本包括：sambrook和russell，molecularcloning,alaboratorymanual(第3版，2001)；kriegler,genetransferandexpression:alaboratorymanual(1990)；和currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人编辑,1994))。对于核酸，大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些是来自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、来自测序的核酸、或来自公布的dna序列的估计值。对于蛋白，大小以千道尔顿(kda)或氨基酸残基数给出。从凝胶电泳、从测序的蛋白、从得到的氨基酸序列、或从公布的蛋白序列来估计蛋白大小。可以化学合成不可商购的寡核苷酸，例如，根据由beaucage和caruthers，tetrahedronlett.22:1859-1862(1981)首次描述的固相亚磷酰胺三酯法，如vandevanter等人,nucleicacidsres.12:6159-6168(1984)中所述使用自动合成仪。使用任何本领域公认的策略进行寡核苷酸的纯化，例如,如pearson和reanier，j.chrom.255:137-149(1983)中所述的天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换高效液相色谱(hplc)。可以使用例如wallace等人,gene16:21-26(1981)的对双链模板进行测序的链终止方法验证本发明中使用的目标序列(例如人rec8基因的多核苷酸序列)和合成的寡核苷酸(例如引物)。iii.获取组织样品并分析rec8mrna或dna本发明涉及测量rec8mrna的量或分析在人的胃组织，特别是胃上皮样品中发现的rec8基因组dna的甲基化模式，作为检测胃癌存在，评估发展成胃癌的风险和/或监测胃癌的进展或治疗效果的手段。因此，实施本发明的第一步是从测试对象获得胃上皮组织样品，并从所述样品中提取mrna或dna。a.获取和制备胃组织样品使用本发明的方法，从待测试或监测胃癌的人获得胃组织样品。根据医院或诊所通常遵循的标准方案(诸如在内窥镜检查期间)，进行从个体采集胃上皮组织样品。采集适量的胃上皮，并可以在进一步制备前按照标准程序储存胃上皮。可以使用例如胃粘膜进行根据本发明在患者胃上皮样品中发现的rec8mrna或dna的分析。制备用于核酸提取的组织样品的方法在本领域技术人员中是众所周知的。例如，应首先处理对象的胃粘膜样品以破坏细胞膜从而释放细胞内含有的核酸。b.rna的提取和定量有许多从生物样品中提取mrna的方法。可以遵循mrna制备的一般方法(例如，由sambrook和russell描述，molecularcloning：alaboratorymanual第3版,2001)；也可以使用各种商购试剂或试剂盒(如trizol试剂(invitrogen,carlsbad,ca)、oligotex直接mrna试剂盒(qiagen,valencia,ca)、rneasy微型试剂盒(qiagen,hilden,德国)和系列9600tm(promega,madison,wi))从来自测试对象的生物样品中获得mrna。也可以使用多于一种的这些方法的组合。必要的是从rna制备物中去除所有受到污染的dna。因此，应谨慎处理样品，用脱氧核糖核酸酶彻底处理，并在扩增和定量步骤中应使用适当的阴性对照。1.基于pcr定量测定mrna水平一旦从样品中提取mrna，可以定量人rec8mrna的量。确定mrna水平的优选方法是基于扩增的方法，例如通过聚合酶链式反应(pcr)，特别是逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)。在扩增步骤之前，必须合成人rec8mrna的dna拷贝(cdna)。这通过逆转录来实现，逆转录可以作为单独的步骤被进行，或者在均相逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)(用于扩增rna的聚合酶链式反应的改进)中被进行。适用于核糖核酸的pcr扩增的方法描述于romero和rotbart的diagnosticmolecularbiology：principlesandapplicationspp.401-406；persing等人,编辑,mayofoundation,rochester,mn,1993；egger等人,j.clin.microbiol.33:1442-1447,1995；和美国专利第5,075,212号。pcr的一般方法在本领域中是众所周知的，并因此在此不详细描述。对于设计引物的pcr方法、方案和原理的综述，参见例如innis等人,pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications，academicpress，inc.ny，1990。pcr试剂和方案也是可从商业供应商(如rochemolecularsystems)获得。最通常的是用热稳定酶以自动化过程进行pcr。在此过程中，反应混合物的温度自动地循环通过变性区域、引物退火区域和延伸反应区域。特别适用于此目的的机器是商购的。尽管目标mrna的pcr扩增通常被用于实施本发明。然而，本领域技术人员将认识到，可以通过任何已知的方法(如连接酶链式反应(lcr)、转录介导的扩增和自我维持的序列复制或基于核酸序列的扩增(nasba))来完成组织样品中mrna种类的扩增，它们中的每一种提供足够的扩增。最近开发的分支dna技术也可以被用于定量测定样品中mrna的量。对于直接定量临床样品中核酸序列的分支dna信号扩增的综述，参见nolte,adv.clin.chem.33:201-235,1998。2.其他定量方法还可以使用本领域技术人员熟知的其他标准技术检测rec8mrna。尽管检测步骤通常在扩增步骤之前，但在本发明的方法中不需要扩增。例如，可以通过大小分级(例如凝胶电泳)来鉴定mrna，无论是否通过扩增步骤进行。在根据众所周知的技术(参见例如sambrook和russell，同上)，在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中运行样品并用溴化乙锭进行标记后，与标准对照相同大小的条带的存在是靶mrna存在的指示，然后可以基于条带的强度将靶标mrna的量与对照进行比较。可选择地，可以使用对rec8mrna具有特异性的寡核苷酸探针来检测这样的mrna种类的存在，并且基于由探针赋予的信号强度，通过与标准对照相比来指示mrna的量。序列特异性探针杂交是检测包含其他核酸种类的特定核酸的众所周知的方法。在足够严格的杂交条件下，探针仅与基本上互补的序列特异性杂交。可以放宽杂交条件的严格性以容忍不同量的序列错配。本领域众所周知的许多杂交形式，包括但不限于溶液相、固相或混合相杂交测定法。以下文章提供了各种杂交测定形式的综述：singer等人,biotechniques4：230,1986；haase等人,methodsinvirology，pp.189-226,1984；wilkinson,insituhybridization,wilkinson编辑,irlpress,oxforduniversitypress,oxford；以及hames和higgins编辑,nucleicacidhybridization:apracticalapproach,irlpress,1987。根据众所周知的技术检测杂交复合物。能够与靶核酸(即mrna或扩增的dna)特异性杂交的核酸探针，可以通过通常被用于检测杂交的核酸存在的几种方法中任一种进行标记。一种常见的检测方法是，使用采用3h、125i、35s、14c或32p等标记的探针的放射自显影术。放射性同位素的选择取决于研究偏好，归因于所选择的同位素的容易合成、稳定性和半衰期。其他标记物包括与用荧光团、化学发光剂和酶标记的抗配体或抗体结合的化合物(例如生物素和地高辛)。可选择地，可以将探针直接与标记物(如荧光团、化学发光剂或酶)缀合。标记物的选择取决于所需的灵敏度，与探针缀合的容易程度、稳定性要求和可用仪器。可以使用众所周知的技术来合成和标记实施本发明所必需的探针和引物。可以根据由beaucage和caruthers，tetrahedronletts.,22：1859-1862,1981中首次描述的固相亚磷酰胺三酯方法，如needham-vandevanter等人,nucleicacidsres.12:6159-6168,1984中所述使用自动合成仪化学合成被用作探针和引物的寡核苷酸。如pearson和regnier，j.chrom.,255:137-149,1983中所述，通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换hplc纯化寡核苷酸。c.rec8基因组序列中甲基化的检测研究含有一个或多个cpg(胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸)对的rec8基因组序列片段的甲基化状态，以提供关于测试对象是否患有胃癌、对象是否处于发展成胃癌的风险中、或对象的胃癌是否正在恶化或改善的指征。通常分析包括5'非翻译区(如启动子区)并包括一个或多个cpg核苷酸对的rec8基因组序列片段的甲基化模式。例如，可以使用基因组序列seqidno:5(图1所示的rec8cdna序列的-112至+120片段)或其含有足够数量cpg对的部分以确定序列内有多少cpg对是甲基化的，以及有多少不是甲基化的。被分析的序列应该足够长以含有至少1个(例如2、3、4、5、10或更多个)cpg二核苷酸对，并且在该cpg位点处的甲基化检测通常是胃癌细胞存在的充分指征。被分析序列的长度通常为至少15或20个连续核苷酸，并且可更长，具有至少25、30、50、75、100、150、180或多达200或230个连续核苷酸。在序列中存在至少一个，通常2个或更多个，通常3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个cpg核苷酸对。在分析多个(2个或更多个，如5个、10个、15个)cpg位点的甲基化状态(其可以是100％甲基化的或至少50％甲基化的)的情况下，当在被分析的基因组序列内至少50％的cpg对被显示为甲基化时，正在测试的对象被认为患有胃癌或具有升高的发展成胃癌的风险。作为实例，可以选择seqidno:5，rec8基因组序列的片段(-112至+120与转录起始位点有关)，作为用于分析的靶序列。发现该区域中的一些或大多数cpg对在已建立的胃癌细胞系和取自胃癌的样品中是甲基化的，而非癌性胃上皮细胞显示非常少(如果有的话)甲基化的cpg位点(参见例如图1和2)。例如，当发现该区域内19个cpg位点的至少90％(或至少17或18个cpg位点)被至少50％甲基化时，或当发现19个cpg位点的至少50％(或至少10个cpg位点)被100％甲基化时，确立胃癌的存在或增加的稍后发展成胃癌的风险。为了确定rec8基因组序列的甲基化模式的目的，亚硫酸氢盐处理后的dna测序是特别有用的，因为亚硫酸氢盐将未甲基化的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)，同时使甲基化的胞嘧啶保持不变，允许通过dna测序过程直接鉴定。任选地，在亚硫酸氢盐转化之后和dna测序之前包括扩增过程(如pcr)。1.dna提取和处理用于从生物样品中提取dna的方法在分子生物学领域是众所周知的并且被常规实施，参见例如sambrook和russell，同上。应该消除rna污染以避免干扰dna分析。然后用能够以甲基化差异方式修饰dna的试剂处理dna，即在处理后将从甲基化的胞嘧啶(c)残基和未甲基化的c残基产生不同且可区分的化学结构。通常，此类试剂与dna分子中的未甲基化的c残基反应，并将每个未甲基化的c残基转化为尿嘧啶(u)残基，而甲基化的c残基保持不变。这种未甲基化的c→u转化允许基于核酸一级序列中的变化检测和比较甲基化状态。适合于此目的的示例性试剂是亚硫酸氢盐(如亚硫酸氢钠)。使用亚硫酸氢盐进行dna化学修饰的方法在本领域中是众所周知的(参见例如herman等人.,proc.natl.acad.sci.usa93:9821-9826,1996)。如本领域技术人员将认识到的，可以将在本文中未命名但具有与化学上(或通过任何其他机制)差异修饰甲基化的和未甲基化的dna相同性质的任何其他试剂用于实施本发明。例如，dna的甲基化特异性修饰也可以通过甲基化敏感的限制酶来完成，其中一些限制酶通常切割未甲基化的dna片段而不切割甲基化的dna片段，而另一些(例如甲基化依赖性核酸内切酶mcrbc)切割含有甲基化的胞嘧啶的dna而不切割未甲基化的dna。此外，化学修饰和限制酶处理的组合(例如组合的亚硫酸氢盐限制性分析(cobra)(xiong等人,1997nucleicacidsres.25(12):2532-2534)对实施本发明是有用的。其他可用于检测dna甲基化的方法包括：例如通过southern印迹或pcr分析的甲基化敏感性限制性核酸内切酶(msre)测定法、甲基化特异性或甲基化敏感性pcr(ms-pcr)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(ms-snupe)、高分辨率解链(hrm)分析、亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序、甲基化特异性单链构象分析(ms-ssca)、甲基化特异性变性梯度凝胶电泳(ms-dgge)、甲基化特异性解链曲线分析(ms-mca)、甲基化特异性变性高效液相色谱(ms-dhplc)、甲基化特异性微阵列(mso)。这些测定法可以是pcr分析、使用荧光标记的定量分析或southern印迹分析。示例性甲基化敏感的dna切割试剂(如限制酶)包括：aatii、acii、acli、agei、asci、asp718、avai、bbrp1、bceai、bmgbi、bsaai、bsahi、bsiei、bsiwi、bsmbi、bspdi、bsrfi、bsshii、bstbi、bstui、clai、eagi、eagi-hftm、faui、fsei、fspi、haeii、hgai、hhai、hinp1i、hpaii、hpy99i、hpych4iv、kasi、mlui、nari、ngomiv、noti、noti-hftm、nrui、nt.bsmai、paer7i、pspxi、pvui、rsrii、sacii、sali、sali-hftm、sfoi、sgrai、smai、snabi或tspmi。2.可选择的扩增和序列分析在以甲基化差异方式修饰dna之后，然后对经处理的dna进行基于序列的分析，从而可以确定rec8基因组序列的甲基化状态。在甲基化特异性修饰后的序列分析之前，扩增反应是可选的。多种多核苷酸扩增方法已被很好地建立，并经常被用于研究。例如，用于多核苷酸序列扩增的聚合酶链式反应(pcr)的一般方法在本领域中是众所周知的，并因此在此不详细描述。对于设计引物的pcr方法、方案和原理的综述，参见例如innis等人,pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress,inc.ny,1990。pcr试剂和方案也是可从商业供应商(如rochemolecularsystems)获得。虽然pcr扩增通常被用于实施本发明，但是本领域技术人员将认识到，可以通过任何已知的方法(如连接酶链式反应(lcr)、转录介导的扩增和自我维持的序列复制或基于核酸序列的扩增(nasba))来实现相关基因组序列的扩增，它们中的每一种提供足够的扩增。用于多核苷酸序列测定的技术也被很好地建立并在相关研究领域中被广泛实施。例如，用于多核苷酸测序的基本原理和通用技术描述于各种关于分子生物学和重组遗传学的研究报告和论文中，诸如wallace等人,同上；sambrook和russell，同上；和ausubel等人，同上。可以将在研究实验室中常规实施的手动或自动的dna测序方法用于实施本发明。适合于实施本发明方法的检测多核苷酸序列中变化(例如c→u)的其他方法包括但不限于：质谱法、引物延伸、多核苷酸杂交、实时pcr、解链曲线分析、高分辨率解链分析、异源双链分析、焦磷酸测序和电泳。iv.多肽的定量a.获取样品实施本发明的第一步是从正在被测试、被评估或被监测胃癌、发展成胃癌的风险或病况严重性/进展的对象获得胃上皮样品。相同类型的样品应该被取自对照组(没有患有任何胃病，特别是瘤形成的正常个体)和测试组(例如正在被测试可能的胃癌的对象)。正如前一章所述，为了此目的，通常遵循医院或诊所常规使用的标准程序。为了检测测试对象中胃癌的存在或评估测试对象中发展成胃癌的风险的目的，可以采集个体患者的胃粘膜样品，并可以测量人rec8蛋白的水平，然后将其与标准对照比较。如果与对照水平相比时，观察到人rec8蛋白水平的降低，则测试对象被认为患有胃癌或具有升高的发展成该病况风险。为了监测胃癌患者的疾病进展或评估胃癌患者的治疗效果的目的，可以在不同的时间点采集个体患者的胃上皮样品，使得可以测量人rec8蛋白的水平以提供指示疾病状态的信息。例如，当患者的rec8蛋白水平随时间呈现总体增加趋势时，认为患者的胃癌严重程度得以改善或认为患者已经接受的治疗是有效的。另一方面，患者rec8蛋白水平缺乏变化或持续下降的趋势将表明病况恶化和给予患者的治疗无效。通常，在患者中观察到较低的rec8蛋白水平表明患者正患有更严重形式的胃癌且该疾病的预后更差，表现为更短的预期寿命、更高的转移率、对治疗的抗性等。在胃癌患者中，在胃癌样品中具有比在第二位胃癌患者中发现的rec8蛋白表达水平低的rec8蛋白表达水平的患者，与第二位患者相比在任何确定的时间段(如诊断后1-5年)内具有更高的死亡可能性。b.制备用于rec8蛋白检测的样品来自对象的胃组织样品适合于本发明，并且可以通过众所周知的方法和如前一章所述获得。在本发明的某些应用中，胃粘膜可能是优选的样品类型。c.确定人rec8蛋白的水平可以使用各种免疫学测定来检测任何特定身份的蛋白，如rec8蛋白。在一些实施方案中，可以通过用对所述多肽具有特异性结合亲和力的抗体，从测试样品捕获所述多肽来进行夹心式测定。然后可以用对多肽具有特异性结合亲和力的标记抗体检测所述多肽。可以使用微流体装置(如微阵列蛋白芯片)来进行这样的免疫学测定。也可以通过凝胶电泳(如2维凝胶电泳)和使用特异性抗体的western印迹分析来检测目标蛋白(例如，人rec8蛋白)。可选择地，使用适当的抗体，可以使用标准免疫组织化学技术来检测给定蛋白(例如人rec8蛋白)。单克隆抗体和多克隆抗体(包括具有所需结合特异性的抗体片段)均可被用于特异性检测多肽。可以通过已知技术产生对特定蛋白(例如人rec8蛋白)具有特异性结合亲和力的此类抗体及它们的结合片段。在实施本发明时，还可以采用其他方法来测量rec8蛋白的水平。例如，基于质谱技术已经开发了多种方法，即使在大量样品中也能快速和准确地定量靶蛋白。这些方法涉及高度复杂的设备，如使用多反应监测(mrm)技术的三重四极杆(三q)仪器、基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱仪(malditof/tof)、使用选择性离子监测(sim)模式的离子阱仪器，以及基于电喷雾电离(esi)的qtop质谱仪。参见例如pan等人,jproteomeres.2009february；8(2):787–797。v.建立标准对照为了建立用于实施本发明方法的标准对照，首先选择没有如通常所定义的任何胃部疾病(特别是任何形式的肿瘤，如胃癌)的健康人群组。如果可适用的话，这些个体处于适当的参数范围内，用于使用本发明的方法筛选和/或监测胃癌的目的。可选地，个体具有相同的性别、相似的年龄、或相似的种族背景。所选择的个体的健康状态通过完善建立的常规使用的方法来确认，所述方法包括但不限于：个体的一般体格检查及他们的病史的一般回顾。此外，所选择的健康个体组必须具有合理的大小，使得从该组获得的胃组织样品中人rec8mrna或rec8蛋白的平均量/浓度可以被合理地认为是普通健康人群中正常或平均水平的代表。优选地，所选择的组包含至少10个人类对象。一旦基于在所选择的健康对照组的每个对象中发现的个体值建立了rec8mrna或蛋白的平均值，则该平均的或中值的或代表的值或概况被认为是标准对照。标准偏差也在同一过程中被确定。在某些情况下，可以针对具有不同特征(如年龄、性别或种族背景)的单独定义的组来建立单独的标准对照。vi.胃癌的治疗和预防通过说明抑制的rec8蛋白表达与胃癌的相关性，本发明进一步提供了用于治疗患有胃癌的患者的手段：通过增加rec8蛋白表达或生物活性。如本文所用，治疗胃癌包括减少、逆转、减轻或消除胃癌的一种或更多种症状，以及预防或延迟一种或更多种相关症状的发作。一旦检测到rec8在mrna/蛋白水平的抑制表达，提示rec8的甲基化水平升高，特别是在启动子/外显子1-3区域(例如，seqidno:5)时，其可以确立在患者中存在胃癌或在患者中稍后发展成该疾病的风险增加。作为该确定的结果，可以对患者进行随后的治疗或预防/监测措施，特别是符合某些特征的那些(如具有胃癌家族史的那些)，以便可以预防、消除、减轻、降低这些病况症状的严重程度和/或频率，或者延迟它们的发作。例如，医生可以开展药理学和非药理学治疗，如生活方式改变(例如，减少5％或更多体重，采取更健康的生活方式，包括遵循高纤维/低盐饮食并保持较高水平的体育活动，如每周步行至少150分钟，并进行常规筛查/检查如定期内窥镜检查)。对于已经被检测为具有胃癌高风险但尚未患病的那些患者，可以采取各种预防措施，例如可以根据需要检测幽门螺杆菌(helicobacterpylori)感染并用抗生素治疗。建议对幽门螺杆菌进行检测，特别是如果高风险患者有一级亲属(如父母、兄弟姐妹或孩子)被诊断患有胃癌或有幽门螺杆菌感染。高风险患者也可以采用增加部分新鲜蔬菜和水果，减少部分至没有倾向于比新鲜食物含有多得多的盐分的高盐食物(如通过干燥、烟熏、盐腌或浸酸的保存食物方式)的饮食。还应该建议已经被认为处于稍后发展成胃癌的高风险中的患者避免使用烟酒，以进一步最小化疾病风险。在一些情况下，当通过其他诊断手段(例如内窥镜检查、活组织检查的病理分析)确认胃癌的存在时，可以使用积极治疗(如手术干预)以及放射疗法和/或化疗。a.增加rec8表达或活性1.编码rec8蛋白的核酸通过使用编码功能性rec8蛋白的核酸，可以实现rec8基因表达的增强。这样的核酸可以是在有利条件下可以翻译成活性形式的rec8蛋白的单链核酸(如mrna)或双链核酸(如dna)。在一实施方案中，编码rec8的核酸以通常重组产生的表达盒的形式被提供，所述表达盒具有与编码rec8蛋白的多核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些情况下，启动子是指导所有或大多数组织类型中的基因表达的通用启动子；在其他情况下，启动子是特定指导上皮细胞特别是胃上皮细胞中的基因表达的启动子。此类核酸的施用可以增加靶组织(例如胃上皮)中的rec8蛋白表达。因为编码其mrna的人rec8基因序列被称为genbank登录号第nm_005132.2号且在本文中被提供为seqidno:1，并且其蛋白编码序列在本文中被提供为seqidno:2，所以可以从该序列、物种同源物和这些序列的变体得到合适的编码rec8的核酸。2.rec8蛋白通过向患有胃癌并展示受抑制的rec8蛋白表达或活性的患者直接施用有效量的活性rec8蛋白，也可以有效治疗该疾病。例如，这可以通过向患有胃癌的患者施用具有其生物活性的重组产生的rec8蛋白来实现。用于递送基于蛋白或多肽的治疗剂的制剂和方法在本领域中是众所周知的。3.rec8蛋白的激活剂用能够激活rec8蛋白表达或增强rec8蛋白活性的试剂，可以实现增加的rec8蛋白活性。例如，去甲基化剂(例如5-aza)可以通过消除由该基因启动子区的甲基化引起的rec8基因表达的抑制来激活rec8基因表达。其他活化剂可以包括对rec8启动子和/或增强子具有特异性的转录激活剂。可以使用本文实施例中描述的rec8表达测定法来筛选并鉴定此类活化剂。rec8蛋白的激动剂(如活化抗体)是rec8蛋白的另一种激活剂。此类激活剂通过增强rec8蛋白的生物活性，通常(但不一定)通过与rec8蛋白和/或其相互作用蛋白直接结合起作用。此类激动剂的初步筛选可以从用于鉴定与rec8蛋白物理相互作用的分子的结合测定开始。b.药物组合物1.制剂本发明的化合物可用于制造药物组合物或医药。可以将药物组合物或医药施用于对象以治疗胃癌。本发明中使用的化合物(例如rec8蛋白、编码rec8蛋白的核酸、或rec8基因表达的激活剂)可用于制造包含它们的有效量并与适合应用的赋形剂或载体组合或混合的药物组合物或医药。用于增强rec8表达的示例性药物组合物包含：(i)如本文所述的包含编码人rec8蛋白的多核苷酸序列的表达盒，以及(ii)药学上可接受的赋形剂或载体。术语药学上可接受的和生理上可接受的在本文中同义使用。可以以治疗有效剂量提供表达盒，以用于如本文所述的治疗方法中。可以经由脂质体施用rec8蛋白或编码rec8蛋白的核酸，所述脂质体用于将该缀合物靶向特定的组织，并且增加该组合物的半衰期。脂质体包括乳剂、泡沫剂、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、层状层等。在这些制剂中，待递送的抑制剂作为脂质体的一部分，单独或与被靶向的细胞(例如上皮细胞)中普遍存在的受体结合的分子或与其他治疗性或免疫原性组合物组合而被掺入。因此，可以将填充有本发明所需抑制剂的脂质体引导至治疗部位，然后其中脂质体递送选定的抑制剂组合物。用于本发明的脂质体由标准的形成囊泡的脂质形成，所述脂质通常包括中性和带负电的磷脂和固醇(如胆固醇)。通常通过考虑例如脂质体大小、脂质体在血流中的酸不稳定性和稳定性来指导脂质的选择。多种方法可用于制备脂质体，其描述于例如szoka等人(1980)ann.rev.biophys.bioeng.9:467,美国专利第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号中。可以通过使用一种或更多种生理上可接受的载体或赋形剂的标准技术来配制用于本发明的药物组合物或医药。合适的药物载体在本文和e.w.martin的“remington'spharmaceuticalsciences”中被描述。可以配制本发明的化合物和试剂及它们生理学上可接受的盐和溶剂化物，以用于通过任何合适的途径(包括通过吸入、局部地、鼻地、口服地、肠胃外地或直肠给药)施用。用于局部施用的典型制剂包括：乳膏剂、软膏剂、喷雾剂、洗剂和贴剂。然而，可以将药物组合物配制成用于任何类型的施用，例如使用注射器或其他装置的皮肤内的、皮下的、静脉内的、肌肉内的、鼻内的、大脑内的、气管内的、动脉内的、腹膜内的、膀胱内的、胸膜内的、冠状动脉内的或瘤内的注射。也考虑了用于通过吸入(例如气雾剂)施用的，或用于口服、直肠或阴道施用的制剂。2.施用途径用于局部施用(例如施用于患者皮肤)的合适制剂优选为本领域公知的水溶液、凝胶、胶囊或糊剂。这样可能含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。用于经皮施用的合适制剂包括有效量的本发明化合物或试剂与载体。优选的载体包括可吸收的药理学上可接受的溶剂，以帮助通过患者的皮肤。例如，经皮的装置为绷带形式，其包含衬背构件、含有化合物和任选地载体的储库、任选地以将化合物在延长的时间段以受控和预定的速率递送至患者的皮肤的速率控制屏障，以及将该装置固定到上皮的工具。也可以使用基质经皮制剂。对于口服施用，药物组合物或医药可以采取例如通过常规方法用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊形式。优选的是包含活性成分(即rec8蛋白或编码rec8蛋白的核酸)连同以下物质的片剂和明胶胶囊：(a)稀释剂或填充剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素(例如、乙基纤维素、微晶纤维素)、甘氨酸、果胶、聚丙烯酸酯和/或磷酸氢钙、硫酸钙，(b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁或钙盐、金属硬脂酸盐、胶态二氧化硅、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、乙酸钠和/或聚乙二醇；对于片剂还有(c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或羟丙基甲基纤维素；如需要还有(d)崩解剂，例如淀粉(例如马铃薯淀粉或淀粉钠)、羟乙酸盐(glycolate)、琼脂、海藻酸或其钠盐、或泡腾混合物；(e)润湿剂，例如十二烷基硫酸钠，和/或(f)吸收剂、着色剂、调味剂和甜味剂。可以根据本领域已知的方法对片剂进行薄膜包衣或肠溶包衣。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液剂、糖浆剂或混悬剂的形式，或者它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的载体进行构建。可以通过常规方法用药学上可接受的添加剂制备此类液体制剂，所述添加剂为例如悬浮剂，如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用的脂肪；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯树胶；非水载体，例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油；和防腐剂，例如甲基对羟基苯甲酸酯或丙基对羟基苯甲酸酯或山梨酸。如果合适，制剂还可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂和/或甜味剂。如果需要，可适当配制口服施用制剂以产生可控制释放的活性化合物。可以配制本发明的化合物和试剂用于通过注射(例如通过快速浓注或连续输注)的肠胃外施用。用于注射的制剂可以以单位剂量形式(例如在安瓿或多剂量容器中)呈现，并具有添加的防腐剂。可注射组合物优选为水等渗溶液或悬浮液，并且栓剂优选由脂肪乳剂或混悬剂制备。组合物可以是灭菌的，和/或含有佐剂，诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂，溶液促进剂，用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。可选择地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)构建。另外，它们也可以含有其他有治疗价值的物质。该组合物分别根据常规的混合、制粒或包衣方法被制备，并含有约0.1-75％，优选约1-50％的活性成分。对于通过吸入施用，活性成分(例如rec8蛋白或编码rec8蛋白的核酸)可以以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾呈现形式被方便地递送，使用合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀来确定剂量单位以递送计量的量。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，可以被配制成含有化合物和合适粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。还可以将治疗剂配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质，如可可油或其他甘油酯。此外，可以将活性成分配制成长效制剂。可以通过植入(例如皮下地或肌内地)或通过肌内注射施用此类长效制剂。因此，例如，可以用合适的聚合物或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂、或作为微溶衍生物(例如作为微溶盐)来配制活性成分。本发明的药物组合物或医药包含：(i)有效量的如本文所述的增加rec8蛋白水平或活性的化合物，和(ii)另一种治疗剂。当与本发明的化合物一起使用时，此类治疗剂可以被单独使用、依次使用、或与一种或更多种其他此类治疗剂(例如第一治疗剂、第二治疗剂和本发明化合物发明)组合使用。施用可以是通过相同或不同的施用途径，或在相同的药物制剂中一起施用。3.剂量如本文所述，可以以治疗有效剂量向对象施用药物组合物或医药以预防、治疗或控制胃癌。以足以在对象中引起有效治疗应答的量向对象施用药物组合物或医药。施用的活性剂的剂量取决于对象的体重、年龄、个体状况、待治疗区域的表面面积或体积以及施用形式。还将由在特定对象中施用特定化合物所伴随的任何不良影响的存在、性质和程度来决定剂量的大小。例如，每种类型的rec8蛋白或编码rec8蛋白的核酸将可能具有独特的剂量。用于向约50至70kg的哺乳动物口服施用的单位剂量，可以含有约5至500mg的活性成分。通常，本发明活性化合物的剂量是足以实现所需效果的剂量。可以从对象体内试剂积聚的测量来计算最佳给药时间表。通常，可以每天、每周或每月给予一次或更多次剂量。本领域普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。为了达到所需的治疗效果，可以以治疗有效的日剂量施用化合物或试剂多天。因此，化合物的治疗有效施用以治疗对象中本文所述的相关病况或疾病，需要定期(例如每日)施用，其持续时间为三天至两周或更长。通常，将施用试剂至少连续三天，经常至少连续五天，更经常至少十天，并且有时连续20、30、40或更多天。虽然连续的每日剂量是达到治疗有效剂量的优选途径，但即使不是每天施用试剂也可以实现治疗有益效果，只要足够频繁地重复施用以维持对象中试剂的治疗有效浓度。例如，可以每隔一天、每隔两天施用试剂，或者如果对象使用和耐受更高的剂量范围，则每周一次施用试剂。此类化合物或试剂的最佳剂量、毒性和治疗功效可以根据各个化合物或试剂的相对效能而变化，并且可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如通过确定ld50(对50％的群体致死的剂量)和ed50(50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以被表示为ld50/ed50的比，。展现出大治疗指数的试剂是优选的。虽然可以使用展现出毒副作用的试剂，但应该注意设计一种将此类试剂靶向至受影响组织的位点的递送系统，以使对正常细胞的潜在损害最小化，从而减少副作用。可以将从例如细胞培养测定和动物研究获得的数据用于制定用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选地位于包括具有很小毒性或没有毒性的ed50的循环浓度范围内。剂量可以在此范围内变化，这取决于所用的剂型和施用途径。对于在本发明的方法中使用的任何试剂，最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量，以达到包括如在细胞培养中确定的ic50(实现症状的半数最大抑制的试剂浓度)的循环血浆浓度范围。这些信息可以被用来更准确地确定人体中可用的剂量。例如，可以通过高效液相色谱法(hplc)测量血浆中的水平。通常，对于典型的对象，试剂的剂量当量为约1ng/kg至100mg/kg。提供了用于本文所述的rec8蛋白或编码rec8蛋白的核酸的示例性剂量。用于编码rec8的核酸(例如表达盒)的剂量可以为0.1-0.5mg/使用，玻璃体内施用(例如5-30mg/kg)。可以以5-1000mg的量口服施用，或者以10-500mg/ml的量通过静脉输注施用小有机化合物激活剂，。可以每周五次以50-500mg/ml(历经120分钟)，1-500mg/kg(历经60分钟)，或1-100mg/kg(推注)的量通过静脉注射或输注施用单克隆抗体激活剂。可以以10-500mg的量皮下施用；0.1-500mg/kg的量静脉内每天两次施用，或约50mg每周一次施用，或25mg每周两次施用rec8蛋白或肽激活剂。可以将本发明的药物组合物单独施用或与至少一种另外的治疗性化合物组合施用。示例性的有利治疗化合物包括全身和局部的抗炎剂、止痛剂、抗组胺剂、麻醉化合物等。可以将另外的治疗性化合物与主要活性成分(例如rec8蛋白或编码蛋白的核酸)同时或甚至在相同组合物中施用。还可以将另外的治疗性化合物与主要活性成分分开施用，在单独的组合物中施用，或以不同的剂型施用。根据个体的特定症状和特征，可以将主要成分(如rec8蛋白或编码rec8蛋白的核酸)的一些剂量与另外的治疗性化合物同时施用，而另一些剂量被单独施用。根据症状的严重程度、复发的频率和对治疗方案的生理反应，可以在整个治疗过程中调整本发明的药物组合物的剂量。本领域技术人员通常参与该治疗方案的这种调整。vii.试剂盒和装置本发明提供了用于实施本文所述方法的组合物和试剂盒，以评估对象中rec8mrna或rec8蛋白的水平，它们可以被用于各种目的，如检测或诊断胃癌的存在，确定发展成胃癌的风险，以及监测患者胃癌的进展，包括评估胃癌死亡的可能性。进行用于确定rec8mrna水平的测定的试剂盒，通常包括至少一种寡核苷酸，其可用于与rec8编码序列或其互补序列的至少一个片段进行特异性杂交。任选地，用可检测部分标记该寡核苷酸。在一些情况下，试剂盒可以包括至少两种寡核苷酸引物，可以将所述至少两种寡核苷酸引物用于通过pcr，特别是通过rt-pcr扩增rec8dna或mrna的至少一个片段。表5提供了合适引物的一些实例。进行用于确定rec8蛋白水平的测定的试剂盒，通常包括至少一种抗体，其可用于与rec8a蛋白氨基酸序列特异性结合。任选地，用可检测部分标记该抗体。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些情况下，试剂盒可以包括至少两种不同的抗体，一种用于与rec8蛋白特异性结合(即，一级抗体)，另一种用于检测经常与可检测部分连接的一级抗体(即二级抗体)。通常，试剂盒还包括适当的标准对照。该标准对照指示未患胃癌的健康对象的胃上皮细胞中rec8蛋白或mrna的平均值。在一些情况下，可以以设定值的形式提供此类标准对照。另外，本发明的试剂盒可以提供指导手册，以指导用户分析测试样品并评估测试对象中胃癌的存在、风险或状态。另一方面，本发明还可以体现在装置或包含一个或更多个此类装置的系统中，其能够实施本文所述的全部或部分方法步骤。例如，在一些情况下，该装置或系统在接收胃组织样品(例如取自正在被测试用于检测胃癌、评估发展成胃癌的风险的，或正在被监测病况进展的对象的胃粘膜样品)时执行以下步骤：(a)确定样品中rec8mrna、rec8蛋白的量或浓度；(b)将该量或浓度与标准对照值进行比较；和(c)提供输出，其指示对象中是否存在胃癌，或对象是否处于发展成胃癌的风险中、或者对象的胃癌状况中是否存在变化(即恶化或改善)。在其他情况下，在已经执行步骤(a)并且已经将来自(a)的量或浓度输入到装置中之后，本发明的装置或系统执行步骤(b)和(c)的任务。优选地，装置或系统是部分或全自动的。实施例以下实施例仅作为说明提供，而不作为限制。本领域技术人员将容易认识到，可以改变或修改各种非关键参数以产生基本上相同或相似的结果。实施例1：rec8作为预后和非侵入性诊断标志物引言在先前的研究中，鉴定了在胃癌中受启动子甲基化调控的新型肿瘤抑制基因rec8(1)。rec8在胃肿瘤组织中被频繁甲基化，并且高甲基化水平与胃癌患者的缩短的生存期有关。作为胃癌的预后预测的新生物标志物，rec8启动子甲基化检测在指导治疗中具有重要的临床应用价值。指标量化dna甲基化最常用的方法是常规的亚硫酸氢盐基因组测序(bgs)方法，该方法也被应用于我们以前的rec8研究中。然而，bgs方法繁琐(亚硫酸盐处理、pcr、sanger测序和测序色谱图分析)，并且需要高质量的dna，因此不能直接用于临床环境。在这项研究中，开发了用于定量rec8甲基化的灵敏且方便的方法，通过分析癌症基因组图谱(tcga)数据和涉及亚硫酸氢盐处理和qpcr的实验程序来很好地选择靶区域。通过该新方法很好地验证了预后预测的潜力。最重要的是，该新方法足够灵敏，可以检测血浆样品中甲基化的rec8。进一步显示，血浆样品中甲基化的rec8启动子的检测可以用作诊断胃癌的非侵入性方法。这种新方法对于诊断/筛查和预后的直接临床实施来说足够灵敏和方便。材料和方法人体组织和血浆样品于1999-2006年在广州中山大学附属第一医院，以及于2005-2013年在香港中文大学威尔斯亲王医院收集胃癌组织样品。收集在edta管中的血液样品在4℃以3,000rpm(1,600g)离心15分钟。将上层血浆转移到1.5ml管中，并在4℃以13,000rpm(16,000g)离心15分钟。然后将血浆转移到2ml小瓶中，并在-80℃储存直到dna提取。所有患者都给出参与这项研究的知情同意。本研究经中山大学临床研究伦理委员会和香港中文大学伦理委员会批准。dna提取和亚硫酸氢盐转化使用qiaampdna微型试剂盒(qiagen,hilden,德国)提取来自原发胃癌组织的基因组dna。使用qiaampdna血液微型试剂盒(qiagen)从血浆样品(400μl)中提取无细胞dna。按照制造商的说明，使用ezdnamethylation-goldtm试剂盒(zymoresearchcorp，irvine，ca)对dna样品(来自组织样品的500ng或来自血浆样品的20μl)进行亚硫酸氢盐修饰。亚硫酸氢盐基因组测序(bgs)进行bgs以评估甲基化状态。用2μl亚硫酸氢盐转化的dna进行pcr扩增。使用methprimer(网站：urogene.org/methprimer/index1.html)设计bgs的引物。bgs引物的核苷酸序列如下：正向-gtaaaatttttatgattggtttgttg(seqidno:9)；反向-cccctaaaccttacactaact(seqidno:10)。使用pcr产物的直接sanger测序来评估多个cpg位点处的甲基化水平。将甲基化的比例计算为每个位点处的胞嘧啶与胞嘧啶和胸腺嘧啶总和的峰值比。引物和探针的设计基于亚硫酸氢盐转化的dna模板手动设计引物和探针序列，其中靶序列是由illuminainfiniumhumanmethylation450(hm450k珠阵列)的cg06351481覆盖的最密集的甲基化区域。使用工具primerexpressv3.0(appliedbiosystems,fostercity,ca)测试引物和探针序列，以确定tm、gc含量和可能的二级结构。与常规bgs引物不同，在正向引物中包括简并位点以覆盖甲基化的和未甲基化的等位基因；简并位点不接近引物的3'末端。两种探针被设计成特异性靶向甲基化的和未甲基化的等位基因。如blast搜索所证实，引物-探针组特异性检测我们的靶标，而不是任何其他已知序列。每个探针携带5'报告染料fam(6-羧基荧光素)或vic(4,7,2'-三氯-7'-苯基-6-羧基荧光素)和3'小沟区结合剂。由invitrogen(carlsbad,ca)合成引物和水解探针。下表列出了引物和探针的核苷酸序列。通过pcr产物的直接sanger测序证实了pcr扩增特异性。表1.本研究中使用的核苷酸序列名称序列(5’->3’)正向gaggaaatttttaattaygtgttggt(seqidno:11)反向tttaaaaattcccaaccttaccc(seqidno:12)m-探针tgtgattcgcgtttatttttaataat(seqidno:13)u-探针tgtgatttgtgtttatttttaataatgttagtat(seqidno:14)定量pcr(qpcr)在采用粘合密封的microampfastoptical96孔反应板(appliedbiosystems)中，在含有0.3μm各引物、0.1μm甲基化的探针和0.2μm未甲基化的探针的aceqqpcrprobemastermix(vazyme，南京，中国)的20μl反应系统中进行qpcr扩增。abiquantstudio序列检测系统的热循环仪参数为：95℃10min和(95℃15s，55℃30s，72℃30s)×45个循环。在每个实验中包括阳性/参考对照和两个阴性对照(未转化的dna和h2o)。每个样品一式三份进行测量。使用序列检测软件(appliedbiosystems)分析qpcr数据，手动设置阈值＝0.015和所有样品的自动基线。如果任何阴性对照的cq值<42或者阳性对照的检测失败，则实验被取消资格。评分算法采用两种评分算法来评估甲基化水平：1)dq评分＝幂(2,-cqm)/幂(2,-cqu)，以及2)rq评分＝幂(2,-cqm)/[幂(2,-cqm)+功率(2,-cqu)]。dq评分范围从0到∞，而rq评分范围从0到1。统计分析视情况而定，将数值全部表示为平均值±sd或中位数(四分位距[iqr])。通过wilcoxon符号秩检验或mann-whitneyu检验确定特定细菌丰度的差异。使用cutofffinder工具(网站：molpath.charite.de/cutoff/)确定最佳截断值，并进行生存显著性分析(17)。使用受试者工作特征(roc)曲线评估甲基化的rec8在辨别胃癌中的诊断价值。使用非参数方法进行roc下面积的成对比较(2)。所有测试均由graphpadprism6.0(graphpadsoftwareinc.，sandiego，ca)或spss软件v17.0(spss,chicago,il)完成。以p<0.05为统计学意义。结果选择用于靶向定量的cpg位点典型的cpg岛存在于rec8的启动子区域(通过参考转录起始位点的-8～1,160)(图1a)。根据以往通过以组织样品上cpg岛为目标的常规bgs方法的定量，在胃肿瘤组织中的rec8的启动子甲基化水平明显高于非肿瘤胃组织中的rec8的启动子甲基化水平(p<0.0001)(图1b)。该水平如此高使得它可以很好地将肿瘤与非肿瘤组织区分，其roc曲线下面积为0.9866；这推断，血浆样品中甲基化的rec8的检测可以作为胃癌的非侵入性诊断生物标志物。为了选择最佳靶位点以快速定量甲基化水平，在癌症基因组图谱(tcga)研究中所测试的398个胃肿瘤样品中，检查了rec8的cpg岛上的illuminainfiniumhumanmethylation450(hm450k)阵列数据。发现与其他位点相比，由探针cg06351481所覆盖的位点以最高水平被甲基化(图1c)。因此，以cg06351481周围区域为目标设计基于探针的qpcr测定。用于定量rec8甲基化的新qpcr方法的良好性能采用双重策略用于靶向所选cpg位点的引物-探针设计，其中一对通用引物不结合cpg区域，而两种探针分别结合所选靶标的甲基化的和未甲基化的等位基因(图2a)。如通过电泳显示，引物对特异而有效地扩增来自亚硫酸氢盐修饰的dna(mdna)模板中的靶标区域，在qpcr检测期间通过来自两种探针的不同荧光信号来区分甲基化和未甲基化的等位基因(图2b和2c)。尽管可以从高浓度(mdna模板的10倍)的非亚硫酸氢盐转化的dna扩增非特异性扩增子，但通过qpcr检测不到来自探针的信号。因此，qpcr定量不会受由不完全亚硫酸氢盐处理所导致的未转化dna残余物的干扰。而且，荧光信号反映了mdna模板的质量；从不合格的样品将检测不到信号或检测到低信号，而一个或两个信号较早显示出具有更多合格的mdna模板。通过qpcr评分和常规bgs的甲基化定量之间的良好相关性为了评估qpcr定量和常规bgs之间的相关性，通过混合由bgs确认的完全甲基化的和完全未甲基化的样品来制备一系列标准模板。两种算法被应用于甲基化评分。通过δcq(deltacq)方法的dq评分显示范围从0(对于未甲基化的样品)到∞的更宽分布，并且rq评分表示范围从0至≤1的相对甲基化水平。标准模板上的结果显示，dq评分显示出与甲基化百分比的自然对数相关性(r2＝0.9693；p<0.0001)，而rq评分与甲基化百分比的线性相关性(r2＝0.9909；p<0.0001)(图3)。因此，可以直接将这两种qpcr评分用于表示甲基化水平。验证rec8甲基化的qpcr定量为了验证定量rec8甲基化的新qpcr测定的性能，在胃癌细胞系上进行qpcr测定。结果显示对于具有完全甲基化的rec8启动子的细胞的rq评分>0.7，对于部分甲基化的snu1细胞和未甲基化的ges-1细胞的评分低(图4a)；通过qpcr扩增子的直接sanger测序证实了这些，代表性的色谱图如图4b所示。在来自胃癌(gc)患者的成对的肿瘤样品和相邻非肿瘤样品以及来自非gc对象的胃组织中，使用新qpcr测定进一步评估rec8的启动子甲基化水平。结果显示，在胃肿瘤中rec8以显著高于在两个群组的相邻非肿瘤组织中的水平被甲基化(图5a)。此外，与正常胃粘膜相比，在胃肿瘤和相邻非肿瘤组织中rec8启动子均以显著更高的水平被甲基化(图5b)。通过新的qpcr方法定量的rec8启动子甲基化水平很好地区分了胃肿瘤组织与非gc胃，其中roc曲线下面积为0.9177(p<0.0001；图5c)。这些结果很好地验证了通过常规bgs方法的先前发现，并推断了新qpcr测定的应用价值。使用新qpcr方法对rec8甲基化定量以用于预后预测发明人使用常规bgs方法的先前研究已经显示，甲基化的rec8可以作为胃癌患者的预后生物标志物，其高甲基化水平与胃癌患者的缩短的生存期显著相关。为了评估新qpcr方法在预后预测中的应用价值，使用该新方法对121个胃肿瘤组织进行了qpcr定量并有随访数据。qpcr评分显示，rec8的高甲基化评分与胃癌患者的缩短的生存期显著相关(p＝0.036；图6)。这个结果表明，更方便的qpcr方法适合取代常规的bgs方法用于胃癌的预后预测。使用新qpcr方法对rec8甲基化定量以用于非侵入性诊断由于组织样品中rec8的甲基化水平很好地区分了胃肿瘤与正常胃，所以预计在无细胞循环肿瘤dna中的甲基化rec8的检测可以作为胃癌的新诊断性生物标志物。为了检验该假设，在来自63名胃癌患者和33名非癌症对照对象的血浆样品中，使用新qpcr方法进行无细胞甲基化rec8的定量检测。结果显示，在来自胃癌患者的血浆样品中rec8甲基化水平显著高于来自对照对象的血浆样品中rec8甲基化水平(图7a)。在血浆中的甲基化的rec8水平显著区分了胃癌患者与对照对象，其roc下面积为0.813(p<0.001)。在使灵敏度和特异性总和最大化的最佳截断值时，甲基化的rec8诊断胃癌患者的灵敏度为74.6％，特异性为81.8％(图7b)。因此，血浆中甲基化的rec8可以用作胃癌的非侵入性诊断的生物标志物。讨论利用新开发的基于qpcr的方法，可以将rec8甲基化的定量检测应用于胃癌的预后预测以及非侵入性诊断。可以将靶向rec8启动子中的精心挑选区域的良好设计的引物-探针组以及经过良好优化的方案直接商业化为用于靶向定量检测来自不同来源(组织、血浆/血清、血液、粪便、尿液等)的dna样品中的rec8的试剂盒。在tcga研究中通过hm45k甲基化阵列对其他癌症类型的甲基化数据进一步分析揭示，rec8不仅在胃肿瘤组织中被异常甲基化，而且在一些其他癌症样品(如肝癌和结肠直肠癌)中也被异常甲基化(图8)。尽管对其他癌症类型的rec8甲基化的定量检测的预后预测和诊断应用价值值得进一步检查，但本文描述的定量检测rec8甲基化的新方法在其他临床环境中具有广泛的应用。为了所有目的，在本申请中引用的所有专利、专利申请和其他出版物(包括genbank登录号)通过引用整体并入本文。引物序列引物和探针序列参考文献1.yuj,liangq,wangj,wangk,gaoj,zhangj,zengy,chiupw,ngek,sungjj.rec8functionsasatumorsuppressorandisepigeneticallydownregulatedingastriccancer,especiallyinebv-positivesubtype.oncogene2017；36:182-193.2.delonger,delongdm,clarke-pearsondl.comparingtheareasundertwoormorecorrelatedreceiveroperatingcharacteristiccurves:anonparametricapproach.biometrics1988；44:837-45.序列表<110>香港中文大学(thechineseuniversityofhongkong)<120>作为癌症生物标志物的肿瘤抑制基因rec8<130>18c11067cn<150>us15/600,366<151>2017-05-19<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2253<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1atctaatgaggagcgaggtgcggtgccccgaagcgctcgcttcccgcggtgcgatctagt60cctgcagtaggcggcccggggccacaccgcggccgcccaagccagtgcaaggcccagggg120cctgacatcgctcccagcgctcgaggaccgaggcctgctgtggaggacaccgtgctccct180cgggacctgctctggattccggcccggacgtccccttggagctctgcatctccaacctgg240aacccaacccagaagtctcaagtttgacgcatcacgtggcgtgcggatccactgagggtc300cacagagaggggcgcccatctcctgcgtctcagttatcctggtgttgggaattctgtgcc360ctaaagaattccgactcagatccgaacggggatctggtggaatcgagggtgaaagaccag420agggacaatgttctactatcccaacgtgcttcagcgccacaccggctgctttgccaccat480ctggctggcggcgactcgcggcagccggttggtgaagcgcgaatacctgagggtgaatgt540ggtgaaaacctgcgaggaaatcctcaattacgtgctggtacgagtgcaacccccgcagcc600cggcctgccgcggccccgcttctccctctatctctcagcccaacttcagatcggtgtgat660ccgcgtctattctcaacaatgccagtacctcgtggaggacatccagcacatcttggagcg720cctccaccgtgcccagctgcagatccgaatagatatggagactgagctacccagcctgct780gcttcctaaccacctggccatgatggagaccctagaagatgctccagatcccttttttgg840gatgatgtctgtggatcccagacttcctagtcctttcgatatccctcagattcgacacct900cttagaggctgcaatcccagagagagttgaagagatccctcctgaagttcctacagagcc960cagggagccagagaggattccggtcactgtgctgccacctgaggccatcacgatcctgga1020ggcagagcccatacggatgctggagattgagggtgaacgggagctcccagaggtcagccg1080ccgagaactggacctgctgatcgcagaggaagaagaagctatcttgttagaaatcccgcg1140gctcccacctccagctcctgcagaggtggaaggaataggagaggcactgggtcctgagga1200gctgaggctgacaggctgggaacctggggccctactcatggaggtgacccccccggagga1260gctgcgtctgccagccccacccagcccagagaggaggcccccagtccccccacctcctcg1320ccgccgccgtcgtcgccggttactgttctgggacaaggagactcagatctccccggagaa1380attccaggaacaactgcaaaccagagcccactgctgggaatgtcctatggtgcagccgcc1440cgagaggaccatcagaggccctgcggagttgttcagaaccccaactctctctggctggct1500accccctgaactactgggtctctggacccattgtgcccagccacccccaaaagccctcag1560gcgagagctgcctgaggaggcagccgctgaggaggaaaggagaaagattgaagttccaag1620tgagattgaggtcccgagggaggccctggagcccagtgttccccttatggtgtctttaga1680gatctccctagaggcagctgaagaggagaagtcccgcatcagcctcatcccaccagaaga1740acggtgggcctggcctgaggtggaggcgccagaagctcctgcattgcccgtggtgcctga1800actccctgaggtgcccatggagatgcctttggtgctgcccccagagctcgagctgctctc1860actggaagcagtgcacagggcagtggcactggagctgcaggctaacagggagcccgactt1920cagcagcctggtgtcacctctcagcccccgcaggatggctgcccgggtcttctacctgct1980cctggtgctctcagcgcaacagattcttcacgtgaaacaagaaaagccatatggtcgcct2040cctgatccagccggggcccagattccactgaggttagagtccatttacaaagctgccagg2100aaaccggccacttctagtaaaccacgtcgtgcctcactgggtcctgcttacctcatttct2160gaatgtgcatttccagccttcttgctctcagagctattgttcaagcagaaaacaagctgc2220ttttattacagtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2253<210>2<211>1644<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>2atgttctactatcccaacgtgcttcagcgccacaccggctgctttgccaccatctggctg60gcggcgactcgcggcagccggttggtgaagcgcgaatacctgagggtgaatgtggtgaaa120a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