酸性磷酸酶的制备方法与流程

本发明涉及生物领域中酸性磷酸酶的制备方法。

背景技术

磷是植物生长发育三大必需元素之一，在生命过程中起重要作用。植物利用的磷素主要来源于土壤。目前，我国有2/3的耕地缺磷，缺磷的主要原因是由于土壤中有效磷含量不足，大约95％的磷为难溶性的无效磷，植物很难吸收利用。我国每年大约消耗1050-1200万吨磷肥(2010年中国化工信息网)，但是磷肥当季植物利用率仅为5％-25％，90％左右的磷肥施入土壤后很快被化学固定。因此，提高磷肥利用效率，活化土壤无效磷素是农业生产迫切解决的科学问题之一。

溶磷微生物中酸性磷酸酶、肌醇六磷酸酶在土壤有机磷的分解与释放起着关键作用(yamamuraetal.,2004；赵小蓉等，2001；陈哲等，2009)。酸性磷酸酶(acidphosphatase，简称acpase，e.c.3.1.3.2)，是在酸性条件下催化磷酸单酯水解的酶。此酶除了参与磷酸酯的代谢，还参与代谢调节、能量转换以及信号转导等重要生命活动。酸性磷酸酶具有非常重要的功能，其一，酸性磷酸酶具有磷酸水解酶的活性，通过分解有机质的磷一酯键和磷一酐键释放磷，从而活化土壤中无效磷，在充分利用土壤磷资源、减少磷肥施用上具有重要应用价值；其二，酸性磷酸酶也具有磷酸转移酶活性,在合适的条件下,能将低能磷酸基团转移到核苷的羟基上,在核苷酸生化合成上具有较大的应用价值。核苷酸通常作为食品添加剂和医药中间体，其中，肌苷酸(次黄嘌呤-5′-核苷酸)因为具有更明显的助鲜效果，广泛应用于食品加工领域。目前主要有两种方法生产核苷酸，一种是化学合成法，利用菌体发酵产生肌苷，再用pocl3磷酸化，该方法副产物较多，提纯困难；另一种方法是利用大肠杆菌肌苷激酶磷酸化肌苷，此过程需要atp的参与，而atp需要通过产氨杆菌发酵再生，限制了酶法合成的应用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种磷酸水解酶的活性和磷酸转移酶活性均较高的酸性磷酸酶。

本发明所提供的酸性磷酸酶，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)由seqidno.2第1-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)由seqidno.2第26-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端(c末端)或/和氨基端(n末端)融合蛋白标签得到的融合蛋白；

d)将seqidno.2或seqidno.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。

上述酸性磷酸酶中，a)所示的蛋白质为来源于巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)的完整酸性磷酸酶，其名称为bmacpa；seqidno.2由203个氨基酸残基组成，第1-25位为信号肽。

上述酸性磷酸酶中，b)所示的蛋白质为去掉bmacpa的信号肽得到的去信号肽酸性磷酸酶，其名称为nsbmacpa。

上述酸性磷酸酶中，蛋白标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。c)所示的蛋白质具体可为在nsbmacpa的羧基端或/和氨基端融合组氨酸标签得到的融合蛋白质，如seqidno.6所示的蛋白质，其名称为nsbmacpa-his。seqidno.6由192个氨基酸残基组成。

编码上述酸性磷酸酶的核酸分子也属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

上述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：

1)编码序列(cds)是seqidno.1所示的dna分子，其名称为bmacpa基因；

2)编码序列是seqidno.1的第76至612位所示的dna分子，其名称为nsbmacpa基因；

3)编码序列是seqidno.5所示的dna分子；其名称为nsbmacpa-his基因；

4)与1)或2)或3)限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码上述酸性磷酸酶的dna分子。

所述核酸分子中，“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

下述a1)、a2)或a3)的应用也属于本发明的保护范围：

a1)上述酸性磷酸酶在作为磷酸转移酶中的应用。

a2)上述核酸分子在制备磷酸转移酶中的应用。

a3)上述酸性磷酸酶在制备核苷酸中的应用。

上述应用中，所述核苷酸为肌苷酸。

本发明还提供了制备上述酸性磷酸酶的方法。

本发明所提供的制备上述酸性磷酸酶的方法，包括使上述酸性磷酸酶的编码基因在生物中进行表达得到上述酸性磷酸酶的步骤；所述生物可为微生物、植物或非人动物。

上述方法中，所述使上述酸性磷酸酶的编码基因在生物中进行表达包括将上述酸性磷酸酶的编码基因导入受体微生物，得到表达上述酸性磷酸酶的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到上述酸性磷酸酶。

上述方法中，所述受体微生物可为原核微生物。

上述方法中，所述原核微生物具体可为革兰氏阴性细菌。

上述方法中，所述革兰氏阴性细菌具体可为埃希氏菌属细菌或柠檬酸杆菌属细菌。

上述方法中，所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌，如大肠杆菌bl21(de3)。所述柠檬酸杆菌属细菌可为柠檬酸杆菌accc02187。

上述方法中，a)或b)或c)或d)的蛋白质的编码基因可通过重组表达载体pet–nsbmacpa导入所述受体微生物；所述pet–nsbmacpa是用序列表中序列5第4至537位核苷酸所示的dna分子替换pet-30b(+)的ndei和hindiii识别位点间的片段得到的重组表达载体。

上述方法中，a)或b)或c)或d)的蛋白质的编码基因通过重组表达载体pht–bmacpa导入所述受体微生物；所述pht–bmacpa是序列表中序列1所示的dna分子替换pht43的bamhi和xbai识别位点间的片段得到的重组表达载体。

实验证明，bmacpa和nsbmacpa均具有磷酸水解酶活性和磷酸转移酶活性，bmacpa和nsbmacpa在37℃、ph5.0的50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液中的磷酸水解酶活分别为33.96±1.32u/mg蛋白和37.35±1.55u/mg蛋白；nsbmacpa在37℃、ph值为5、反应30min的肌苷转化率为38％，bmacpa在37℃、ph值为5的条件下反应45分钟的肌苷转化率为36％。

本发明为应用基因工程手段培育高效利用土壤养分的农作物新品种提供基因资源,可用于培育高效活化土壤磷素养分的生物工程菌。

附图说明

图1为在大肠杆菌中诱导表达酸性磷酸酶的sds-page图谱。

图1中，m：蛋白marker；1：空白对照菌粗酶液；2：空载体对照菌粗酶液；3：nsbmacpb-his粗酶液；4：nsbmacpa-his粗酶液。

图2为不同ph和反应时间对nsbmacpa-his的磷酸转移酶活性的影响。

图3为不同ph和反应时间对nsbmacpb-his的磷酸转移酶活性的影响。

图4为不同二价离子对nsbmacpa-his和nsbmacpb-his磷酸水解酶活性的影响。

图4中，bmacpa为nsbmacpa-his；bmacpb为nsbmacpb-his。

图5为重组工程菌中酸性磷酸酶的sds-page表达图谱。

图5中，m：蛋白marker；1：胞内上清；2：胞外上清。

图6为ph对酸性磷酸酶工程菌的酸性磷酸酶酶活性的影响。

图7为在添加有机磷源培养基中酸性磷酸酶工程菌的溶磷效果。

图7中，柠檬酸杆菌为柠檬酸杆菌accc02187，转入酸性磷酸酶的柠檬酸杆菌为酸性磷酸酶工程菌。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)accc10010(授权公告日为2005年2月16日、授权公告号为cn1189086c的中国发明专利)于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称accc，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。本发明中简称巨大芽孢杆菌accc10010。

下述实施例中所用的巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)accc02970于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称accc，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，其收藏日为2007年12月20日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。本发明中简称巨大芽孢杆菌accc02970。

柠檬酸杆菌(citrobactersp.)accc02187,于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称accc，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，其收藏日为2005年11月1日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。本发明中简称柠檬酸杆菌accc02187。

实施例1、酸性磷酸酶bmacpa的制备及功能验证

一、bmacpa基因和bmacpb基因的克隆

分别提取巨大芽孢杆菌accc10010和巨大芽孢杆菌accc02970的基因组dna，以巨大芽孢杆菌accc10010的基因组dna为模板，以p1和p2为引物，pcr扩增bmacpa基因；以巨大芽孢杆菌accc02970的基因组dna为模板，以p3和p4为引物，pcr扩增bmacpb基因。其中，p1、p2、p3和p4序列如下：p1：5′–atgtatgtgaaacgatatcg-3′，p2：5′-ctacttttgtcgaacacata-3′，p3：5′-atggtaaatcgcactacaaa-3′，p4：5′-ctatttttggttatataagc-3′。

将得到的bmacpa基因pcr产物和bmacpb基因pcr产物分别进行电泳，结果表明bmacpa基因pcr产物和bmacpb基因pcr产物约为600bp的条带，分别回收bmacpa基因pcr产物和bmacpb基因pcr产物，分别单独连接到克隆载体上，筛选鉴定阳性克隆，并进行序列测定；测序结果表明，bmacpa基因pcr产物的dna序列如序列表中序列1所示，序列表中的序列1由612个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质，序列表中序列2由203个氨基酸残基组成，将序列表中序列2所示的蛋白质命名为bmacpa，序列2的第1-25位为信号肽序列，序列表中的序列1所示的dna分子为bmacpa基因；bmacpb基因pcr产物的dna序列如序列表中序列3所示，序列表中序列3由627个核苷酸组成，编码序列表中序列4所示的蛋白质，序列表中的序列4由208个氨基酸残基组成，将序列表中序列4所示的蛋白质命名为bmacpb，序列表中的序列4的第1-25位为信号肽序列，序列表中序列3所示的dna分子为bmacpb基因。

二、重组表达载体的构建

1、pet–nsbmacpa的构建

设计去除信号肽序列的bmacpa基因表达引物。根据巨大芽孢杆菌accc10010bmacpa基因功能结构域设计去信号肽引物，在去掉信号肽的5′端引物加入ndei酶切位点(catatg)，在3′端引物加入hindiii酶切位点(aagctt)。上下游引物分别为：p5引物，5′-at-catatg–tttaatacaccttgggtgaa-3′和p6引物，5′-gc-aagctt-cttttgtcgaacacataa-3′。利用pcr扩增的方法，在bmacpa基因编码区去除信号肽编码dna(序列表中序列1第1-75位核苷酸)，并在5′端和3′端分别引入ndei和hindiii酶识别位点，得到不带信号肽bmacpa基因pcr产物，将不带信号肽bmacpa基因命名为nsbmacpa基因,将不带信号肽bmacpa基因pcr产物命名为nsbmacpa基因pcr产物。nsbmacpa基因pcr产物含有序列表中序列1第76至609位核苷酸(序列表中序列5第4至537位核苷酸)。

将上述步骤一得到的nsbmacpa基因pcr产物用ndei和hindiii酶切，回收目的片段(nsbmacpa基因)；同时用ndei和hindiii酶切载体pet-30b(+)(emdbiosciences，购置于北京新经科公司)，回收载体大片段；将回收的目的片段与回收的载体大片段16℃连接，得到目的质粒。将目的质粒用cacl2法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。将其均匀涂布于含氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用ndei和hindiii进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用序列表中的序列5第4至537位所示的dna分子替换pet-30b(+)的ndei和hindiii识别位点间的片段得到的重组表达载体命名为pet–nsbmacpa。pet–nsbmacpa含有his标签融合蛋白nsbmacpa-his编码基因，nsbmacpa-his编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列5，nsbmacpa-his是序列表中的序列6所示的蛋白质。

2、pet–nsbmacpb的构建

设计去除信号肽序列的bmacpb基因表达引物。根据巨大芽孢杆菌accc02970的bmacpb基因编码区序列设计引物，在去掉信号肽的5′端引物加入ndei酶切位点(catatg)，在3′端引物加入hindiii酶切位点(aagctt)。上下游引物分别为：p7引物，5′-at-catatg–tttaatacaccttgggtgaa-3′和p8引物，5′-gc-aagctt-tttttggttatataagcg-3′。利用pcr扩增的方法，在bmacpb基因编码区去除信号肽并在5′端和3′分别引入ndei和hindiii识别位点，得到不带信号肽bmacpb基因pcr产物，将不带信号肽bmacpb基因命名为nsbmacpb基因,将不带信号肽bmacpb基因pcr产物命名为nsbmacpb基因pcr产物。nsbmacpb基因pcr产物含有序列表中序列3第76至624位核苷酸(序列表中序列7第4至552位核苷酸)。

将上述步骤一得到的nsbmacpb基因pcr产物用ndei和hindiii酶切，回收目的片段；同时用ndei和hindiii酶切载体pet-30b(+)(emdbiosciences，购置于北京新经科公司)，回收载体大片段；将回收的目的片段与回收的载体大片段16℃连接，得到目的质粒。将目的质粒用cacl2法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。将其均匀涂布于含氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用ndei和hindiii进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用序列表中序列7第4至552位核苷酸所示的dna分子替换pet-30b(+)的ndei和hindiii识别位点间的片段得到的重组表达载体命名为pet–nsbmacpb。pet–nsbmacpb含有his标签融合蛋白nsbmacpb-his编码基因，nsbmacpb-his编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列7，nsbmacpb-his是序列表中的序列8所示的蛋白质。

三、表达酸性磷酸酶的重组大肠杆菌的制备

1、nsbmacpa-his的表达

将步骤二的pet–nsbmacpa用氯化钙法转化大肠杆菌bl21(de3)(天根公司)，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆筛选培养，挑取单克隆，以上述p5和p6为引物进行pcr鉴定，将pcr鉴定得到539bp左右pcr产物的阳性克隆作为基因工程菌，命名为pet–nsbmacpa/bl21。挑取pet–nsbmacpa/bl21菌株，接种于含100ug/ml卡那霉素的lb培养基(在lb培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为100ug/ml得到的培养基)中，37℃培养至0d600值(以含100ug/ml卡那霉素的lb培养基为空白对照)达到0.6时，加入iptg至终浓度lmm，在150r/min的转速下28℃诱导6h，收集培养液经4000r/min离心20min后，用50mmtris-hcl(ph7.1)重悬菌体得到菌体含量为10⁸cfu/ml的菌体悬浮液，菌体悬浮液经超声破碎，12000r/min离心10min，收集上清液(含菌体总蛋白质)，将该上清液命名为nsbmacpa-his粗酶液。

2、nsbmacpb-his的表达

将步骤二的pet–nsbmacpb用氯化钙法转化大肠杆菌bl21(de3)(天根公司)，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆筛选培养，挑取单克隆，以上述p7和p8为引物进行pcr鉴定，将pcr鉴定得到552bp左右pcr产物的阳性克隆作为基因工程菌，命名为pet–nsbmacpb/bl21。挑取pet–nsbmacpb/bl21菌株，接种于含100ug/ml卡那霉素的lb培养基(在lb培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为100ug/ml得到的培养基)中，37℃培养至0d600值(以含100ug/ml卡那霉素的lb培养基为空白对照)达到0.6时，加入iptg至终浓度lmm，在150r/min的转速下28℃诱导6h，收集培养液经4000r/min离心20min后，用50mmtris-hcl(ph7.1)重悬菌体得到菌体含量为10⁸cfu/ml的菌体悬浮液，菌体悬浮液经超声破碎，12000r/min离心10min，收集上清液(含菌体总蛋白质)，将该上清液命名为nsbmacpb-his粗酶液。

3、空载体对照菌

按照与步骤1相同的方法将pet-30b(+)转入大肠杆菌bl21(de3)，将得到的重组大肠杆菌名为pet-30b(+)/bl21。将pet-30b(+)/bl21作为空载体对照菌按照上述步骤1的方法进行诱导表达制备菌体总蛋白。挑取pet-30b(+)/bl21菌株，接种于含100ug/ml卡那霉素的lb培养基(在lb培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为100ug/ml得到的培养基)中，37℃培养至0d600值(以含100ug/ml卡那霉素的lb培养基为空白对照)达到0.6时，加入iptg至终浓度lmm，在150r/min的转速下28℃诱导6h，收集培养液经4000r/min离心20min后，用50mmtris-hcl(ph7.1)重悬菌体得到菌体含量为10⁸cfu/ml的菌体悬浮液，菌体悬浮液经超声破碎，12000r/min离心10min，收集上清液(含菌体总蛋白质)，将该上清液命名为空载体对照菌粗酶液。

4、空白对照菌大肠杆菌bl21(de3)

将大肠杆菌bl21(de3)作为空白对照菌按照上述步骤1的方法进行诱导表达制备菌体总蛋白。挑取大肠杆菌bl21(de3)菌株，接种于含100ug/ml卡那霉素的lb培养基(在lb培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为100ug/ml得到的培养基)中，37℃培养至0d600值(以含100ug/ml卡那霉素的lb培养基为空白对照)达到0.6时，加入iptg至终浓度lmm，在150r/min的转速下28℃诱导6h，收集培养液经4000r/min离心20min后，用50mmtris-hcl(ph7.1)重悬菌体得到菌体含量为10⁸cfu/ml的菌体悬浮液，菌体悬浮液经超声破碎，12000r/min离心10min，收集上清液(含菌体总蛋白质)，将该上清液命名为空白对照菌粗酶液。

取30μlnsbmacpa-his粗酶液(来自10⁸cfupet–nsbmacpa/bl21)、30μlnsbmacpb-his粗酶液(来自10⁸cfupet–nsbmacpb/bl21)、30μl空载体对照菌粗酶液(来自10⁸cfupet-30b(+)/bl21)和30μl空白对照菌粗酶液(来自10⁸cfu大肠杆菌bl21(de3))在同一块胶上进行sds-page分析(分离胶浓度为12％)，该胶上的加样孔体积和形状均一致，加样孔体积为80μl。

sds-page结果如图1所示，表明虽然nsbmacpa-his粗酶液、nsbmacpb-his粗酶液、空载体对照菌粗酶液和空白对照菌粗酶液中均有27kd的条带，但nsbmacpa-his粗酶液和nsbmacpb-his粗酶液中27kd多肽的含量明显高于空载体对照菌粗酶液和空白对照菌粗酶液中27kd多肽的含量，而且nsbmacpa-his粗酶液中的27kd多肽的含量高于nsbmacpb-his粗酶液中27kd多肽的含量。说明nsbmacpa-his和nsbmacpb-his均在大肠杆菌bl21(de3)中得到了表达，而且nsbmacpa-his在大肠杆菌bl21(de3)中的表达量高于nsbmacpb-his在大肠杆菌bl21(de3)中的表达量。

四、测定nsbmacpa-his和nsbmacpb-his的磷酸水解酶活性

取步骤三的nsbmacpa-his粗酶液、nsbmacpb-his粗酶液、空载体对照菌粗酶液和空白对照菌粗酶液分别用镍柱(购自美国通用公司的high-affinityni-ntarasin产品)进行纯化，将镍柱预处理，加入粗酶液，然后加入含咪唑洗脱液(50mmnah2po4,300mmnacl，250mmimidazole，ph8.0)4℃作用10min，3000rpm离心1min收集洗脱液，重复洗脱一次，收集洗脱液，取1ml洗脱液进行sds-page分析。nsbmacpa-his的序列测定结果表明其n末端的15个氨基酸为序列表中序列6的第1-15位氨基酸，nsbmacpb-his的序列测定结果表明其n末端的15个氨基酸为序列表中序列8的第1-15位氨基酸。

将上述收集的洗脱液用双蒸水透析，去盐离子，分别获得纯的nsbmacpa-his酶液、纯的nsbmacpb-his酶液、纯的空载体对照菌酶液和纯的空白对照菌酶液，作为待测酶液。待测酶液利用bca蛋白质定量试剂盒定量测定蛋白质含量。

采用常用的对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)法测定nsbmacpa-his和nsbmacpb-his的磷酸水解酶活性。所采用的反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液和mncl2组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，mncl2的浓度为1mmol/l。37℃下反应10min，反应后立即加入0.1ml5mmol/l的na0h终止反应并测定a405nm。用空白反应体系作为空白对照。该空白反应体系由等体积的热灭活待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)、50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液和mncl2组成，该空白反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，mncl2的浓度为1mmol/l。酶活力单位(u)定义为：37℃、ph5.0条件下，每分钟催化产生1μmol磷酸水解产物pnp(对硝基苯酚)的量为1个酶活力单位。

实验设三次重复。结果表明纯的空载体对照菌酶液和纯的空白对照菌酶液中没有磷酸水解酶活性，由pet–nsbmacpa/bl21表达的nsbmacpa-his的磷酸水解酶活力为37.35±1.55u/mg蛋白，由pet–nsbmacpb/bl21表达的nsbmacpb-his的磷酸水解酶活力为12.49±1.26u/mg蛋白。nsbmacpa-his的磷酸水解酶活力是nsbmacpb-his的2.99倍。

五、不同反应时间和ph对nsbmacpa-his和nsbmacpb-his的磷酸转移酶活性的影响

采用肌苷转化率(将肌苷转化为肌苷酸的能力)体现nsbmacpa-his和nsbmacpb-his的磷酸转移酶活性。具体方法如下：

将步骤四获得的纯的nsbmacpa-his酶液和纯的nsbmacpb-his酶液，作为待测酶液。待测酶液利用bca蛋白质定量试剂盒定量测定蛋白质含量。

采用5个ph值不同的反应体系(ph4.0反应体系、ph5.0反应体系、ph6.0反应体系、ph7.0反应体系和ph8.0反应体系)测定nsbmacpa-his和nsbmacpb-his将肌苷转化为肌苷酸的能力。

上述5个ph值不同的反应体系均由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)、肌苷和缓冲溶液组成。上述5个ph值不同的反应体系的pnpp的浓度均为5mmol/l，肌苷的浓度均为1mmol/l。ph4.0反应体系的ph为4.0，缓冲溶液为0.2mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液。ph5.0反应体系的ph为5.0，缓冲溶液为0.2mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液。ph6.0反应体系的ph为6.0，缓冲溶液为0.2mmol/l磷酸二氢钠-磷酸氢二钠。ph7.0反应体系的ph为7.0，缓冲溶液为0.2mmol/l磷酸二氢钠-磷酸氢二钠。ph8.0反应体系的ph为8.0，缓冲溶液为0.2mmol/l磷酸二氢钠-磷酸氢二钠。

上述各个反应体系分别在37℃下反应15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，反应后立即加入0.1ml5mmol/l的na0h终止反应，用hplc分析法测定肌苷酸的含量，依据肌苷转化率(肌苷转化率＝肌苷酸含量/肌苷含量×100％)体现nsbmacpa-his和nsbmacpb-his的磷酸转移酶活性。用相应的空白反应体系作为空白对照。各个ph值的空白反应体系只是将相应的ph值反应体系中的待测酶液替换为等体积的热灭活待测酶液，其它成分均与相应的ph值反应体系相同。hplc条件为：色谱柱：hypersilsax5μm(4.6mm×250mm)，流动相：60mmol/lph3.0磷酸-磷酸二氢铵缓冲液，流速：1ml/min，检测波长254nm，柱温：25℃。

实验设三次重复。结果如图2和图3所示，表明nsbmacpa-his的磷酸转移酶活性在酸性条件下(ph4.0-6.0)处于一个较高的水平，在45min之内肌苷转化率能达到31％-38％，在ph值为5、反应30min的肌苷转化率最高，为38％(图2)；nsbmacpb-his的磷酸转移酶活性在酸性条件下(ph4.0-6.0)低于nsbmacpa-his，nsbmacpb-his在ph值为5、反应30min的肌苷转化率最高为20％(图3)。nsbmacpa-his和nsbmacpb-his的肌苷转化率均在ph值为5、反应时间为30min的条件下最高，nsbmacpa-his的肌苷转化率高于nsbmacpb-his，nsbmacpa-his的肌苷转化率是nsbmacpb-his的1.90倍。

说明nsbmacpa-his和nsbmacpb-his在酸性条件下均具有磷酸水解酶活性和磷酸转移酶活性，是酸性磷酸酶。

六、金属离子对nsbmacpa-his和nsbmacpb-his磷酸水解酶活性的影响

将步骤四获得的纯的nsbmacpa-his酶液和纯的nsbmacpb-his酶液，作为待测酶液。待测酶液利用bca蛋白质定量试剂盒定量测定蛋白质含量。

采用9个不同的反应体系(mn²⁺反应体系、cu²⁺反应体系、fe²⁺反应体系、zn²⁺反应体系、co²⁺反应体系、ca²⁺反应体系、control反应体系和edta反应体系)测定nsbmacpa-his和nsbmacpb-his的磷酸水解酶活性。

control反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l。

mn²⁺反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液组成和mncl2组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，mncl2的浓度为1mmol/l。

cu²⁺反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液组成和cucl2组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，cucl2的浓度为1mmol/l。

fe²⁺反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液组成和fecl2组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，fecl2的浓度为1mmol/l。

zn²⁺反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液组成和zncl2组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，zncl2的浓度为1mmol/l。

co²⁺反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液组成和cocl2组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，cocl2的浓度为1mmol/l。

ca²⁺反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液组成和cacl2组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，cacl2的浓度为1mmol/l。

edta反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液组成和edta二钠组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，edta的浓度为5mmol/l。

上述各个反应体系37℃下反应10min，反应后立即加入0.1ml5mmol/l的na0h终止反应并测定a405nm。用相应的空白反应体系作为空白对照。上述各个反应体系的空白反应体系只是将相应的反应体系中的待测酶液替换为等体积的热灭活待测酶液，其它成分均与相应的反应体系相同。酶活力单位(u)定义为：37℃、ph5.0条件下，每分钟催化产生1μmol磷酸水解产物pnp(对硝基苯酚)的量为1个酶活力单位。

结果如图4所示，除了ca²⁺+和edta外，二价金属阳离子的添加均能提高nsbmacpa-his和nsbmacpb-his的磷酸水解酶活性，其中mn²⁺、zn²⁺提高酸性磷酸酶活性效果最好，nsbmacpa-his在外源添加mn²⁺、zn²⁺之后，酶活性分别为37.35±1.55u/mg蛋白和32.54±1.36u/mg蛋白，而nsbmacpb-his在外源添加mn²⁺、zn²⁺之后，酶活性分别为12.49±1.26u/mg蛋白和10.12±1.17u/mg蛋白，将两者进行对比表明，nsbmacpa-his的磷酸水解酶活性是nsbmacpb-his的磷酸水解酶活性的2.99-3.22倍。

实施例2、酸性磷酸酶溶磷工程菌的培育及其功能鉴定

1.巨大芽胞杆菌酸性磷酸酶bmacpa基因穿梭表达载体的构建

为了获得高效表达巨大芽胞杆菌酸性磷酸酶bmacpa基因的溶磷工程菌，需要首先构建能够跨宿主表达的穿梭表达载体。pht43(德国mobitec公司产品，购置于武汉淼灵生物科技有限公司)是常用的穿梭表达载体，携带bamhi和xbai酶识别位点，具有氨苄青霉素和氯霉素抗性基因，通过iptg诱导，能够高水平分泌表达目的蛋白。利用dnaman软件分析巨大芽胞杆菌酸性磷酸酶bmacpa基因序列，发现没有bamhi和xbai酶切位点，可以采用穿梭表达载体pht43，构建能够在柠檬酸杆菌表达的重组质粒。

根据巨大芽胞杆菌bmacpa基因编码区序列设计引物，在5′端引物加入bamhi酶切位点(ggatcc)，在3′端引物加入xbai酶切位点(tctaga)。下划线为酶切位点。上下游引物分别为：p9：5′-at-ggatcc–atgtatgtgaaacgatatcg-3′和p10：5′-gc-tctaga-ctacttttgtcgaacacata-3′)。利用pcr扩增的方法，在bmacpa基因完整编码区的5′端和3′分别引入bamhi和xbai酶识别位点，得到bmacpa基因pcr产物；用bamhi和xbai同时酶切穿梭表达载体pht43和带有酶识别位点的bmacpa基因pcr产物，回收的酶切产物用t4连接酶连接，连接产物转化后筛选阳性克隆，测序，将测序结果表明是用序列表中序列1所示的dna分子替换pht43的bamhi和xbai识别位点间的片段得到的重组表达载体命名为pht–bmacpa。pht–bmacpa含有序列表中序列1所示的bmacpa基因，pht–bmacpa表达是序列表中的序列2所示的蛋白质。

2.酸性磷酸酶工程菌的获得及其表达的bmacpa的磷酸水解酶活性

采用电转化法，将重组载体pht-bmacpa转入柠檬酸杆菌accc02187，得到重组菌，该重组菌即为酸性磷酸酶工程菌。将酸性磷酸酶工程菌接入含氨苄青霉素和氯霉素的lb培养基中，培养过夜。以2％的接种量转接到含氨苄青霉素和氯霉素的lb培养基中在35℃继续培养至对数生长期，加入iptg到终浓度为0.5mm，诱导培养6h，室温下4000r/min转速离心15min，分别收集上清液和菌体，该上清液为胞外上清。将菌体破碎后，4℃4000r/min转速离心15min，收集上清液，该上清液为胞内上清。然后分别对胞内上清和胞外上清进行sds-page电泳分析以及酶活力测定。将胞内上清和胞外上清分别作为待测酶液。待测酶液利用bca蛋白质定量试剂盒定量测定蛋白质含量。采用常用的对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)法测定待测酶液的磷酸水解酶活性。所采用的反应体系由待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)和50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液和mncl2组成，该反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，mncl2的浓度为1mmol/l。37℃下反应10min，反应后立即加入0.1ml5mmol/l的na0h终止反应并测定a405nm。用空白反应体系作为空白对照。该空白反应体系由等体积的热灭活待测酶液、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)、50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液和mncl2组成，该空白反应体系的ph为5.0，pnpp的浓度为1mmol/l，mncl2的浓度为1mmol/l。酶活力单位(u)定义为：37℃、ph5.0条件下，每分钟催化产生1μmol磷酸水解产物pnp(对硝基苯酚)的量为1个酶活力单位。实验重复三次。

sds-page电泳结果(图5)显示，bmacpa基因可以在酸性磷酸酶工程菌中可以正常表达，表达产物为分泌蛋白，表达产物分子量约为24kd。酸性磷酸酶工程菌表达的磷酸水解酶的酶活力为33.96±1.32u/mg。

3、反应时间和ph对酸性磷酸酶工程菌的磷酸转移酶活性的影响

采用肌苷转化率(将肌苷转化为肌苷酸的能力)体现酸性磷酸酶工程菌的磷酸转移酶活性。具体方法如下：

将步骤2的酸性磷酸酶工程菌接入含氨苄青霉素和氯霉素的lb培养基中，培养过夜。以2％的接种量转接到含氨苄青霉素和氯霉素的lb培养基中在35℃继续培养至对数生长期，加入iptg到终浓度为0.5mm，在28℃诱导培养6h，室温下4000r/min转速离心15min，收集菌体，采用5个ph值不同的反应体系(ph4.0反应体系、ph5.0反应体系、ph6.0反应体系、ph7.0反应体系和ph8.0反应体系)测定酸性磷酸酶工程菌将肌苷转化为肌苷酸的能力。

上述5个ph值不同的反应体系均由菌体、对硝基苯酚磷酸钠(pnpp)、肌苷和缓冲溶液组成。上述5个ph值不同的反应体系的pnpp的浓度均为5mmol/l，肌苷的浓度均为1mmol/l，菌体的含量为10⁸cfu/ml。ph4.0反应体系的ph为4.0，缓冲溶液为0.2mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液。ph5.0反应体系的ph为5.0，缓冲溶液为0.2mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液。ph6.0反应体系的ph为6.0，缓冲溶液为0.2mmol/l磷酸二氢钠-磷酸氢二钠。ph7.0反应体系的ph为7.0，缓冲溶液为0.2mmol/l磷酸二氢钠-磷酸氢二钠。ph8.0反应体系的ph为8.0，缓冲溶液为0.2mmol/l磷酸二氢钠-磷酸氢二钠。

上述各个反应体系分别在37℃下反应15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min，反应后立即加入0.1ml5mmol/l的na0h终止反应，用hplc分析法测定肌苷酸的含量，依据肌苷转化率(肌苷转化率＝肌苷酸含量/肌苷含量×100％)体现酸性磷酸酶工程菌的磷酸转移酶活性。用相应的空白反应体系作为空白对照。各个ph值的空白反应体系只是将相应的ph值反应体系中的待测酶液替换为等体积的热灭活待测酶液，其它成分均与相应的ph值反应体系相同。hplc条件为：色谱柱：hypersilsax5μm(4.6mm×250mm)，流动相：60mmol/lph3.0磷酸-磷酸二氢铵缓冲液，流速：1ml/min，检测波长254nm，柱温：25℃。

酸性磷酸酶工程菌将肌苷转化为肌苷酸的最适ph为5.0，在酸性条件下(ph4.0-6.0)肌苷转化率处于一个较高的水平，都能达到25％以上。其中，在37℃、ph值为5的条件下反应45分钟的肌苷转化率最高，为36％(图6)。

4、酸性磷酸酶工程菌的溶磷效果

将步骤2的酸性磷酸酶工程菌及柠檬酸杆菌(受体菌)分别接种于磷酸肌醇液体培养基、磷脂液体培养基和核酸液体培养基中，使酸性磷酸酶工程菌和柠檬酸杆菌的含量均为10⁸cfu/ml，在35℃培养至对数生长期，加入iptg到终浓度为0.5mm，在28℃诱导培养6h，室温下4000r/min转速离心15min，收集上清液，采用钥锑抗比色法,用722型分光光度计,在波长700nm，直接测定接种酸性磷酸酶工程菌培养液中有效磷的含量。

其中，磷酸肌醇液体培养基的ph为6.0，配制方法如下：将溶剂是水，溶质及其浓度如下的培养液在115℃灭菌30min：0.3g/lmgso4·7h2o，0.2g/l(nh4)2so4，0.03g/lcacl2，0.9g/lnacl，0.5ml微量元素溶液/l，20g/l葡萄糖。其中，微量元素溶液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：1.23g/lmnso4，0.356g/lznso4，0.256g/lfeso4，0.31g/lcuso4·5h2o。将1,4,5-三磷酸肌醇经过细菌过滤器除菌，加入上述灭菌的培养液中，得到磷酸肌醇液体培养基，磷酸肌醇液体培养基中1,4,5-三磷酸肌醇的浓度为50μmol/l。

磷脂液体培养基的ph为6.0，配制方法如下：将溶剂是水，溶质及其浓度如下的培养液在115℃灭菌30min：0.3g/lmgso4·7h2o，0.2g/l(nh4)2so4，0.03g/lcacl2，0.9g/lnacl，0.5ml微量元素溶液/l，20g/l葡萄糖。其中，微量元素溶液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：1.23g/lmnso4，0.356g/lznso4，0.256g/lfeso4，0.31g/lcuso4·5h2o。将l-α-磷脂酰肌醇经过细菌过滤器除菌，加入上述灭菌的培养液中，得到磷脂液体培养基，磷脂液体培养基中l-α-磷脂酰肌醇的浓度为50μmol/l。

核酸液体培养基的ph为6.0，配制方法如下：将溶剂是水，溶质及其浓度如下的培养液在115℃灭菌30min：0.3g/lmgso4·7h2o，0.2g/l(nh4)2so4，0.03g/lcacl2，0.9g/lnacl，0.5ml微量元素溶液/l，20g/l葡萄糖。其中，微量元素溶液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：1.23g/lmnso4，0.356g/lznso4，0.256g/lfeso4，0.31g/lcuso4·5h2o。将鲑鱼精dna经过细菌过滤器除菌，加入上述灭菌的培养液中，得到核酸液体培养基，核酸液体培养基中鲑鱼精dna的浓度为50μmol/l。结果表明，与作为受体菌的柠檬酸杆菌相比，在核酸液体培养基中(含鲑鱼精dna)、磷脂液体培养基(含l-α-磷脂酰肌醇)和磷酸肌醇液体培养基(含1,4,5-三磷酸肌醇)，有效磷的含量分别增加了14.59μmol/l、16.63μmol/l和18.55μmol/l(图7)。

<110>中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120>酸性磷酸酶的制备方法

<130>gncfh181696

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<213>巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）

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<213>巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）

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<213>巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）

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