本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种筛选具有高蛋白质分泌能力的微生物的方法。
背景技术
微生物普遍具备向细胞外分泌蛋白质的能力，在培养过程中会向培养基中分泌蛋白质。人们利用微生物的这种特性，从发酵后的培养基中获取特定的产物，例如从枯草芽孢杆菌培养液上清中制备淀粉酶，或者从里氏木霉发酵产物中获得纤维素酶。
鉴定评价微生物对特定蛋白质分泌能力的技术，是筛选获得高效分泌目的蛋白质微生物菌株的关键技术。通常根据某一微生物所分泌特定蛋白质的性质来设计微生物菌株筛选方案。常用的技术有基于酶和底物反应的底物降解法，或基于抗原抗体反应的免疫学方法。例如筛选微生物淀粉酶分泌能力的降解圈法；筛选纤维素分泌能力的刚果红染色法；筛选抗菌肽分泌能力的抑菌圈法。
基于免疫学方法对微生物分泌蛋白质能力的评价，目前的技术手段需要在水相溶液中进行，例如酶联免疫吸附法(elisa)和免疫比浊法(tia)。这就需要首先对微生物进行液体培养，再通过上述两种方法，测定培养基上清中目的蛋白质浓度，评价微生物对目的蛋白质分泌能力。虽然这种技术手段能够应用于任何评价任何一种微生物蛋白质的分泌能力，是一种不具有蛋白质种类特异性的通用技术手段。但是这一方法需要首先将在固体平板培养基上获得的单菌落，进一步转移到液体培养基中进行培养。这一过程需要人工挑选菌落接种于液体培养基中进行培养，导致过程繁琐，筛选通量较低。其次酶联免疫吸附法和免疫比浊法相对于固体平板培养基的脱色圈法或抑菌圈法，又不是一种直观的方法，进一步造成大规模筛选耗时较长，筛选通量较小。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对现有微生物分泌蛋白质鉴定方面存在的上述问题，提供一种筛选具有较高蛋白质分泌能力的微生物的方法。本发明是一种根据免疫学原理，利用抗原抗体之间反应形成沉淀的现象，通过固体平板培养法，直接筛选具有较高蛋白质分泌能力微生物的方法。
本发明通过将能够与特定蛋白质抗原发生反应的多克隆抗体加入到固体平板培养基中，然后在该平板固体培养基上涂布接种可以分泌这一特定蛋白质抗原的微生物，使生长形成微生物单菌落，微生物在生长过程中所分泌的特定蛋白质抗原可以扩散进入固体培养基中，并与其中的抗体发生中和沉淀反应，形成乳白色沉淀圈，可以根据沉淀圈和菌落大小之间的比例关系，确定微生物单菌落分泌特定蛋白质的能力。通过这一技术发明，可以对固体平板培养的微生物单菌落群体进行快速的某一蛋白质分泌能力鉴定筛选。
为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：
一种筛选具有高蛋白质分泌能力的微生物的方法，包括如下步骤：
s1、准备与待定微生物所分泌蛋白质能够发生反应的多克隆抗体血清；
s2、选定固体培养基，并将固体培养基在110℃～121℃条件下，高温灭菌处理30min～40min；待固体培养基降温至50℃～60℃时，向固体培养基中加入多克隆抗体血清，搅拌均匀后，倾倒入固体培养皿中，待用；
s3、将待定微生物进行稀释后，涂布于固体培养皿中进行单菌落分离培养；
s4、观察单菌落生长过程中所分泌蛋白质与多克隆抗体血清中的多克隆抗体中和反应形成的沉淀圈大小；
s5、根据沉淀圈与单菌落的直径比值，分析筛选得到具有较高蛋白质分泌能力的微生物。
进一步的，所述多克隆抗体血清内包含与待定微生物所分泌蛋白质能够发生反应的多克隆抗体。
进一步的，所述待定微生物为基因重组毕赤酵母，所述基因重组毕赤酵母能够高效分泌人c-反应蛋白。
进一步的，所述固体培养基为ypd培养基和多克隆抗体血清按照1000:8的体积比混合配制而成。
进一步的，所述ypd培养基的配方如下：蛋白胨20g/l；酵母提取物10g/l；葡萄糖20g/l；琼脂糖15g/l；余量为水。
进一步的，所述固体培养基的配制过程如下：
按照配方配制好ypd培养基；然后在115℃下灭菌30min；灭菌后的ypd培养基降温至55℃；最后，再向ypd培养基中加入相当于ypd培养基体积0.8％的多克隆抗体血清，迅速搅拌均匀后，倾倒入固体培养皿中即得到固体培养基。
进一步的，所述固体培养基的厚度d满足：1mm＜d＜3mm。
进一步的，s3中将待定微生物进行1×106倍的稀释。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：能够快速筛选出具有较高某一蛋白质分泌能力的微生物。且因为我们的固体培养基是根据待定微生物的种类确定的，多克隆抗体血清也是根据待定微生物分泌蛋白质的种类确定的，所以本申请的这种方法具有普适性。
附图说明
图1是本发明重组crp毕赤酵母在含有crp抗体的固体培养基平板上生长，形成的盘状抗原抗体沉淀带的示意图；
图2是本发明重组crp毕赤酵母在含有crp抗体的固体培养基平板上生长，将菌落冲洗脱离后，观察到的典型抗原抗体沉淀环的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达到目的与功效易于明白了解，下面将结合实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例
本实施例以筛选高效分泌人c-反应蛋白(crp)的基因重组毕赤酵母为例，说明本申请的实施过程：
s1、准备与基因重组毕赤酵母所分泌的人c-反应蛋白能够发生反应的多克隆抗体血清，能够与人c-反应蛋白发生反应的多克隆抗体血清内包含人c-反应蛋白多克隆抗体。
人c-反应蛋白多克隆抗体血清是通过使用人c-反应蛋白作为抗原，免疫波尔山羊，并抽取山羊血浆制备的山羊抗人c-反应蛋白抗血清。
波尔山羊免疫过程如下：
2mg/ml的人c-反应蛋白抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分混合后对波尔山羊腋下部位进行基础免疫，基础免疫用抗原-佐剂混合物体积为1ml。基础免疫后4周，再对山羊进行加强免疫一次，免疫用抗原为上述人c-反应蛋白抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后得混合物，免疫部位和剂量与基础免疫相同。
山羊抗人c-反应蛋白抗血清的制备。
加强免疫后6天，通过山羊颈静脉采集血浆50ml。3500g×10min离心后取上清，上清即为山羊抗人c-反应蛋白多克隆抗体血清。抗人c-反应蛋白多克隆抗体血清中含有能够与c-反应蛋白发生中和沉淀反应的多克隆抗体。
s2、固体培养基的制备
固体培养基为ypd培养基和多克隆抗体血清按照1000:8的体积比混合配制而成。
ypd培养基配方如下：蛋白胨20g/l；酵母提取物10g/l；葡萄糖20g/l；琼脂糖15g/l；余量为水。
固体培养基的配制过程如下：
按照上述成分配置好ypd培养基后，将ypd培养基置于115℃条件下灭菌30分钟。灭菌后的上述ypd培养基置于55℃水浴锅中进行降温，降温完成后，再向ypd培养基中加入相当于ypd培养基体积0.8％的c-反应蛋白克隆抗体血清，迅速混匀后，倾倒固体培养皿即得到固体培养基，固体培养基厚度d满足：1mm＜d＜3mm。
s3、基因重组毕赤酵母在固体培养基上的培养
该重组毕赤酵母染色体整合有甘油脱氢酶启动子(gap启动子)控制的人crp蛋白基因，可以在ypd培养基上组成型表达crp蛋白。
将经过30秒紫外诱变的该重组毕赤酵母细胞，经过1×106倍稀释后，涂布于s2中制备的固体培养基上，置于30℃条件下培养72小时。
s4、观察单菌落生长过程中所分泌蛋白质与多克隆抗体血清中的多克隆抗体中和反应形成的沉淀圈大小
观察重组酵母单菌落在固体培养基上生长过程中所分泌蛋白质与多克隆抗体中和反应形成的沉淀圈大小，如图1所示。图2是重组crp毕赤酵母在含有crp抗体的固体培养基平板上生长，将菌落冲洗脱离后，观察到的典型抗原抗体沉淀环。通过图1和图2能够直观判断酵母单菌落分泌crp蛋白质的能力。或者通过成像仪拍照，进一步对沉淀圈直径(p)和菌落直径(c)进行对比分析。以p/c的数值作为判断标准，该数值越大，表明重组酵母单菌落分泌crp蛋白的能力越强。
为了进一步的验证通过上述方法筛选的重组酵母单菌落具有高的蛋白质分泌能力，我们还通过液体培养对上述所筛选的重组酵母单菌落进行验证。
将通过上述方法筛选得到的3个p/c的数值较大的重组人crp毕赤酵母单菌落，接种于液体ypd培养基中，液体ypd培养基的配方为蛋白胨20g/l；酵母提取物10g/l；葡萄糖20g/l；余量为水。同时设置未诱变菌株作为阴性对照。所有接种有上述酵母的液体ypd摇瓶置于振荡摇床上，以30℃160转/分钟进行72小时振荡培养。培养物进行2000g×10min离心，并取上清用于酶联免疫吸附法(elisa)测定培养基中crp含量，elisa测定方法依据试剂盒说明书进行操作。酶联免疫吸附法测定结果见下表1。测定结果表明，通过固体平板免疫沉淀圈法所筛选得到的具有较高crp分泌能力的重组酵母单菌落，比诱变前的菌株具有更高的重组蛋白分泌能力。
表1酶联免疫吸附法对固体平板培养免疫单扩散法筛选结果的验证
需要说明的是，本申请的固体培养基并不限定于固体ypd培养基；本申请的待定微生物并不限定于重组酵母单菌落。本申请的固体培养基种类根据具有较高蛋白质分泌能力的微生物确定，本申请的多克隆抗体血清也是根据待定微生物所分泌蛋白质的种类确定，所以本申请的这种鉴定方法具有普适性。综上所述，本申请的方法不仅能够快速筛选出具有较高蛋白质分泌能力的微生物，而且普适性较高。
以上公开的仅为本发明的较佳实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。