人脐带间充质干细胞培养方法及其成软骨分化的培养方法与流程

本发明属于干细胞培养技术领域，涉及人脐带间充质干细胞培养方法及其成软骨分化的培养方法。

背景技术：

人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hucmscs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞(mscs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。从人脐带中分离出mscs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓mscs，免疫原性比骨髓mscs低，其成集落生长潜能及成骨时间早于骨髓等其他来源间充质干细胞。

关节软骨损伤是一种由创伤或过度活动等原因导致的关节疾病，是人类面临的主要运动性疾病之一。软骨损伤后，如不经治疗，随着受损面积和深度的增加，大多会出现关节疼痛、肿胀、畸形及功能障碍等症状，并最终导致骨性关节炎的发生，严重影响生活质量，并给患者个人、家庭和社会带来巨大经济负担。有文献报道关节软骨损伤发生率约为5％，对于某些特定人群如运动员发生率则高达22％-50％。随着世界人口老龄化加剧，关节软骨损伤发病率正日益增加，与之相关的医疗费用、社会生产力损失及额外经济负担也随之增加。

关节软骨损伤的修复已成为近年来医学基础研究的一个重要领域。由于关节软骨损伤后不易修复,决定了关节软骨损伤的修复是热点中的难点，软骨移植、软骨细胞移植、组织工程技术及凝胶类关节软骨修复材料是目前对关节软骨损伤进行修复的主要手段。目前，组织工程构建的工程软骨存在许多不足。有研究发现和正常软骨相比，工程软骨浅层缺少胶原纤维结构，表面刚度和保水能力都较低。而且软骨组织工程中存在如何获取足够数量的种子细胞以及优化组织工程软骨性能的问题。

经过二十多年的发展，软骨组织工程学以骨髓间充质干细胞(bmscs)和关节软骨细胞为种子细胞的研究已渐趋成熟，目前均有成功运用其修复关节软骨缺损的临床报道。如果选择人脐带间充质干细胞(hucmscs)作为研究对象，其来源广泛，取材方便，具有多向分化潜能，比bmscs具有更强的增殖能力、较低的hla-abc和hla-dr表达，更好的粘附性和成软骨分化特性，是理想的软骨组织工程种子细胞。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种提高细胞增殖率的人脐带间充质干细胞的培养方法，目的之二在于提供一种人脐带间充质干细胞成软骨分化并有所增殖的培养方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种人脐带间充质干细胞的培养方法，所述培养方法为对人脐带间充质干细胞的培养给予低强度脉冲超声刺激。

进一步，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，30-50mw/cm2。

进一步，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，50mw/cm2。

进一步，人脐带间充质干细胞培养的培养基为dmem培养基含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺以及1％50u/ml青、链霉素。

2.一种人脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，将人脐带间充质干细胞在软骨诱导液培养下给予低强度脉冲超声刺激。

进一步，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，≤30mw/cm2。

进一步，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，30mw/cm2。

进一步，先将人脐带间充质干细胞用含10％胎牛血清的dmem培养基培养至细胞融合至60-80％，更换软骨诱导液培养，再进行低强度脉冲超声刺激。

以上任一项所述的人脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法中，所述软骨诱导液为dmem培养基含100nmol/l地塞米松、1％its、10ng/ltgf-β、50mg/ml抗坏血酸、40mg/ml脯氨酸、100mg/ml丙酮酸钠、10％胎牛血清。

本发明的有益效果在于：本发明建立了人huc-mscs体外培养及成软骨分化培养方法，体外应用低强度脉冲超声波发生装置(lipus)对培养人脐带间充质干细胞进行应力加载，筛选出促进人脐带间充质干细胞增殖、成软骨分化的最适宜的lipus加载强度和时间参数，并探讨lipus应力加载对人脐带mscs的增殖和成软骨分化生物学特的影响，为软骨组织工程中体外应用生物反应器大规模扩增培养软骨种子细胞提供力学依据，并为进一步研究应力加载下人脐带间充质干细胞成软骨分化中的力学信号转导机制提供基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为sonacell超声设备；

图2为p2代hucmscs培养4h后贴壁细胞图；

图3为hucmscs培养4-5d后贴壁细胞图；

图4为lipus刺激下hucmscs培养10天时细胞图；

图5为lipus刺激和成软骨诱导培养7d的细胞图；

图6为5min/dlipus刺激培养5d时，各实验组细胞图；

图7为不同刺激时间，不同刺激强度下各实验组细胞增殖率柱状图；

图8为不同刺激时间，不同刺激强度下并成软骨诱导培养2周时各实验组细胞图；

图9为复合诱导组中各实验组col2a1和gag浓度柱状图；

图10为复合诱导组中各实验组细胞阿利新蓝染色图；

图11为复合诱导组中各实验组细胞col2a1细胞免疫荧光；

图12为复合诱导组中各实验组细胞col2a1细胞免疫+dapi染色结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所用的低强度脉冲超声(lowintensitypulsedultrasound，lipus)由sonacell超声设备提供。sonacell超声设备(加拿大intelligent-nano公司)是基于生物学和临床研究的基础上设置的。

hucmscs细胞(人脐带间充质干细胞，购自广州赛业生物科技有限公司，货号huxuc-01001)。

细胞培养基为脐带间充质干细胞完全培养基(购自广州赛业生物科技有限公司，货号huxuc-90011，dmem培养基含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺以及1％50u/ml青、链霉素)。

脐带间充质干细胞成软骨诱导分化完全培养基(购自广州赛业生物科技有限公司，货号huxuc-90041)。

实施例1

sonacell超声设备参数：声波频率(ultrasoundfrequency)＝1.5mhz，脉冲重复频率(pulserepetitionrate)＝1khz，占空比(pulsedutycycle)＝20％，输出超声强度范围为0～100mw/cm²。如图1所示，低强度脉冲超声加载装置上的4个探头元件分别对应12孔细胞培养板的a1、b2、c1、c3位置，分别代表脉冲超声强度30mw/cm²、50mw/cm²、0mw/cm²、80mw/cm²。实验时超声探头通过耦合剂紧贴细胞培养板底部进行，脉冲超声刺激时间可控制调节。

4个探头元件所输出的脉冲超声强度分别为0mw/cm²、30mw/cm²、50mw/cm²、80mw/cm²。实验分为4组：对照组(c组，输出超声强度0mw/cm²)、lipus刺激l30组(输出超声强度30mw/cm²)、l50组(输出超声强度50mw/cm²)、l80组(输出超声强度80mw/cm²)，每组做4组重复实验。实验时超声探头通过耦合剂紧贴板底部进行，脉冲超声刺激时间可控制调节。

(1)研究lipus对huc-mscs细胞增殖效应：

取第4代hucmscs细胞(人脐带间充质干细胞，购自广州赛业生物科技有限公司，货号huxuc-01001)以1.5x10⁴/ml的密度100ul接种至96孔板中，随机分为4组：对照组(c组)、lipus刺激l30组(输出超声强度30mw/cm²)、l50组(输出超声强度50mw/cm²)、l80组(输出超声强度80mw/cm²)，每组做4组重复实验。细胞培养24h换液，将细胞培养板通过耦合剂接触sonacell超声设备的探头元件并放置于细胞培养箱中进行刺激，一块板子同时超声一样的时间，各组不同板子时间再分别设置5min/d、10min/d或20min/d，刺激从细胞接种96孔板静置培养24h后进行每天刺激一次，每次不同分组分别为5、10、20min，刺激后继续培养24h后进行检测。

(2)研究lipus对细胞软骨分化效应

取第4代hucmscs细胞以2x10⁴/ml的密度1ml接种至12孔板中，lipus刺激需待细胞在培养箱中培养融合达80％时更换成脐带间充质干细胞成软骨诱导分化完全培养基(dmem培养基含100nmol/l地塞米松、1％its、10ng/ltgf-β、50mg/ml抗坏血酸、40mg/ml脯氨酸、100mg/ml丙酮酸钠、10％胎牛血清)后进行，随机分为4组：对照组(c组)、lipus刺激l30复合诱导组(输出超声强度30mw/cm²)、l50复合诱导组(输出超声强度50mw/cm²)、l80复合诱导组(输出超声强度80mw/cm²)，同样一块板子同时超声一样的时间，各组不同板子时间再分别设置5min/d、10min/d或20min/d。

实施例2细胞形态学观察

图2-图5为显微镜(100×)观察细胞形态，其中图2为p2代hucmscs培养4h后贴壁细胞，由图2可知，细胞数量明显增多，外观类似成纤维样细胞，呈长梭形均匀分布；图3为培养4～5d时贴壁细胞，hucmscs生长迅速，2～3d即出现集落，逐渐融合成漩涡状；培养4～5d时细胞融合达80％以上，传代培养后细胞形态无明显改变；图4为在给予lipus应力刺激30mw/cm²、5min/d时，hucmscs培养10天时细胞形态图，由图4可知细胞形态无明显改变，细胞数量大大增殖；图5为l30复合诱导组细胞在培养7d时细胞形态图，由图5可知在lipus刺激和成软骨诱导的细胞在培养7d时出现扁平宽大的软骨样细胞形态改变。

(1)研究lipus对huc-mscs细胞增殖效应：

图6为以5min/dlipus刺激并培养5d时，显微镜观察各实验组细胞生长状态，其中a为对照组(c组)、b为lipus刺激l30组、c为l50组、d为l80组；由图6可知，各实验组细胞生长状态良好，和对照组相比，l30组和l50组的细胞均有一定增殖，其中l50组细胞较对照组更为活跃，细胞集落更密集，而另外以10、20min/dlipus刺激组随着脉冲强度增大和刺激时间延长，细胞集落较少。

所以，在lipus刺激条件为5min/d，30～50mw/cm²时有利于hucmscs增殖，其中刺激强度50mw/cm²时，细胞增殖最多，而其他随着刺激强度和每天刺激时间增加，细胞增殖率降低。

细胞接种24h后进行lipus分组刺激，连续刺激1～5天，作用于细胞24h、48h、72h、96h、120h后，cck-8法检测细胞增殖率，数据以均数±标准差表示。每次刺激后24h后更换培养基，另取空白孔只加入培养基作空白组，加入10ulcck-8溶液于细胞培养箱孵育4h后测450nm波长处od值，分别计算：细胞增殖率＝(实验组od-空白组od)/(对照组od-空白组od)x100％。做4组重复实验，对数据进行统计学分析。各组细胞增值率如表1-3所示，表1为5min/dlipus刺激下各组细胞增值率，表2为10min/dlipus刺激下各组细胞增值率，表3为20min/dlipus刺激下各组细胞增值率。

表15min/dlipus刺激下各组细胞增值率

表210min/dlipus刺激下各组细胞增值率

表320min/dlipus刺激下各组细胞增值率

不同刺激时间，lipus不同刺激强度作用下各实验组hucmscs细胞增殖率柱状图如图7所示，*p＜0.05。其中a为刺激时间为5min/d，各实验组细胞增殖率；b为刺激时间为10min/d，各实验组细胞增殖率；c为刺激时间为20min/d，各实验组细胞增殖率。结果表明，lipus连续刺激1～5d，在第5d当刺激时间为5min/d时l50组的细胞增殖率高于对照组和余实验组(p＜0.05)，刺激10min/d、20min/d时各实验组细胞随着刺激强度的增大而增殖受到抑制，以l80组抑制增殖效果最显著(p＜0.05)。

(2)研究lipus对huc-mscs细胞成软骨分化效应：

图8为lipus刺激并成软骨诱导培养2周时显微镜观察各实验组细胞生长状态，其中a、b、c分别对应5min/dlipus刺激，刺激强度30mw/cm²、50mw/cm²、80mw/cm²的细胞状态；d、e、f分别对应10min/dlipus刺激，刺激强度30mw/cm²、50mw/cm²、80mw/cm²的细胞状态；g、h、i分别对应20min/dlipus刺激，刺激强度30mw/cm²、50mw/cm²、80mw/cm²的细胞状态。由显微镜观察可知，5min/dlipus刺激的各实验组细胞生长状态良好，且l30组细胞较对照组更为扁平宽大，而10、20min/d组随着脉冲强度增大和刺激时间延长，细胞贴壁状态变差。

在细胞进行lipus分组刺激并成软骨诱导培养2周后收集各组细胞培养液，每组4个重复样本，按照预实验结果，样本稀释5倍后按试剂盒说明书进行elisa实验检测gag(软骨糖胺多糖)和col2a1(ⅱ型胶原α1)。终止反应后15min内测450nm处od值，根据标准品的浓度和od值绘制标准曲线，计算各组col2a1和gag的浓度，数据结果如表4所示，各组蛋白浓度柱形图如图9所示，其中a为各组col2a1浓度，b为各组gag浓度，l30-5表示l30组5min/dlipus刺激，以此类推。实验结果：elisa检测各组糖胺多糖、ⅱ型胶原表达，与对照组比较，各实验组在刺激5min/d时糖胺多糖、ⅱ型胶原均升高，以l30组最为显著(p＜0.05)；刺激10min/d、20min/d时，各实验组与对照组组间无显著性差异。各实验组组内两两比较，刺激5min/d时较10min/d、20min/d时糖胺多糖、ⅱ型胶原均升高，以l30组最为显著(p＜0.05)。

表4各组col2a1和gag的浓度

hucmscs细胞在刺激时间固定5min/d时，连续给予不同刺激强度(30mw/cm²、50mw/cm²、80mw/cm²)分组lipus刺激并成软骨诱导培养2周后，将各组细胞用磷酸盐缓冲液(pbs)漂洗3次(每次5min)，4％多聚甲醛室温下固定30min；pbs漂洗3次，加0.1mhcl溶液浸洗5min，ph值降至1.0；1％阿利新蓝(alcianblue)染色30min；pbs漂洗3次，在倒置显微镜(×200)下观察，运用image-proplus软件拍照，实验结果如图10所示，其中a、b、c、d分别对应对照组、l30复合诱导组、l50复合诱导组、l80复合诱导组。实验结果：成软骨诱导培养2周时，各组细胞阿利新蓝染色显示，细胞内均可见蓝色异染颗粒，其中l30复合诱导组蓝染颗粒较多。

hucmscs细胞在刺激时间固定5min/d时，连续给予不同刺激强度(30mw/cm²、50mw/cm²、80mw/cm²)分组lipus刺激并成软骨诱导培养4周后，将各组细胞用pbst漂洗3次(每次5min)，4％多聚甲醛室温下固定15min；pbs漂洗3次，0.5％tritonx-100透膜处理30min；pbs漂洗3次，0.5％牛血清白蛋白(bsa)室温湿盒封闭30min；加入col2a1一抗(1:100)4℃过夜；pbs漂洗3次，滴加二抗(1:500)37℃室温避光孵育1h；pbs漂洗3次，滴加1mldapi染色液37℃静置30min；pbs漂洗3次，在荧光倒置相差显微镜(×100)下观察，运用image-proplus软件拍照。图11为各组col2a1细胞免疫荧光检测，图12为col2a1细胞免疫+dapi染色结果，其中a、b、c、d分别对应对照组、l30复合诱导组、l50复合诱导组、l80复合诱导组。由图11和图12可知，lipus刺激复合诱导组和单纯诱导组中均有绿色荧光(ii型胶原蛋白)物质分布和蓝色荧光(细胞核)，显微镜下见l30组细胞荧光强度较l50、l80和诱导对照组更强。

所以在有生物活性因子存在时给予lipus刺激可以促进hucmscs成软骨分化，并且在不影响细胞增殖的前提下5min/d、30mw/cm²是最佳刺激条件。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。