一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒的制作方法

本发明属于鱼类生物技术领域，特别是海水鱼精液外泌体标志物应用领域，具体地为一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒。

背景技术

半滑舌鳎雌、雄鱼生长速度差异巨大，无论是自然界还是养殖环境都不同程度的存在着伪雄鱼。伪雄鱼的染色体是zw型，而它的生殖器官则和雄鱼一样，也可以产生精子且繁育后代。伪雄鱼还可通过遗传逐代积累，就导致了半滑舌鳎雌雄比例的失衡。因此开发鉴别半滑舌鳎伪雄鱼的方法不仅具有理论意义，而且也具有生产价值和市场价值。

鱼类性别鉴定有多种方法：生理解剖观察、性腺切片、性腺细胞观察、雌性特异分子标记等。有些方法虽然简单易行，但是结果可能不准确，有些方法则需要剖杀鱼。外泌体内含物micrornas，其在进化上高度保守，性质稳定，易于定量检测，具有生物标签的特性，对于鱼类性别鉴定的具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼识别问题，提出一种半滑舌鳎精液来源的外泌体micrornas作为生物标记物识别雄鱼及伪雄鱼的方法。

本发明是采取以下技术方案实现的：

半滑舌鳎精浆外泌体microrna在性别鉴定中的应用，microrna性别标签为dre-mir-10d-5p，其序列为taccctgtagaaccgaatgtgtg。

本发明还提供一种所述microrna性别标签的筛选方法如下：

1)精浆外泌体分离鉴定后，对精浆外泌体smallrna进行测序分析，将cleanreads依次和rfam数据库、cdna序列、物种重复序列库、mirbase数据库对测序结果中的smallrna进行分类注释；将分类注释后的序列和mirbase数据库比对，进行已知microrna的统计；使用未注释上的序列进行新的microrna预测，microrna差异表达分析，差异表达mirna靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种样品具有指示作用的microrna作为候选micrornas生物标记物；

2)将候选标签micrornas按照以下四个标准进行过滤：(1)在两种样品中表达有极显著差异，即p值小于0.01；(2)与已知数据库进行比对确认存在的micrornas；(3)两样品中至少有一个的tpm值大于10；(4)foldchange值大于4，所述foldchange值＝tpmsample_zz./tpmsample_zw；最终筛到了23个microrna作为候选标签进行验证。

3)提取两组验证样本：经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总rna，利用microrna定量分析试剂盒定量检测步骤2)过滤后的micrornas的差异表达情况，筛选出最具标签指示作用的mirnas作为最终的标签micrornas；根据统计学分析原理，p值小于0.05为显著差异，最终筛选到dre-mir-10d-5p，序列为taccctgtagaaccgaatgtgtg，此种标签在雄鱼样本中有高表达，而在伪雄鱼样本中表达量极低。依据microrna定量分析结果，进行雄鱼和伪雄鱼的判定。

本发明还提供了一种半滑舌鳎性别鉴定试剂盒，所述试剂盒包括dre-mir-10d-5p定量检测引物，所述引物序列为f1：cggttaccctgtagaaccg；反向引物r1：tcgtatccagtgcagggtc，逆转录引物dre-mir-10d-5p-rt:gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacacatt；内参基因为u6，以及其它逆转录试剂和pcr荧光定量试剂。

进一步，u6的引物为：u6-f：ctcgcttcggcagcacatatact；u6-r：acgcttcacgaatttgcgtgtc。

进一步，引物探针序列的5’端标记了荧光基团，3’端标记淬灭基团，以适合taqmanprobe-basedqrt-pcr方法检测。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明运用精液外泌体micrornas进行半滑舌鳎雄鱼和伪雄鱼的判定，准确率达90％以上，且鉴定结果可靠，不会对鱼体造成创伤。

本发明同时利用该鉴别标签开发了检测的试剂盒，设计了针对该标签的扩增引物，方便快捷，简单高效。

附图说明

图1是本发明提出的标志microrna经20个验证样本验证后的qrt-pcr表达量；

图2本发明20个验证样本验证后在两组样本的qrt-pcr表达量均值。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

一种半滑舌鳎精浆外泌体mirnas作为生物标记物的筛选确定

1、精液样本的收集收集半滑舌鳎性成熟雄鱼及伪雄鱼精液各50尾，每尾取0.5ml精液于离心管中用于外泌体分离鉴定。

2、外泌体的提取

(1)精液样本取0.5ml转移1.5mlep管，放置于4℃，1200g离心15min去除精子细胞，4℃，15000g离心20min去除小细胞杂质和碎片，用pbs稀释1倍后，使用0.45um滤膜进行预过滤，过滤液再经0.22um滤膜过滤。

(2)样品用sbiexoquick-tcfortissueculturemediaandurine试剂盒提取外泌体。

(3)离心后去上清，收集溶解样并完全转移至一个无rna酶的2ml管中。

3、外泌体的鉴定：日立h600iv型透射电镜观察，透射电镜分析鉴定后，剩余样品用于rna提取和测序分析。

4、外泌体的microrna测序分析

trizol法提取外泌体的rna，质检后构建小rna文库并基于illumina平台测序，完成测序后进行数据过滤分析，将cleanreads依次和rfam数据库、cdna序列、物种重复序列库、mirbase数据库进行比对注释。将注释后的序列和mirbase数据库比对，进行已知microrna的统计。使用未注释上的序列进行新的microrna预测，microrna差异表达分析，差异表达mirna靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与雄鱼、伪雄鱼两个样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对雄鱼、伪雄鱼两种样品具有指示作用的mirna作为候选标签micrornas。

5、将候选标签micrornas按照以下四个标准进行过滤：(1)在两种样品中表达有极显著差异，即p值小于0.01；(2)与已知数据库进行比对确认存在的micrornas；(3)两样品中至少有一个的tpm值大于10；(4)foldchange值大于4，所述foldchange值＝tpmsample_zz./tpmsample_zw；最终获得23个候选的microrna进行验证。

6、提取两组验证样本：经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总rna，利用microrna定量分析试剂盒定量检测步骤5)过滤后的micrornas差异表达情况，选取2^-δδct进行计算分析，筛选出最具标签指示作用的micrornas作为最终的标签micrornas；根据统计学分析原理，p值小于0.05为显著差异，最终筛选到dre－mir－10d－5p，序列为taccctgtagaaccgaatgtgtg，此种标签在雄鱼样本中有高表达，而在伪雄鱼样本中表达量极低。

实施例2

利用半滑舌鳎精浆外泌体microrna标志物鉴定雄鱼和伪雄鱼

基于精液外泌体microrna标志物dre－mir－10d－5p的鉴定试剂盒包括dre－mir－10d－5p的检测引物；所述引物序列为f1：cggttaccctgtagaaccg；反向引物r1：tcgtatccagtgcagggtc，引物包含逆转引物dre-mir-10d-5p-rt:gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacacatt；内参基因为u6，u6的引物为：u6-f：ctcgcttcggcagcacatatact；u6-r：acgcttcacgaatttgcgtgtc,此外试剂盒包含定量pcr反映的其它常规试剂：逆转录酶，taq酶，dntp，缓冲液，mgcl2，depc水及对照品。引物探针序列的5’端标记了荧光基团，3’端标记淬灭基团，以适合taqmanprobe-basedqrt-pcr方法检测。

该试剂盒应用的反应体系为10ul体系，即0.5ul10*microrna引物探针、5ul2*mastermix、2.5ulddh2o、2ulcdna模版。使用thermofisher的q6实时荧光定量pcr检测，反应的程序为：95℃2min；95℃10s,59℃60s,循环40次。样品检测设3个平行。利用特异引物检测经染色体确认的10尾半滑舌鳎伪雄鱼和10尾半滑舌鳎雄鱼的标签microrna，即dre－mir－10d－5p的表达情况，结果如表1、图1、图2所示。该标签在两组样本中的表达差异极为显著(p＜0.01)，验证标签mcroirna的检测准确率达90％以上.

对于本领域的技术人员，对本发明针对的构思及技术要点进行变形，相应的改变应属于本发明所请求的权利要求。

表120个验证样本qrt-pcr表达数据

序列表

<110>天津渤海水产研究所

<120>一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>半滑舌鳎(cynoglossussemilaevisgunther)

<400>4

taccctgtagaaccgaatgtgtg23

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cggttaccctgtagaaccg19

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcgtatccagtgcagggtc19

<210>4

<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacacatt51

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ctcgcttcggcagcacatatact23

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acgcttcacgaatttgcgtgtc22