本发明涉及一种高效表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程
技术领域：
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背景技术：
磷脂酶d属于磷脂酰二酯合成酶类，具有该家族的明显特征，即含有两个间隔出现的h(x)k(x)4d(h代表组氨酸；k代表赖氨酸；d代表天冬氨酸；x代表任意氨基酸)保守序列。它可以催化底物相中的磷脂类物质和水相中的亲核供体发生类似于酯缩合的转酯反应，是合成磷酯酰丝氨酸，磷脂酰肌醇等稀有磷脂的良好工具酶一。利用磷脂酶d具有高度专一性的特点，对现有来源广泛的粗品磷脂进行转化和改性，可以制备一些稀有磷脂，在医药及食品保健品领域具有很大的应用价值。目前，磷脂酶d主要通过从大豆等植物或动物脑中分离提取得到，生产成本高，环境污染代价大，售价昂贵，不能满足市场需求；现有的一些通过生物发酵大量获得真核来源的尝试，结果都不理想，这些真核在发酵生产时，要么生成的酶活性低，要么生成的酶呈现与膜结合的状态。因此，急需找到一种可大量制备磷脂酶d的方法。放线菌来源的内源性磷脂酶d和植物以及真菌来源的磷脂酶d相比，除具有较高的反应活性外，更兼具转磷脂酰底物选择性高，催化结构最紧密以及在有机介质稳定性高等方面的优势，更适合应用于工业中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成。目前，该来源的磷脂酶d在大肠杆菌，毕赤酵母，解脂耶氏酵母，链霉菌中表达均有报道。有研究表明在大肠杆菌中磷脂酶d蛋白易形成包涵体，且磷脂酶d对大肠杆菌的生长有抑制作用，导致分泌量很低；而酵母为真核生物，发酵周期通常较长，且在酵母中磷脂酶d的酶活和蛋白表达量均不显著，并不适用于工业化生产；虽然链霉菌的克隆表达系统已经比较成熟，但相比于原核表达系统，外源基因的引入相对复杂，部分链霉菌还存在一定的限制修饰系统，导致转化率过低，且链霉菌生长过程较为复杂且易发生遗传突变，成熟的表达系统数量也有限，以上瓶颈限制了链霉菌表达系统的广泛应用。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，产品被fda认证为“generallyregardedassafe”(gras)安全级别，且具有清晰的生理和遗传背景，我们尝试以枯草芽孢杆菌为表达宿主来表达磷脂酶d并运用基因工程手段构建一种适用于工业生产的能大量生产磷脂酶d的重组枯草芽孢杆菌。但是，链霉菌属于放线菌目的一科，枯草芽孢杆菌则属于芽孢杆菌属的一种，两者属于不同的菌种，遗传上可能存在一些隔阂，导致链霉菌来源的目的基因可能并不能被枯草所识别。因此，在枯草芽孢杆菌中表达磷脂酶d存在一定的难点；如何基因工程手段提高磷脂酶d的表达量也仍需进一步的研究。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种高效表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌，实现了放线菌来源的内源性磷脂酶d在枯草芽孢杆菌中的高效表达。本发明工程菌生产得到的磷脂酶d活性可达25u/ml，在医药、食品、保健品领域具有很大的应用价值；同时，本发明工程菌采用的磷脂酶d是放线菌来源的内源性磷脂酶d，其具有高反应活性、高转磷脂酰底物选择性以及高有机介质稳定性，且催化结构最紧密，更适用于工业化生产中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成。本发明的技术方案如下：本发明提供了一种高效表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒；所述重组质粒包含融合基因以及表达载体；所述融合基因为磷脂酶d基因(pld)与枯草芽孢杆菌ɑ-淀粉酶信号肽基因(amye)融合后的pld-amye；所述表达载体为pma0911。在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酶d基因来源于链霉菌。在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酶d基因的核苷酸序列为seqidno.1。在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌ɑ-淀粉酶信号肽基因来源于枯草芽孢杆菌wb168。在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌ɑ-淀粉酶信号肽的核苷酸序列为seqidno.2。在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌宿主菌株为枯草芽孢杆菌wb600菌株。在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒为rbs及spacer区进行过优化的重组质粒；所述优化是指将重组质粒的rbs及spacer区替换为翻译速率提升的rbs及spacer区；所述翻译速率是指rbs及spacer区的mrna翻译成蛋白质的速率。在本发明的一种实施方式中，所述优化为将重组质粒pma0911-pld-amye的rbs及spacer区替换为较原始rbs及spacer区翻译速率提高3倍的rbs及spacer区。在本发明的一种实施方式中，所述优化为将重组质粒pma0911-pld-amye的rbs及spacer区通过pcr进行全质粒扩增替换为较原始rbs及spacer区翻译速率提高3倍的rbs及spacer区。在本发明的一种实施方式中，所述优化后的rbs及spacer区的核苷酸序列为seqidno.3。本发明提供了上述高效表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌制备得到的磷脂酶d。本发明提供了上述高效表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌或上述制备得到的磷脂酶d在制备磷脂以及磷脂衍生物方面的应用。本发明提供了一种高效表达磷脂酶d的方法，此方法为使用上述枯草芽孢杆菌工程菌为生产菌株。在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将重组枯草芽孢杆菌接种于接种于种子培养基中，于35～37℃、180～200rpm下培养至对数生长期，作为种子液，再将种子液接入到发酵培养基中，于35～37℃、180～200rpm条件下培养36h。在本发明的一种实施方式中，所述将种子液接入发酵培养基的接种量为3％。在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基含有胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l。在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基中含有50μg/ml的卡那抗生素。在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有甘油15g/l，胰蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，磷酸二氢钾2.31g/l，三水磷酸氢二钾16.42g/l。在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中含有50μg/ml的卡那抗生素。本发明提供了上述高效表达磷脂酶d的方法制备得到的磷脂酶d。本发明提供了上述高效表达磷脂酶d的方法或上述制备得到的磷脂酶d在制备磷脂以及磷脂衍生物方面的应用。有益效果：(1)本发明工程菌成功实现了链霉菌来源的磷脂酶d在枯草芽孢杆菌中的胞外异源分泌表达；(2)本发明工程菌生产得到的磷脂酶d活性可达25u/ml，在医药、食品、保健品领域具有很大的应用价值；(3)本发明工程菌采用的磷脂酶d是放线菌来源的内源性磷脂酶d，其具有高反应活性、高转磷脂酰底物选择性以及高有机介质稳定性，且催化结构最紧密，更适用于工业化生产中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成；(4)使用本发明工程菌生产磷脂酶d能够避免酶形成包涵体，有一定应用前景；(5)磷脂酶d是一类重要的跨膜信号转导酶类，其能通过磷酰基转移作用催化磷脂质的极性头部基团的转移，而pld的磷酰基转移作用非常重要，它可以将磷脂酰胆碱(pc)催化合成磷脂酰乙醇胺(pe)、磷酯酰丝氨酸(ps)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰甘油(pg)等在自然界稀有的磷脂质，这些稀有磷脂质在食品、化妆品、药品中十分重要，尤其是磷酯酰丝氨酸，其只占总磷脂含量的2％-10％左右，但保健功能显著，能改善老年人阿尔茨海默病，提高认知力，抗抑郁，抗压抑等作用，本发明则构建了一株可用于工业化生产磷脂酶d的食品级菌株，为大量生产磷脂酶d、催化合成稀有磷脂提供了可能。附图说明图1：重组质粒结构图；图2：从基因组上获得的信号肽及从质粒上获得的目的基因的电泳图；其中，第一行1-7分别为从bacillussubtilis168基因组上通过pcr方式获得的7条信号肽(amye、apre、npre、wapa、wpra、lipa和ywbn)的电泳图，第二行从1-7分别为与对应信号肽相融合的目的基因的电泳图，m为核酸marker；图3：携带采用不同信号肽构建的重组质粒的重组菌株的发酵上清液的酶活测定结果；其中，1-7分别对应含信号肽amye、apre、npre、wapa、wpra、lipa和ywbn的菌株，8为带目的基因原始信号肽的菌株，9为不含目的基因的菌株，10为目的基因前无任何信号肽的菌株；图4：不同重组质粒的图谱；图5：携带采用不同载体构建的重组质粒的重组菌株的酶活测定结果；其中，stti代表含有质粒pstop-pld-amye的菌株，st2代表含有质粒pma0911-pld-amye的菌株，st3代表含有质粒pp43nmk-pld-amye的菌株；方框，圆圈，三角折线图分别代表菌株stt1，st2和st3的生长情况；图6：携带采用不同载体构建的重组质粒的重组菌株发酵上清液的westernblot分析；其中，泳道1.2.3分别为重组质粒pstop-pld-amye，pma0911-pld-amye，pp43nmk-pld-amye构建的重组菌株发酵上清液的westernblot分析，m为蛋白marker；图7：采用rbs及spacer区优化后的重组质粒构建的重组菌株的酶活测定结果；其中，1.2.3.4.5号菌株分别对应原始菌株，及翻译速率分别提高3倍，6倍，9倍，12倍的rbs及spacer区优化构建的重组菌株酶活测定结果。具体实施方式以下实施例和对比例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例涉及的实验材料和试剂如下：1、菌株与载体枯草芽孢杆菌wb600，枯草芽孢杆菌wb168，质粒pp43nmk，质粒pma0911，质粒pstop2、酶与试剂盒高保真primestarmaxdna扩增酶购自takara公司，质粒提取，胶回收，限制性内切酶，试剂盒购自上海生工公司。下述实施例涉及的培养基如下：种子培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。发酵培养基(g/l)：甘油15，胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸二氢钾2.31，三水磷酸氢二钾16.42。下述实施例涉及的检测方法如下：酶活测定方法：100μl反应液包括：0.5％(w/v)蛋黄卵磷脂，0.1％(w/v)曲拉通x-100，40mmtris-hcl(ph7.4)，100μl发酵上清液(50x)，37度反应10min。向其中加50μl反应终止液，包括：50medta，200mtris-hcl(ph7.4)，震荡混匀，95°加热10min。冷却至室温后，向反应体系中再加入500μl反应液，包括：20mm磷酸钾缓冲液(ph7.4)，21mm苯酚，0.60mm4-att，5μl10u/ml胆碱氧化酶，3μl10u/ml过氧化物酶，混匀，37度反应2h、a505下检测吸光值。实施例1：构建出发质粒根据ncbi上公布的链霉菌(streptomycesracemochromogenes，genbank：ab573232)中的磷脂酶d基因(pld)进行密码子优化，合成此优化后的基因，并通过酶切连接方式连接到质粒puc上，然后根据质粒ppuc-pld序列信息，设计引物序列为seqidno.4的2-f：5’-cggaattcgaattcgcatcacctacacctca-3’，与序列为seqidno.5的2-r：5’-cgggatccgtggtggtggtggtggtgtacgcctggcaaaggcct-3’，(其中横线部分分别为引入的ecori和bamhi酶切位点)使用上述引物以质粒ppuc-pld为模板，扩增磷脂酶d编码基因(pld)。将质粒pstop与以上扩增基因片段分别经spei和bamhi双酶切后连接，构建重组质粒，双酶切验证及测序，确认出发质粒pstop-pld构建成功。实施例2：信号肽的选择将实施例1中构建的出发质粒pstop-pld出发质粒转入枯草芽孢杆菌wb600中，获得重组菌，将重组菌接种于含卡那抗生素50mg/ml的种子培养基中，于37℃、200rpm下培养对数生长期，作为种子液；再将种子液以3％的接种量转入到含卡那抗生素50ml/ml的20ml发酵培养基中，于37℃、200rpm条件下培养36h，将发酵液于4℃，8000r/min离心10min取上清得到磷脂酶d粗酶液，并测定粗酶液的酶活为3.1u/ml。再通过pcr在出发质粒上获得磷脂酶d基因，在枯草芽孢杆菌wb168基因组上获得7条信号肽的基因，分别将这七条信号肽与目的基因融合，并在融合片段两端加上酶切位点spei和bamhi，将七个融合片段和空载pstop分别用spei和bamhi双酶切，构建七个重组质粒：pstop-pld-amye，pstop-pld-apre，pstop-pld-npre，pstop-pld-wapa，pstop-pld-wpra，pstop-pld-lipa，pstop-pld-ywbn，分别导入枯草芽孢杆菌wb600中摇瓶发酵，比较这枯草芽孢杆菌wb600表达7个质粒与表达携带磷脂酶d内源信号肽、表达空质粒以及表达无信号肽质粒的情况下的酶活。(采用不同信号肽的质粒的图谱见图1，从基因组上获得的信号肽及从质粒上获得的目的基因的电泳结果见图2)上述7条信号肽分别为：核苷酸序列为seqidno.2的枯草芽孢杆菌ɑ-淀粉酶信号肽(amye)、核苷酸序列为seqidno.6的枯草芽抱杆菌碱性蛋白酶信号肽(apre)、核苷酸序列为seqidno.7的枯草芽抱杆菌中性蛋白酶信号肽(npre)、核苷酸序列为seqidno.8的枯草芽抱杆菌脂肪酶a信号肽(lipa)、核苷酸序列为seqidno.9的枯草芽孢杆菌细胞壁结合蛋白质前体物信号肽(wpra)、核苷酸序列为seqidno.10的tat信号肽(wapa)、核苷酸序列为seqidno.11的链霉菌内源性信号肽(ywbn)以及核苷酸序列为seqidno.12的磷脂酶d内源信号肽。酶活检测结果：含有重组质粒pstop-pld-amye的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为：11.3u/ml、含有重组质粒pstop-pld-apre的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为6.2u/ml、含有重组质粒pstop-pld-npre的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为10.3u/ml、含有重组质粒pstop-pld-wapa的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为7.6u/ml、含有重组质粒pstop-pld-wpra的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为5.9u/ml、含有重组质粒pstop-pld-lipa的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为5.7u/ml、含有重组质粒pstop-pld-ywbn的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为3.5u/ml，其中，含有重组质粒pstop-pld-amye的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活最高，较出发质粒提高了2.22倍。(携带采用不同信号肽构建的重组质粒的重组菌株的发酵上清液的酶活测定结果见图3)实施例3：质粒的选择通过pcr从pstop-pld-amye重组质粒上获取实施例2中筛出的最优信号肽amye与目的基因的融合片段，分别通过双酶切与质粒pp43nmk，pma0911连接。构建重组质粒pma0911-pld-amye，pp43nmk-pld-amye，其中质粒pp43nmk所选用酶切位点为kpni和smai，质粒pma0911所选用酶切位点为ecori和bamhi，比较分别含有三个重组质粒pstop-pld-amye，pma0911-pld-amye，pp43nmk-pld-amye的的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活。(不同载体选择质粒的构建见图4)酶活检测结果：含有重组质粒pstop-pld-amye的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为11.3u/ml、含有重组质粒pma0911-pld-amye的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为19.1u/ml、含有重组质粒pp43nmk-pld-amye的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为12.2u/ml，其中含有重组质粒pma0911-pld-amye的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活最高，较出发质粒提高了69.03％。(不同载体构建的重组菌株的酶活测定结果见图5，不同载体构建的重组菌株发酵上清液的westernblot分析见图6)实施例4：rbs及spacer区的优化将实施例3获得的最优质粒pma0911-pld-amye再进行rbs及spacer区的优化，分别选择翻译速率较原始rbs及spacer区提高3、6、9、12倍的四种组合，通过pcr进行全质粒扩增替换构建重组质粒pma0911-pld-amye-3、pma0911-pld-amye-6、pma0911-pld-amye-9、pma0911-pld-amye-12，比较分别含有五个重组质粒pma0911-pld-amye、pma0911-pld-amye-3、pma0911-pld-amye-6、pma0911-pld-amye-9、pma0911-pld-amye-12的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活。上述翻译速度是由rbscalculator在线预测软件对rbs及spacer区翻译速率进行分析得到的，结果见表1：表1rbs及spacer区翻译速率分析结果翻译倍数翻译初始速率(au)rbs及spacer区序列12661.39seqidno.1337959.34seqidno.3616885.61seqidno.14923013.77seqidno.151231535.83seqidno.16酶活检测结果：含有重组质粒pma0911-pld-amye的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为19.1u/ml、含有重组质粒pma0911-pld-amye-3的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为24.2u/ml、含有重组质粒pma0911-pld-amye-6的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为23.1u/ml、含有重组质粒pma0911-pld-amye-9的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为18.4u/ml、含有重组质粒pma0911-pld-amye-12的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活为16.8u/ml，其中，含有重组质粒pma0911-pld-amye-3的枯草芽孢杆菌wb600的发酵上清液的酶活最高，较出发质粒提高了26.7％。(rbs及spacer区优化构建的重组菌株的酶活测定结果见图7)实施例4：发酵生产磷脂酶d将实施例3获得的含有最优质粒pma0911-pld-amye-3的枯草芽孢杆菌wb600接种于含卡那抗生素50μg/ml的种子培养基中，于37℃、200rpm下培养对数生长期，作为种子液；再将种子液以3％的接种量转入到含卡那抗生素50μg/ml的20ml发酵培养基中，于37℃、200rpm条件下培养36h，将发酵液于4℃，8000r/min离心10min取上清得到磷脂酶d粗酶液，测得酶活为24.2u/ml。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。序列表<110>江南大学<120>一种高效表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌<160>16<170>patentinversion3.3<210>1<211>1518<212>dna<213>人工序列<400>1atggaattcgcatcacctacacctcatctggatagcgtcgaacaaacactgagacaagtg60tcaccgggacttgaaggatcagtttgggaacgcacagcaggcaattcacttggagcatca120gcaccaggaggatcagattggcttctgcaaacaccaggttgttggggagatccttcttgc180acagatagaccgggatcaagacgtctgctggataaaacacgccaggatatcgcacaagcg240agacaaagcgtcgatattagcacactggcaccttttccgaacggaggatttcaggatgca300gttgttgcaggcctgaaagaagcagttgcgaaaggcaatagactgcaagtcagaatttta360gtcggagcagcgccgatttatcatgcaaacgtcattccgagctcatatcgcgatgaaatg420gtcgcaagattaggaccggcagcagcaaacgttacacttaacgtcgcaagcatgacgaca480agcaaaacgggcttctcttggaatcatagcaaactggtcgtcgttgacggcggaagcgtc540attacaggcggcattaatagctggaaggacgactatctggatacagcgcatccggttaac600gacgtcgatcttgcactttcaggaccagcagcaggatcagcaggaagatatctggatacg660ctttgggattggacttgcagaaacaagagctcttggagcagcgtttggttcgcaagctca720aataacgcaggttgcatgcctacattacctagaccagcagcaccagcaggaggaggagac780gttccagcattagcagttggaggactgggagttggcattagacaaagcgatccggcatca840gcatttaaaccggtcttacctacagcaccggatactaagtgcggcattggagttcatgat900aacacgaacgcggatcgcgattacgatacagtcaatccggaagaaagcgcgcttagagca960ctggttgcatcagcgaatagccacgtcgaaattagccagcaggatctgaacgctacatgc1020cctcctttaccgagatacgatatccgcctgtacgatacactggcagcaaaactggcagca1080ggcgttaaagtcagaattgtcgtctcagatccggcaaatagaggagcagttggatcagac1140ggctatagccagatcaaaagcctgaatgaagtctcagacgcactgagaggaagacttaca1200gcactgacaggcgacgaaagaacaagcaaagcagccatgtgccagaaccttcaactggca1260acgtttcgcgcaagcgataaagcaacttgggcagacggaaaaccttacgcacagcatcat1320aaactggtcagcgtcgacgatagcgcattttacatcggcagcaagaacctgtatccgtct1380tggctgcaggactttggatacgttgtggaatcaccggcagcagcaaatcaacttaaagat1440agcctgcttgcacctcagtggaaatatagccaggcgacagcgacatacgactatgcaaga1500ggcctttgccaggcgtaa1518<210>2<211>99<212>dna<213>人工序列<400>2atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgct99<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列<400>3ctaaaggaggttattat17<210>4<211>31<212>dna<213>人工序列<400>4cggaattcgaattcgcatcacctacacctca31<210>5<211>44<212>dna<213>人工序列<400>5cgggatccgtggtggtggtggtggtgtacgcctggcaaaggcct44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