一种LPOR蛋白的表达纯化方法与流程

本发明涉及蛋白质工程技术领域，特别是涉及一种lpor蛋白的表达纯化方法。

背景技术：

lpor(light-dependentprotochlorophyllideoxidoreductase)是蓝细菌、藻类和多细胞植物叶绿素合成的关键酶。在光合作用途径中，生物体催化原叶绿素酸酯pchlide还原有2种不同的还原酶：一种是依赖光的lpor(light-dependentnadph:protochlorophyllideoxidoreductase)；另一种是不依赖光的pchlide氧化还原酶dpor(light-independentpchlidereductase)。lpor或dpor作为原叶绿素酸脂还原催化酶，是光合营养生物中叶绿素合成的关键酶，这两个酶均广泛存在于光营养生物中，但是，dpor与lpor在分子结构、亚基组成、基因组编码和催化反应机制等方面完全不一样。dpor是由叶绿体基因组编码，由3个蛋白质亚基组成；lpor是由细胞核基因组编码；其中dpor和lpor的功能相似，均能够催化pchlided环双键的还原。其中，无氧光合细菌只有dpor；裸子植物、藻类、蓝细菌和光合细菌具有dpor和lpor；被子植物只有lpor。在近十年里，lpor的调控、功能和催化机制等方面的研究取得了较大的进展，但是由于一直没有揭开lpor三维结构的神秘面纱，对彻底阐明和确定lpor的催化机理或将其工程化构成了一种无法逾越的屏障，多年来，科学家们试图用电脑模拟的手段来为生化学家提供线索，然而这些都只是推测，而对lpor蛋白结构解析的难点，则是lpor蛋白的纯化和结晶过程。

蛋白质提纯技术应用广泛，以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，而研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面：一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。虽然蛋白质的纯化技术已经非常成熟，但是对于一些极度不稳定的光敏蛋白，还是目前蛋白提纯研究的难点。

因此，提供一种lpor蛋白的表达纯化方法，使得lpor蛋白具有较高的活性是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了提供一种lpor蛋白的表达纯化方法，使得lpor蛋白具有较高的活性，为其他光敏感超速蛋白的表达纯化提供实验技术，为光敏感超速蛋白的结构解析奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种lpor蛋白的表达方法，包括以下步骤：

(1)筛选lpor基因的dna序列

根据genebank中公布的lpor蛋白的核苷酸序列nc_004113设计引物，并在所述引物两端加入bsphi/bamhi酶切位点，从所述nc_004113序列中筛选lpor基因的dna序列为seqidno3，并选择原核表达载体；

其中所述引物序列为

lporn：5’-tcatgaatgagtgatcagccacg-3’；seqidno1；

lporc：5’-ggatccggccaatcccaccagtttttc-3’；seqidno2；

(2)将步骤(1)得到的lpor基因的所述dna序列进行pcr扩增；

(3)双酶切

将步骤(2)得到的pcr产物纯化后分别用bsphi/bamhi双酶切，同时将所述原核表达载体用bsphi/bamhi双酶切，回收酶切后的pcr产物和原核表达载体大片段；

(4)lpor表达载体构建

将步骤(3)得到酶切后的pcr产物和原核表达载体大片段，按10:1-5:5的比例混合连接，并将得到的连接产物转入感受态细胞中，得到lpor表达载体；

(5)lpor表达载体的筛选

将步骤(4)得到的所述lpor表达载体挑取在筛选平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，提取质粒，酶切验证正确后测序确认；将测序结果正确的lpor表达载体保存备用。

(6)lpor蛋白表达

将步骤(5)中构建好的lpor表达载体转入原核表达菌株中，在25-37℃下培养24-48h，加入诱导剂表达lpor蛋白。

其中，本发明步骤(2)中pcr扩增条件为：95℃4min，经95℃40sec、55℃30sec、72℃1min循环扩增25次。

其中，本发明步骤(6)中根据lpor蛋白的表达进行pull-down检测结果，表达量多且小量pull-down结果杂带较少，可用于lpor蛋白的纯化。

进一步地，步骤(1)中所述原核表达载体为pehistev、pbadhistev1、pebmschis或pebsrctevc10his中的一种。

进一步地，步骤(4)中所述感受态细胞为大肠杆菌dh5α。

进一步地，步骤(5)中所述筛选平板培养基为含有50-150mg/l的卡那霉素或氨苄霉素抗性的培养基。

进一步地，步骤(6)中所述原核表达菌株为大肠杆菌c43、大肠杆菌bl21或194菌株。

进一步地，步骤(6)中所述诱导剂为0.1-1.0mm的iptg或质量浓度为0.01-0.05％的l-arabinose。

一种lpor蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

(1)his-tag亲和层析

将权利要要求1步骤(6)中经过诱导剂诱导的菌液离心，收集菌体细胞并利用清洗液清洗，再用平衡液漂洗，最后用35ml/g的平衡液重悬，将收集好的菌液超声破碎，离心后取上清液，后真空过滤，再进行his-tag亲和层析；

(2)蛋白浓缩

将步骤(1)得到的蛋白加入超滤杯中，3000-5000rpm，离心，直至达到所需体积后停止离心，并测定蛋白浓度；

(3)凝胶过滤

将步骤(2)得到的浓缩蛋白加入0.5umnadph辅酶后进行凝胶过滤层析，收集蛋白样品，将所述蛋白样品进行sds-page分析，得到单一目标条带的蛋白样品，再利用所述超滤杯浓缩蛋白样品至浓度为10-15mg/ml。

优选的，步骤(1)菌液离心方法为3000-5000rpm，20min。

优选的，步骤(1)清洗液为0.1mm的pbs液体。

优选的，步骤(1)菌液超声破碎方法为功率200w，1/2探头，破碎30s，间歇30s。

优选的，步骤(1)菌液超声破碎后的离心方法为16000-19000rpm，离心20min。

优选的，his-tag亲和层析纯化方法，包括平衡、上样、洗涤、洗脱和保存，其具体操作方法为：

平衡：用平衡液(上样缓冲液)平衡预装柱，打开紫外检测仪，调节波长至280nm，灵敏度为100％，预热，使液体匀速向下流(3ml/min)，此时，调节光量，使吸光值保持100稳定，此时为调满，待吸光值稳定后，调节灵敏度为0.5a/0.2a，使吸光值保持0稳定，此时为调基线。

上样：将提前处理好的样品缓慢加入柱内，避免气泡的产生，保持尽量较低的流速(1ml/min)，待吸光值大于20时，用50ml离心管接流出的蛋白溶液，称流穿，流穿内的蛋白应为未与凝胶结合的菌体蛋白。

洗涤：沿壁缓缓加入结合缓冲液，打开开关，走大于10柱体积的结合缓冲液，流速3ml/min使吸光值恢复到基线或接近于基线水平。

洗脱：首先选择50mm咪唑作为流洗浓度，主要洗脱非特异结合在凝胶中的菌体蛋白，100-500mm咪唑作为洗脱浓度，主要洗脱目的蛋白，并将每个洗脱浓度的蛋白进行sds电泳检测。

保存：洗脱结束后，用3倍柱体积灭菌水清洗柱子，注入20％乙醇，使凝胶充分浸在乙醇中，4℃保存备用。

其中，超滤杯先用双蒸水涮洗三遍，然后在超滤杯内加入双蒸水，3000rpm，离心10min，将滤膜彻底清洗干净，倒掉双蒸水，再加入待浓缩的蛋白样品。

优选的，步骤(2)中测定蛋白浓度的方法为nanodrop。

优选的，凝胶层析方法为：将预装好的柱子连接仪器akta-xpress，利用凝胶过滤缓冲液，进行1.5倍柱体积的平衡；待平衡结束后，注入步骤(2)得到的样品，调整流速1ml/min，打开uv检测系统，待蛋白流出时，进行样品收集，结束后，用1.5倍柱床体积双蒸水清洗柱子，保存备用。

进一步，步骤(1)中所述真空过滤为选用0.45μm的滤膜进行过滤。

进一步，步骤(2)中所述超滤杯为30kd超滤杯。

进一步，步骤(3)中所述凝胶过滤层析选用sephadexg-75凝胶层析柱。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种lpor蛋白的表达纯化方法，具有如下技术优点：

本发明提供了一种lpor蛋白的表达纯化方法，解决了目前光合作用中重要的lpor蛋白的纯化问题，且具有较高的活性，为彻底阐明和确定lpor蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础；以及为进一步地了解光敏感超速蛋白的结构奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的以pehistev为表达载体的lpor表达载体简图。

图2附图为本发明提供的以pebmschis为表达载体的lpor表达载体简图。

图3附图为本发明提供的以pbadhistev1为表达载体的lpor表达载体简图。

图4附图为本发明提供的以pebsrctevc10his为表达载体的lpor表达载体简图。

图5附图为本发明提供的在不同表达菌株、不同诱导温度及不同诱导剂下的pull-down条带图。

图6附图为本发明提供的上样样品中未加入nadph酶的凝胶过滤曲线图。

图7附图为本发明提供的目标蛋白sds-page电泳图。

图8附图为本发明提供的上样样品中加入nadph酶的凝胶过滤曲线图。

图9附图为本发明提供的lpor蛋白的活性分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

lpor蛋白的表达

根据genebank中公布的lpor(thermosynechococcus)蛋白的核苷酸序列(nc_004113)设计引物，从thermosynechococcus中克隆lpor基因dna序列，引物两端加入bsphi/bamhi酶切位点，选择原核表达载体pehistev、pbadhistev1、pebmschis和pebsrctevc10his作为目标载体。其中分别以pehistev、pbadhistev1、pebmschis和pebsrctevc10his为表达载体的lpor表达载体简图如图1-4。

其中pcr扩增条件为：95℃4min，经95℃40sec、55℃30sec、72℃1min循环扩增25次。pcr产物纯化后和表达载体pehistev、pbadhistev1、pebmschis和pebsrctevc10his质粒分别用bsphi/bamhi双酶切，回收酶切后的pcr产物和表达载体大片段，按7:3混合连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α，挑取在卡那霉素(pehistev)/氨苄霉素(pbadhistev1，pebmschis，pebsrctevc10his)抗性平板上生长阳性单克隆，取质粒，酶切验证正确后测序确认；将测序结果正确的lpor表达载体保存备用。

将上述构建好的原核表达载体分别转入原核表达菌株大肠杆菌c43、大肠杆菌bl21或pe194中，不同表达载体，在不同表达菌株、不同诱导温度及不同诱导剂(iptg/l-arabinose)浓度条件下，即如表1中的各组条件下进行lpor蛋白表达。

将表1中各组中得到的lpor蛋白进行pull-down检测，确定最佳表达条件，结果如图5。

表1不同条件下进行lpor蛋白表达

根据图5可知，最佳表达条件为pebsrctevc10his—c43—37℃—0.4mmiptg，表达量多且小量pulldown结果杂带较少，可用于lpor蛋白的纯化。

实施例2

lpor蛋白的纯化

(1)his-tag亲和层析

将经过诱导剂诱导的菌液离心，5000rpm，20min。收集菌体细胞，用pbs漂洗两遍，再用纯化所用的平衡液漂洗一遍，最后用平衡液重悬(35ml/g菌体沉淀)，将收集好的菌液超声破碎，功率200w，1/2探头，破碎30s，间歇30s，19000rpm，离心20min，取上清，用0.45μm滤膜真空过滤，后进行his-tag亲和层析。

其中his-tag亲和层析纯化方法，包括平衡、上样、洗涤、洗脱和保存，其具体操作方法为：

平衡：用平衡液(上样缓冲液)平衡预装柱，打开紫外检测仪，调节波长至280nm，灵敏度为100％，预热，使液体匀速向下流(3ml/min)，此时，调节光量，使吸光值保持100稳定，此时为调满，待吸光值稳定后，调节灵敏度为0.5a/0.2a，使吸光值保持0稳定，此时为调基线。

上样：将提前处理好的样品缓慢加入柱内，避免气泡的产生，保持尽量较低的流速(1ml/min)，待吸光值大于20时，用50ml离心管接流出的蛋白溶液，称流穿，流穿内的蛋白应为未与凝胶结合的菌体蛋白。

洗涤：沿壁缓缓加入结合缓冲液，打开开关，走大于10柱体积的结合缓冲液，流速3ml/min使吸光值恢复到基线或接近于基线水平。

洗脱：首先选择50mm咪唑作为流洗浓度，主要洗脱非特异结合在凝胶中的菌体蛋白，100-500mm咪唑作为洗脱浓度，主要洗脱目的蛋白，并将每个洗脱浓度的蛋白进行sds电泳检测。

保存：洗脱结束后，用3倍柱体积灭菌水清洗柱子，注入20％乙醇，使凝胶充分浸在乙醇中，4℃保存备用。

(2)蛋白浓缩

由于亲和层析柱纯化出的蛋白浓度过低，在进行凝胶层析过滤之前使用超滤杯方法对其进行浓缩。选择30kd超滤杯，用双蒸水涮洗三遍，然后在超滤杯内加入双蒸水，3000rpm，离心10min，将滤膜彻底清洗干净，倒掉双蒸水，加入待浓缩的蛋白样品，3000rpm，离心，直至达到所需体积(7ml)后停止离心，利用nanodrop测定蛋白浓度。

(3)凝胶过滤

根据lpor蛋白分子量大小为36.99kd，选择sephadexg-75凝胶层析柱。将预装好的柱子连接仪器akta-xpress。利用凝胶过滤缓冲液，进行1.5倍柱体积的平衡。待平衡结束后，注入亲和层析后浓缩得到的7ml样品，调整流速1ml/min，打开uv检测系统，待蛋白流出时，进行样品收集，结束后，用1.5倍柱床体积双蒸水清洗柱子，保存备用，收集得到的样品(2ml/管)，其对应的凝胶过滤曲线图如图6，其中，图中的圈出的部分为目标蛋白。将收集到的样品进行sds-page分析，如图7。将得到单一目标条带的蛋白样品，用30kd超滤杯浓缩，至蛋白浓度10-15mg/ml。

实施例3

lpor蛋白的纯化

本实施例将步骤(2)得到的浓缩蛋白加入nadph辅酶后，进行sephadexg-75凝胶层析过滤，其中凝胶过滤曲线图如图8，其中，图中的圈出的部分为目标蛋白，其他技术特征与实施例2一致，在此不再一一赘述。

由图6和图7可知，nadph辅酶对样品的结构稳定起到一定作用，在凝胶层析过滤前加入nadph辅酶。对样品分离起到积极作用。

实施例4

lpor蛋白的活性分析

取黑色避光96孔板，在a1-a4中分别加入下列物质：a1水50ul；a2nadph0.5ul、水49.5ul；a3pchlid5ul、水45ul；a4蛋白5ul、pchlid5ul、nadph0.5ul、水39.5ul。将96孔板放入核酸蛋白检测系统，设置激发光450nm，5s，发射光600-800nm，检测600-800nm的峰值。结果如图9，nadph+水组分没有特异吸收峰；pchlid+水组分在635nm有特异吸收峰，为底物原叶绿素酸酯峰；nadph+pchlid+lpor+水组分在635nm有底物原叶绿素酸酯峰，在675nm处有产物叶绿素酸酯峰。lpor蛋白具有酶学活性，能催化原叶绿素酸酯反应生成叶绿素酸酯。

本发明提供了一种lpor蛋白的表达纯化方法，解决了目前光合作用中重要的lpor蛋白的纯化问题，且具有较高的活性，为彻底阐明和确定lpor蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础；以及为进一步地了解光敏感超速蛋白的结构奠定了基础。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>浙江善测禾骑士生物科技有限公司

<120>一种lpor蛋白的表达纯化方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcatgaatgagtgatcagccacg23

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggatccggccaatcccaccagtttttc27

<210>3

<211>978

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcatgaatgagtgatcagccacgcccaacggtcattattacgggtgcatcctctggagtc60

ggattgtatgctaccaaggccttagccaatcggggctggcacgttataatggcctgccgc120

aatcttgaaaaagcagagcaagccgccaaaaacttgcagattccgccggaggcctacacg180

attttgcacttggacttgtcctccttggccagtgtgcgcggctttgttgaatcatttcgg240

gcattgaatcgccccttgcgtgcccttgtctgcaatgccgctgtctattatcccctgctc300

aaggaacctatctacagtgtggatggctatgaaatcactgtggccaccaaccatttgggg360

cattttcttttgatcaacctgctgctagaagacttgaaaaattctcccgaaagcgataag420

cgcttggtgattctcggcacagtgacagccaaccgcaaagaactcggcggtaaaattccc480

attcctgctccccctgatttgggcaacctcgaaggctttgaaaaaggcttcaagaagccg540

attgccatgattaacggtaagcccttcaagtcgggcaaggcctacaaagacagcaagctc600

tgcaatatgctgacggcacgggaactgcatcgccgctttcacgagagcaccggaattgtt660

tttaattccctttaccccggttgtgtggccgacacacccctgtttcgccaccacttcccc720

ctgtttcagaaactcttccccctcttccagaaaaagattactgggggctatgtcagccaa780

gaactggcgggtgagcgcgtcgcgatggtggtcgcagacccagagtttcgccagtcgggg840

gtccactggagctggggtaatcgccaaaaagaaggccgcaaagcctttgtccaagaacta900

tcggcagaggcaagtgatgagcaaaaagcccgccgtctttgggagctgagtgaaaaactg960

gtgggattggccggatcc978