一种制备cfDNA参考品的方法与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及基因检测、临床检验领域。
背景技术：
循环游离dna(cfdna)是指凋亡或坏死的细胞进入血管中所释放的dna片段，多见于由坏死的肿瘤细胞分泌，主要存在于细胞外的环境中，呈游离状态。主要存在于血浆或血清、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、尿液、滑膜液等体液中。游离dna因为检测方便快捷，而且具非侵入性等特点，那么，随着肿瘤分子生物学的深入研究，血液中游离dna结合各类分子生物学检测技术，有望成为具有一定敏感性及高特异性的肿瘤临床诊断方法。肿瘤细胞死亡后将释放自身的dna片段到血循环中，即循环肿瘤dna(ctdna)。多项研究显示，血液中的循环肿瘤dna可以作为一类特异性的分子标志物用于肿瘤的检测和预后监测。检测游离dna中肿瘤特异性的基因突变具有较好的临床价值，如egfr、kras和tp53基因等这些在多种类型肿瘤中具有高突变频率的基因其检测对肿瘤的早期诊断具有重要的临床意义。肿瘤cfdna片段大小在100-200bp，主要长度在166bp左右，浓度低。随着液体活检的应用，越来越多的检测试剂盒检测的样本类型为cfdna，因此模拟cfdna样本的短片段dna制备工艺变得尤为重要。此类短片段dna可以作为检测试剂盒的参考品和质控品，也可以作为一种标准品用于检测不同检测方的能力测试。技术实现要素：本发明公开了一种将大片段基因组dna制备成短片段dna的方法，该短片段dna更接近和模拟了人血浆cfdna片段大小的特点，更适合用作人血浆cfdna的参考品。一方面，本发明公开了一种制备cfdna标准品或参考品的方法，包括以下步骤：将从细胞中提取的基因组dna进行超声打断处理400秒至480秒。进一步，上述方法还包括，超声负载率为30％至50％，以形成150bp至200bp大小的dna片段。在一个具体实施例中，上述方法中使用covarisle220r超声打断仪进行超声。在一个具体实施例中，covarisle220r超声打断仪的设置参数为以下参数的至少一种：峰值入射功率值为450；温度为7℃；水位值为6。在一个实施例中，上述方法中所述基因组dna的质量为1μg至5μg的任一值，体积可以为130μl。在一个实施例中，所述细胞为肿瘤细胞，优选为h1975、a549、pc9中的至少一种。在一个实施例中，上述方法还包括以下步骤：将来源于h1975、a549、或pc9通过超声打断形成的dna片段进行掺比，制备突变位点l858r、t790m、exon19del均为相同突变比例的cfdna标准品或参考品，其中突变比例优选为0.1％、5％、或20％。在一个具体实施例中，所述超声打断处理时间优选为400秒至450秒，例如400秒至440秒、410秒至430秒、415秒至425秒、更优选为420秒。在一个具体实施例中，所述负载率优选为20％至40％，例如25％至35％，更优选为30％。在一个具体实施例中，所述基因组dna的质量优选为5μg。在一个实施例中，在上述方法中，超声后dna片段的主浓度峰在150-200bp之间，dna拷贝数的理论回收率60％以上。另一方面，本发明还提供了如前任一所述的方法制备的cfdna标准品或参考品。在一个实施例中，所述的cfdna标准品或参考品包括150bp至200bp大小的dna片段，所述cfdna标准品或参考品进一步优选包括药学上可接受的dna缓冲液，例如tris-hcl缓冲液、te缓冲液等；上述cfdna标准品或参考品在使用时，还可与血液基质例如血清、血浆、或全血进行混合后使用，其中血液基质可以是天然的，也可是人造的。另一方面，本发明进一步公开了上述cfdna标准品或参考品在制备用于定量和定性检测体液中游离dna或其基因突变中产品的应用，所述体液包括血浆、血清、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、尿液、滑膜液中的至少一种。在一个实施例中，上述cfdna标准品或参考品中还包括作为基质的体液，所述体液包括血浆、血清、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、尿液、滑膜液中的至少一种，其中体液可以是天然的，也可以是人造的。有益效果本发明找到了合适的超声波片段化基因组dna的条件，制备的短片段dna，更接近和模拟了人血浆cfdna片段的特点、更适合用作人血浆cfdna的参考品。另外，该方法操作简单、重复性好、回收率高。附图说明图1示出pc9超声打断后2100图谱。具体实施方式下面将通过具体描述，对本发明作进一步的说明。除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中，单数形式“一个”、“该”包括复数对象，除非上下文另外清楚规定。定义如本文所用的术语“基因组dna”、“gdna”可互换，是指细胞经过试剂盒提取得到的基因组dna，其中细胞可以是肿瘤细胞，也可以是其他来源的细胞，例如可以是pc6细胞。如本文所用的术语“循环游离dna”、“cfdna”可互换，是指凋亡或坏死的细胞进入血管中所释放的dna片段，包括由坏死的肿瘤细胞分泌，主要存在于细胞外的环境中，呈游离状态。主要存在于血浆或血清、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、尿液、滑膜液等体液中。如本文所用的术语“循环肿瘤dna”、ctdna可互换，是指肿瘤细胞死亡后将释放自身的dna片段到血循环中。如本文所用的术语“校准品”、“标准品”、“对照品”可替换，是指标准物质，作为一种衡量标准，用于鉴定、检查、含量测定的标准物质。本文中所述的cfdna标准品是指在测定细胞外的环境中呈游离状态的dna的含量诸如基因突变量时的标准物质。如本文所用的术语“参考品”是指定性测定生物效价、生物活性的标准物质，作为疾病诊断的参考物质。如本文所用的术语“负载率”也称“负载比”，是指负载率指该变压器实际承担的负荷与其容量之比，本发明中指超声装置的变压器实际承担的负荷与其容量之比。实施例通过以下实施例进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。实施例1：短片段dna的制备方法通过超声打断仪(covarisle220r)处理细胞系pc9的gdna，进而得到随机打断的dna片段，对仪器相应的参数进行调整优化，经过大量繁杂的多因素参数优化工艺考察，进而使得随机打断的dna片段集中在100-200bp，最终确定优化后的一种主要工艺参数如下表：表1.一种主要工艺参数表采用上述参数，将pc9人肺癌细胞的dna基因组超声打断后，2100图谱显示超声后的dna短片段集中在0-300bp之间、主浓度峰在100-200bp之间(图1)。进一步，将样本总量5μg、样本体积130μl、反应时间420秒，负载因素30％条件下共进行4次重复实验，其中20180116-5μg130μl、pc95μg420s-1和pc95μg420s-2为其中的三次数据对比图，akj0.05(安可济公司的商业化标准品，通过酶切制备)和horizon分别为商业购买的cfdna标准品。实验结果显示，相比商业购买的cfdna标准品，本发明制备方法制备的产品，其重复性很好且也可以获得长度为100-200bp的短片段dna。实施例2超声打断时间的对比实验使用covarisle220r将细胞系基因组dna(pc9细胞)分别超声处理不同时间(例如360秒处理至480秒范围的任一时间)，其他参数如表1所示，比较目的片段的位置、百分比以及制备过程中回收率的不同，确定超声时间420秒时，gdna片段更接近cfdna大小。表2示出了相比horizon标准品和akj0.05，aglient2100方法获得的主浓度峰的片段大小存在156bp和184bp，超声时间420秒更接近cfdna大小，且80-200bp百分比为57％。而经过其他时间处理，例如超声时间360秒，其仅存在112bp和126bp的dna且没有主浓度峰2，其片段不符合cfdna大小；而超声时间480秒处理后，尽管产生152bpdna峰，但其浓度不及超声时间420秒高，且实际回收率偏低(表3)。因此，大于360秒处理至小于480秒的范围是制备cfdna标准品或参考品的合适参数，优选400秒至450秒的超声时间范围，最优选为420秒超声处理时间。表2不同时间处理aglient2100数据表3.不同时间处理ddpcr结果注释：所有样本超声处理后，均根据理论浓度稀释至4.125ng/μl，ddpcr上样体积为8μl，对应的理论拷贝数约为10000。最佳的超声打断处理时间，其对应的参数优选为样本处理量为1至5μg中的任一值，更优选样本处理量为5μg，样本体积为130μl。实施例3负载率(dutyfactor)的对比实验使用covarisle220r将细胞系基因组dna(pc9细胞)分别超声处理，负载率为10％至50％范围的任一时间，其他参数如表1所示，比较目的片段的位置、百分比以及制备过程中回收率的不同，最终确定了负载率为30％时，gdna片段更接近cfdna大小。表4示出了相比horizon标准品，aglient2100方法获得的主浓度峰的片段大小存在188bp，这个更接近cfdna大小，且80-200bp百分比为59％。而经过其他负载率处理，例如50％，其存在112bp和136bp的dna，片段不符合cfdna大小，试剂回收率也较低；而负载率为10％，仅存在139bp的主浓度峰(表5)。因此，负载率优选为大于10％至小于50％的任一值，更优选为20％至40％，最优选为30％。表4.不同负载率处理aglient2100数据表5.不同负载率处理ddpcr结果注释：所有样本超声处理后，均根据理论浓度稀释至4.125ng/μl，ddpcr上样体积为8μl，对应的理论拷贝数约为10000。使用不同负载率(10％至50％中的任一值)和不同处理时间(360秒至480秒中的任一值)进行排列组合，经过大量实验筛选(比较目的片段的位置、百分比以及制备过程中回收率的不同)，得到以下组合：1)dutyfactor30％，超声打断时间360秒；2)dutyfactor30％，超声打断时间420秒；3)dutyfactor50％，超声打断时间360秒；4)dutyfactor50％，超声打断时间420秒；其他参数如表1所示。比较目的片段的位置、百分比以及制备过程中回收率的不同，最终确定了负载率为30％时，超声打断时间为420秒，相比其他优选条件而言，gdna片段最接近cfdna大小。表6示出了相比horizon标准品，aglient2100方法获得的主浓度峰的片段大小存在168bp，这个更接近cfdna大小，且80-200bp百分比为59％，回收率相对也较高。表6.不同组合处理aglient2100数据表7.不同组合处理ddpcr结果注释：所有样本超声处理后，均根据理论浓度稀释至4.125ng/μl，ddpcr上样体积为8μl，对应的理论拷贝数约为10000。表8示出了不同条件处理下的对比，可见，dutyfactor为30％时，360秒打断回收率略高于420秒，但是420秒的2100图谱片段更集中，大小更接近与cfdna，因此最优的超声打断条件为5μg基因组dna，体积为130μl，超声打断时间为420秒，负载率为30％。表8.不同条件下的回收率对比实施例4细胞系基因组的超声上样量pc9基因组dna的量为1、2、3、4、5μg，其他参数参见表1所示。比较目的片段的位置、百分比以及制备过程中回收率的不同。表9.不同上样量处理aglient2100数据表10.不同上样量处理ddpcr结果注释：1～5μg样本超声打断后，没有固定稀释液终浓度，2100上样约为8ng。对比2100和ddpcr数据，总上样量的影响并不明显，但是上样量为5μg相对而言其实际回收率稍高。实施例50.1％、5％、20％的不同短片段dna突变比例制备使用本发明制备的短片段dna，通过ddpcr方法检测egfr突变位点(19del、t790m、l858r)，其中pc9细胞株是19del位点的阳性细胞系，h1975细胞株是t790m及l858r的阳性细胞系，a549细胞株为这三个位点的阴性细胞系，三株细胞系分别经超声打断后，将各自的阳性及阴性细胞系打断后的产物进行ddpcr定量，根据定量结果，再将其掺入人工血浆中，制备出egfr三个位点突变比例均为0.1％、5％、20％的参考品。gdna样本来源于细胞系gdna抽提(分别为h1975、pc9、a549)，采用商业化试剂盒(qiagen-51304，天根-dp304-02)对培养得到的细胞团进行抽提，并对其进行定量，将定量后的基因组dna分别稀释至终浓度为38.46ng/μl。将上述配制的溶液以130μl每孔，分装至超声8连管中，8连管用新的封口膜密封。密封好后将8连管放置在96孔金属超声板架上，放置在超声仪上，准备超声。超声条件参见表1所示。1.agilent2100检测1.1将超声后的样本稀释五倍，在agilent2100bioanalyzer平台，使用agilent-5067-4626试剂盒测量其片段大小分布。1.2按agilent2100的说明书操作。点样1μl上机检测，2100结果图无异常、片段集中在0-300bp。2.数字pcr定量实验经过超声打断后的阴阳性细胞gdna片段，需要经数字pcr进行定量，并根据定量后的结果配制成指定突变比例的参考品。2.1试剂配制表11.ddpcr检测反应试剂的配置主要组分体积(ul)终浓度2×微滴数字pcr反应预混液101×20×突变型(fam)检测反应液1900nm/250nm20×野生型(vic)检测反应液1900nm/250nmdna样本1-ntc7-终体积20-2.2热反应条件表12.ddpcr检测热反应条件2.3定量结果表12.ddpcr检测定量结果3.掺比制备根据上述ddpcr定量结果可知，打断后的细胞gdna经各个位点检测，既含有阳性也含有部分阴性，同时每个位点的阳性细胞gdna片段又是其他位点的阴性模板，综合考虑之后，根据ddpcr的定量结果(取均值后用于参考品制备)，固定t790m位点阳性模板的数量，通过调整其他位点的阴阳性模板数，分别以无核酶水及人工血浆作为介质，制备突变比例为0.1％，5％及20％的三种样本。详细的配制过程如下表：其中h1975-ult(1)、a549-ult(1)及pc9-ult(1)代表5μg超声打断后的gdna片段，h1975-ult(1)-1000及h1975-ult(1)-100分别代表超声片段稀释至1000copies/μl及100copies/μl，a549-ult(1)/20则是指超声片段稀释产物直接稀释20倍。该配置方法可以根据实际拷贝数和希望得到的突变百分数进行调整。之后，进一步进行数字pcr定量，试剂配制和热反应条件参见表11和表12。样本信息见表13。表13.突变参考品样本信息#仪器上样本id备注1bap空白人工血浆20.1％ap-10.1％-1人工血浆30.1％ap-20.1％-2人工血浆40.1％ap-30.1％-3人工血浆55％ap-15％-1人工血浆65％ap-25％-2人工血浆75％ap-35％.3人工血浆820％ap-120％-1人工血浆920％ap-220％-2人工血浆1020％ap-320％-3人工血浆11hbp-1健康人血浆-112hbp-2健康人血浆-2135％hp-15％健康人血浆-1145％hp-25％健康人血浆-2155％hp-35％健康人血浆-316h19758.25ng/μl表14.突变参考品样本的回收率根据上述的结果(表14)分析，可以看出个参考品的实际检测比例与理论计算得到的比例基本相符，无论使用人工血浆还是健康人血浆作为基质加标回收率均在80-120％之间、可以作为后续实验的参考品/质控品实验。通过引用并入本文引用的每个专利文献和科学文献的全部公开内容通过引用并入本文用于所有目的。等效本发明可以在不脱离其基本特征的情况下以其他具体形式实施。因此，前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。当前第1页12