一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用与流程

本发明属于质粒载体构建
技术领域：
，更具体地，涉及一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用。
背景技术：
嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌，嗜水气单胞菌的变异菌株较多，多数菌株对氟哌酸、菌必治敏感，嗜水气单胞菌表现多种抗性，其中一个主要原因是含有多种质粒，本实验室从嗜水气单胞菌中分离得到一种质粒，命名为质粒pbk760，该质粒具有多种位点和抗性，具有良好的载体特征。pmd20是一种高效克隆pcr产物的专用载体。该载体以puc19载体为基础，在其多克隆位点处的xbai和bamhi位点之间增加了spei、ndei、ecorv三种酶切位点，经ecorv酶切后再在两侧的3’端添加“t”制备而成。因大部分耐热性dna聚合酶进行pcr反应时都有在pcr产物的3’端添加一个“a”的特性，所以可以大大提高pcr产物的连接、克隆效率。虽然质粒pbk760和pmd20均可单独作为载体来使用，但是如果可以将其优点相结合，就可以发挥它们各自的优势，本发明结合质粒pbk760和pmd20两方面的优点，利用现代技术构建了一种全新的穿梭质粒载体(pbkpu01)，便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。技术实现要素：本发明的目的是提供一种全新的穿梭质粒载体及其构建方法和应用。具体地，本发明的第一方面提供一种穿梭质粒载体，该穿梭质粒载体由嗜水气单胞菌质粒pbk760与载体pmd20连接构建而成；所述嗜水气单胞菌质粒pbk760包括依次设置的lacz基因、复制起始点和氨苄青霉素抗性基因。具体地，所述lacz基因位于质粒pbk760的347～676位，所述复制起始点位于质粒pbk760的972～1560位，所述氨苄青霉素抗性基因位于质粒pbk760的1833～2693位。最具体地，所述嗜水气单胞菌质粒pbk760具有seqidno：1所示的核苷酸序列(质粒图谱如图3所示)。进一步地，所述穿梭质粒载体还包括位于3355～3561的启动子位点、位于3726～3812的信号肽编码基因、位于1592～2363的卡那霉素抗性基因、位于2531～2735的博来霉素抗性基因。载体pmd20可通过商购获得。最具体地，所述穿梭质粒载体的核苷酸序列如seqidno：2所示。本发明的第二方面提供一种穿梭质粒载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以嗜水气单胞菌质粒pbk760为模板，通过引物p1和p2进行pcr，得到线性化pbk760质粒，纯化后回收该线性化pbk760质粒；p1的核苷酸序列如seqidno：3(5’-atcgtcgaccctctagatgcag-3’)所示，p2的核苷酸序列如seqidno：4(5’-ctgactctagcaggtcgaggat-3’)所示；(2)用t4连接酶将纯化回收后的线性化pbk760质粒和载体pmd20进行连接；(3)将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞(例如e.colidh5α感受态细胞)，挑取转化子，提取得到所述穿梭质粒载体。本发明的第三方面提供上述穿梭质粒载体的应用。具体地，本发明提供所述穿梭质粒载体在筛选嗜水气单胞菌标记抗性基因构中的应用。本发明所述标记抗性基因筛选是将标记抗性基因连入所述穿梭质粒载体，然后再将得到的载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入嗜水气单胞菌，获得具有标记抗性基因的嗜水气单胞菌。具体地，本发明还提供所述穿梭质粒载体在嗜水气单胞菌基因敲除中的应用。本发明所述基因敲除是将标记抗性基因、待敲除基因的同源序列连入所述穿梭质粒载体，然后再将得到的载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入嗜水气单胞菌，获得敲除目标基因的嗜水气单胞菌。本发明的有益效果在于：本发明提供的穿梭质粒载体可在大肠杆菌和嗜水气单胞菌中复制。嗜水气单胞菌中遗传操作体系尚不成熟、转化步骤较繁琐，且其转化效率相对较低，而大肠杆菌中基因克隆操作十分便利。利用该穿梭质粒载体在大肠杆菌中完成外源基因克隆和重组质粒构建，便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作，转化率可达7×105-8×105cfu/μgdna。本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。图1为穿梭质粒载体pbkpu01构建示意图。图2为穿梭质粒载体pbkpu01图谱。图3为质粒pbk760图谱。图4为质粒pbk760经pcr线性化后的凝胶电泳图。图5为转化e.colidh5α后提取的穿梭质粒载体pbkpu01单、双酶切鉴定电泳图。具体实施方式下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1本实施例用于说明穿梭质粒载体pbkpu01的构建，构建示意图如图1所示。1、质粒pbk760的提取挑取嗜水气单胞菌单菌落，接种于5ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养12h。菌液用质粒dna小量抽提试剂盒(上海生工)提取质粒pbk760，-20℃储存待用。2、质粒pbk760线性化以质粒pbk760为模板(序列如seqidno：1所示)，通过设定引物(p1和p2)进行pcr，使环状质粒pbk760线性化，pcr的具体反应条件见表1，p1和p2序列如下：p1：5’-atcgtcgaccctctagatgcag-3’(seqidno：3)p2：5’-ctgactctagcaggtcgaggat-3’(seqidno：4)表1：pbk760线性化pcr反应具体条件taqdna聚合酶缓冲液5μldntps5μl引物p12.5μl引物p22.5μl模板pbk7602μltaqdna聚合酶0.5μlddh2o32.5μl全部50μl反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃4.5min，32循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图4所示。电泳结果显示在理论值大小位置出现了单一的特异性条带，用质粒dna片段回收试剂盒(购自上海生工)对其进行纯化回收。3、质粒pbk760和载体pmd20的连接将步骤2中线性化质粒pbk760和载体pmd20(购自takara公司)进行连接，反应体系如表2所示。表2：质粒pbk760和载体pmd20连接体系t4dna连接酶缓冲液1μl线性化质粒pbk7602μlpmd20载体6μlt4dna连接酶1μl全部10μl操作步骤如下：16℃连接过夜，取2.5μl连接产物转化50μle.colidh5α感受态细胞，取100μl菌液涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板进行蓝白斑筛选。挑取阳性转化子，转入5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃培养12h，用质粒dna小量抽提试剂盒(购自上海生工)提取质粒，获得穿梭质粒载体pbkpu01。通过hindiii和ecori进行单、双酶切验证(如图5所示)，确定重组质粒后进行测序分析(华大基因)。序列分析结果如seqidno：2，绘制载体图谱如图2所示。实施例2本实施例用于说明穿梭质粒载体pbkpu01的应用1、穿梭质粒载体pbkpu01转化嗜水气单胞菌a、嗜水气单胞菌感受态的制备1)挑取新鲜的嗜水气单胞菌单菌落接种于5mllb液体试管中，37℃，200r/min培养过夜。2)菌液按5％(v/v)接种量接入50ml含0.5mol/l的lb液体培养基中，37℃，200r/min培养至od600为2左右，取全部菌液冰浴30min，5000r/min，4℃离心6min，收集菌体。3)用10ml预冷的solutiona(0.5mol/l山梨醇，0.5mol/l的甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)重悬菌体，5000r/min，4℃离心8min，去上清(尽量除尽)，如此漂洗3次。4)用30ml预冷的solutionb(0.5mol/l海藻糖，0.5mol/l山梨醇，0.5mol/l甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)洗涤菌体一次，8000r/min，4℃离心5min，去上清(尽量除尽)。5)用500μlsolutionb悬浮菌体，即为嗜水气单胞菌电转感受态细胞，分装成50μl每管，-80℃保存，待用。b、转化感受态细胞1)电转化：将2μl实施例1制备的穿梭质粒载体pbkpu01与步骤a制备的50μl嗜水气单胞菌电转感受态细胞轻柔混合，冰浴30min，将混合物转入预冷的1mm电击杯中，2000v电击一次，之后迅速加入1ml预冷的复苏液，37℃，200r/min培养3h。2)取100μl菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上，37℃培养12h。3)挑取阳性转化子，转入5ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养12h，用质粒dna小量抽提试剂盒(购自上海生工)提取质粒，通过hindiii和ecori进行双酶切验证(如图5)，结果证明确为质粒pbkpu01。以上实施例说明本发明穿梭载体pbkpu01构建成功，该穿梭载体能够在嗜水气单胞菌中复制表达。以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。序列表<110>江苏医药职业学院<120>一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>3817<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agaacctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaag60tcgagatcagggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttg120atggttttgaacttgttctttcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttattt180tagttgctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaaccc240ttaaaattggttgcacagaaaaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataa300ctaaatagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatg360agaaaatcgctaatgttgattactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctg420aaaaatcaagggttttagtggacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaa480aaagagtaaaagattgtgctgaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaa540gaaagttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggagga600gagcaatgaaacatggcattcagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagc660caacagttcgttggttgtttctcacattaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaat720taaataagagtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaa780ttaataaaaatcttgttggttttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagata840cagaaaactacgtgaatcaaaaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattag900attcttataatcagcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaata960actatgatccaaatgtaaaagttcaaatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggata1020tacaatcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccg1080atgatgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaa1140ggttaatctcctatggtggtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgaca1200cagaagaaggcgatttgattcatacagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggatttt1260ctattattgcaatgtggaattgggaacggaaaaattattttattaaagagtagttcaaca1320aacgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgc1380ttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttattta1440gaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataa1500tgactagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaat1560atggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggc1620aagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatg1680aatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactag1740attatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattt1800tgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtag1860cctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatg1920caggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactg1980tacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacga2040cgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgacc2100atctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgc2160ataaagggtgtgcttaaatcgggccattttgcgtaataagaaaaaggattaattatgagc2220tgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttac2280gtatttattaacttctcctagtattagtaattatcatggctgtcatggcgcattaacgga2340tagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatg2400gaattgaattaataataaggtaatagatttacattagaaaatgaaaggggattttatgcg2460tgagaatgttacagtctatcccggcattgccagtcggggatattaaaaagagtataggtt2520tttattgcgataaactaggtttcactttggttcaccatgaagatggattcgcagttctaa2580tgtgtaatgaggttcggattcatctatgggaggcaagtgatgaaggctggcgctctcgta2640gtaatgattcaccggtttgtacaggtgcggagtcgtttattgctggtactgctagttgcc2700gcattgaagtagagggaattgatgaattatatcaacatattaagcctttgggcattttgc2760accccaatacatcattaaaagatcagtggtgggatgaacgagactttgcagtaattgatc2820tttaaacgagcacgagagcaaaacccccctttgctgaggtggcagagggcaggttttttt2880gttcagcaatcgggcgcgattgctgaataaaagatacgagagacctctcttgtatctttt2940ttattttgagtggttttgtccgttacactagaaaaccgaaagacaataaaaattttattc3000ttgctgagtctggctttcggtaagctagacaaaacggacaaaataaaaattggcaagggt3060ttaaaggtggagattttttgagtgatcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatt3120ccgacaacaatttgattagcttttttcaacaaataaaaagctaaaatctattattaatct3180gtttcttttttctcgtaaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcac3240tgaattcgagctcagcattattgagtggatgattatattccttttgataggtggtatgtt3300ttcgcttgaacttttaaatacagccattgaacatacggttgatttaataactgacaaaca3360tcaccctcttgctaaagcggccaaggacgctgccgccggggctgtttgcgtttttgccgt3420gatttcgtgtatcattggtttacttatttttttgccaaagctgtaatggctgaaaattct3480tacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaata3540taaagtgatagcggtaccaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaa3600aaggagacatgaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaaccttt3660actaccgcactgctggcaggaggcgcaactcaagcttttgcctcgagctcggtacccggg3720gatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagctagcttcagcacaattccaagaaagac3780gcggtaccaggagggctggaagaagcagacacgattt3817<210>2<211>6635<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtca60cagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120ttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgc180attcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctat240accatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgcc300tacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggt360cttccagagattatcctctagagtcgacctgcagatcctctagagtcgacctgcaggcat420tttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattagaactcggtacgcgcggat480gcaagctagcttcagcacaattccaagaaaaacacgatttagaacctaaaaagaacgaat540tataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctt600ttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtt660tcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttatttt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