肉苁蓉寄主植物的鉴定方法与流程

本发明涉及一种肉苁蓉寄主植物的鉴定方法，特别是涉及一种利用分子生物学方法鉴定肉苁蓉寄主植物物种的方法。

背景技术：

肉苁蓉药材cistancheherba来源于列当科(orobanchaceae)肉苁蓉属(cistanchehoffing.etlink)多年生寄生草本植物，具有补肾阳、益精血、润燥通肠等功效。肉苁蓉属植物种子需要在寄主植物根系分泌物刺激下才能萌发(宋玉霞等，2008)，且由于肉苁蓉属植物本身不能进行光合作用，所需的各种营养物质与水分必须从寄主获取(盛晋华等，2006)。许多研究表明，寄主植物类型会影响寄生植物的化合物种类及含量(phoenix,2005；suetsuguk,etal.2008；张慧等，2016)。据《中国植物志》记载，寄主植物是肉苁蓉重要的分类依据之一，肉苁蓉(c.deserticola)寄生于梭梭属(haloxylonspp.)植物根部，管花肉苁蓉(c.tubulosa)寄生于柽柳属(tamarixspp.)植物根部，盐生肉苁蓉(c.salsa)具有广寄生性，寄主植物包括藜科(chenopodiaceae)和蒺藜科(zygophyllaceae)的多种植物(中国科学院中国植物志编辑委员会，1990)，还有学者认为盐生肉苁蓉的寄主植物包括向日葵、芦苇、芨芨草等多种植物(温都苏，2008)，因此关于盐生肉苁蓉寄主植物的类型一直存在许多争议。

判断肉苁蓉寄主植物的传统方法主要有：(1)在采集肉苁蓉时将肉苁蓉附近的伴生植物作为肉苁蓉寄主并应用经典植物分类学方法进行鉴定；(2)将肉苁蓉及寄主植物的根系整个挖出，通过寄生根连接情况确定寄主植物并应用传统分类学方法鉴定。传统方法对肉苁蓉寄主植物的判别不仅依赖经验、不够准确，而且将寄主植物的根系挖出会对环境和植被造成严重的破坏。鉴于此，亟需开发一种更为准确、简便的肉苁蓉寄主植物物种的鉴别方法。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种肉苁蓉寄主植物的鉴定方法，有效克服现有技术中判别肉苁蓉寄主植物物种的方法不准确、严重破坏环境和植被等技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种肉苁蓉寄主植物的鉴定方法，包括：

采集连接在肉苁蓉植株上的寄生组织；

将所述寄生组织的dna与至少两种引物进行核酸扩增反应；

检测扩增产物。

进一步地，所述寄生组织为寄生根。

更进一步地，所述寄生根为5-15cm。

优选地，所述引物为dna条形码序列。

在上述技术方案的基础上，所述检测扩增产物具体为将扩增产物测序并进行its序列比对以确定寄主植物。

进一步地，所述寄主植物为梭梭属植物、柽柳属植物、蒿属植物、滨藜属植物、驼绒藜属植物、盐爪爪属植物、合头草属植物、碱蓬属植物或戈壁藜属植物。

具体地，所述寄主植物为聚头绢蒿。

具体地，所述聚头绢蒿的its序列为seqidno:1。

为实现上述目的，本发明还提供了一种核酸序列，如seqidno:1所示。

为实现上述目的，本发明还提供了一种所述核酸序列在鉴定植物物种中的用途。

本发明提供了一种肉苁蓉寄主植物的鉴定方法，具有以下优点：

1、本发明仅需以连接在肉苁蓉植株上的寄生根为鉴别材料，简单便利，易于操作。

2、本发明无需将寄主植物根系整个挖出，不仅保护了寄主植物本身，还有利于生态环境和植被的保护。

3、本发明运用分子生物学的方法，可以准确溯源肉苁蓉的寄主植物，不仅为肉苁蓉的分类学及寄生生物学研究提供重要价值，而且为人工接种肉苁蓉提供科学指导。

4、本发明首次鉴定了聚头绢蒿的its序列，为植物物种鉴定提供了新的资源和依据。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明肉苁蓉样品和寄主植物的田间形态图(a-c为肉苁蓉样品的田间形态图；d为寄主植物的田间形态图)。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明肉苁蓉寄主植物的鉴定方法的技术方案。

第一实施例、肉苁蓉样品的采集

在新疆全区及宁夏盐池地区采集肉苁蓉样品(包括连接在肉苁蓉植株上的寄生根5-15cm)，并详细记录周围的伴生植物。共采集完整的带寄生根肉苁蓉属植物样品68份，取肉苁蓉植株上的鳞片、寄生根和伴生植物叶片(作为对照)置于硅胶中干燥保存。采集的肉苁蓉样品的具体信息如表1所示，其田间形态如图1所示。

表1、采集的肉苁蓉及其寄生根样品的具体信息

第二实施例、样品dna的提取

1、提取寄生根的dna

由于植物根系富含纤维，不易研磨成粉，且其中含有较多的多酚、多糖类物质，在研磨时极易氧化变褐，同时蛋白质类含量较高，所以根系dna提取方法在参考肉桂的dna提取方法(徐虹，2004)的基础上作了进一步的改进，具体步骤如下：

步骤11、称取第一实施例中干燥保存的寄生根，每份样品0.5g，用质量浓度为75％乙醇擦拭寄生根表面；

步骤12、将步骤11中称量好的每份寄生根样品置于研钵中捣碎，再用剪子将长纤维剪成小段，以利于研磨；

步骤13、将步骤12中剪碎的寄生根样品放置于2ml离心管中，加入钢珠、pvp40粉末和质量浓度为3％的vitc粉末，用dna提取研磨仪(retschmm400，germany)以30次/秒的速度研磨2min；

步骤14、向步骤13的离心管中加入β-巯基乙醇(使其质量终浓度为0.2％)后，再加入提前预热好的植物基因组dna提取试剂盒(tiangenbiotechco.，china)中的试剂gp1，充分混匀；

步骤15、将步骤14中的离心管置于65℃温水中水浴90min，在水浴过程中每隔10min混匀一次，按照植物基因组dna提取试剂盒的说明书操作，以获得每份样品的寄生根基因组dna。

上述寄生根基因组dna沉淀溶解于适量的te缓冲液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)中，保存在温度-20℃条件下。用质量分数为0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示符合分子生物学的研究要求，并将所述伴生植物叶片基因组dna稀释10倍后作为pcr扩增模板。

2、提取伴生植物叶片dna

伴生植物的叶片dna提取方法的具体步骤如下：

步骤21、称取第一实施例中干燥保存的伴生植物叶片，每份样品30mg；

步骤22、将步骤21中称量好的每份叶片样品放置于2ml离心管中，加入钢珠，用dna提取研磨仪(retschmm400，germany)以30次/秒的速度研磨2min；

步骤23、向步骤22的离心管中加入β-巯基乙醇(使其质量终浓度为0.2％)后，再加入提前预热好的植物基因组dna提取试剂盒(tiangenbiotechco.,china)中的试剂gp1，充分混匀；

步骤24、按照植物基因组dna提取试剂盒的说明书操作，以获得每份样品的伴生植物叶片基因组dna。

上述伴生植物叶片基因组dna沉淀溶解于适量的te缓冲液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)中，保存在温度-20℃条件下。用质量分数为0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示符合分子生物学的研究要求，并将所述伴生植物叶片基因组dna稀释10倍后作为pcr扩增模板。

第三实施例、核酸扩增反应

利用dna条形码作为引物进行pcr扩增：

引物1：5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3'，如序列表中seqidno:2所示；

引物2：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，如序列表中seqidno:3所示。

pcr反应体系如下：

上述反应缓冲液为：200mmtris-hcl(ph8.4)，200mmkcl，15mmmgcl2。

pcr反应条件为：94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃延伸7min。

通过上述方法获得的寄生根pcr扩增产物和伴生植物叶片pcr扩增产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，以获得各样品的its序列。

第四实施例、寄主植物的鉴定

将第三实施例获得的各样品的its序列在ncbi中进行序列比对分析。经比对，所采集的寄主植物涉及3科9属的多种植物，具体信息如表2所示。

表2、寄主植物的its序列比对结果

注：比例计算以分布区域为基础

如表2所示，在新疆塔城地区(s1、s2、s3)的寄主植物包括菊科蒿属(artemisia)植物、藜科滨藜属疣苞滨藜(a.verrucifera)(kadereitetal.,2010)、驼绒藜属驼绒藜(c.latens)、盐爪爪属里海盐爪爪(k.cuspidatum)(xiaohuiliangandyuxiawu,2017)；在新疆阿勒泰地区(s4、s5、s6)的寄主植物包括菊科蒿属植物、驼绒藜属驼绒藜和心叶驼绒藜(c.ewersmanniana)(heklauand2008)；在新疆吉木萨尔博林种植基地(s9)，寄主植物为苋科碱蓬属囊果碱蓬(s.physophora)；在新疆哈密的伊吾县(s7)的寄主植物为藜科戈壁藜属戈壁藜(i.regelii)；新疆巴里坤县(s8)的寄主植物为藜科盐爪爪属里海盐爪爪；在宁夏盐池区域的寄主植物为苋科合头草属合头草(s.regelii)(schüssleretal.,2017)和藜科盐爪爪属细枝盐爪爪(k.gracile)(xiaohuiliangandyuxiawu,2017)；在新疆布尔津(d1)和额敏(d2)采集的肉苁蓉寄主植物均为梭梭(h.ammodendron)；在新疆和田(t1)采集的管花肉苁蓉寄主植物为柽柳(tamarixsp.)。

s1与s6中部分样品的寄生根的its序列与ncbi中多种蒿属植物序列相似度接近，但鉴于蒿属在我国有186种，44变种，新疆共分布47种(中国科学院中国植物志编辑委员会，1990；郗金标，2006；编辑委员会新疆植物志，2011)，因而蒿属植物未能鉴定到准确种。

伴生植物的叶片its序列与ncbi中的序列比对结果显示，仅有少部分疑似寄主的伴生植物与寄生根的序列鉴定结果一致，而多数伴生植物经鉴别并非寄主植物。

第五实施例、聚头绢蒿的its序列的获得

第三实施例获得的各样品的its序列中，有一份样品的寄生根its序列未记录于ncbi数据库中，如序列表中seqidno:1所示。经形态特征比对，该寄生植物为聚头绢蒿，属于菊科(compositae)春黄菊族(tribeanthemideae)绢蒿属(seriphidium)，为多年生草本或半灌木。

将所述聚头绢蒿的its序列(seqidno:1)提交至ncbi数据库，为植物物种鉴定提供了新的资源和依据。

综上所述，本发明仅需以连接在肉苁蓉植株上的寄生根为鉴别材料，无需将寄主植物整个挖出，简单便利，易于操作，不仅保护了寄主植物本身，还有利于生态环境和植被的保护；同时本发明运用分子生物学的方法，可以准确溯源肉苁蓉的寄主植物，不仅为肉苁蓉的分类学及寄生生物学研究提供重要价值，而且为人工接种肉苁蓉提供科学指导。此外本发明首次发现盐生肉苁蓉寄生于菊科绢蒿属植物根部，并鉴定了聚头绢蒿的its序列，为植物物种鉴定提供了新的资源和依据。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110>中国医学科学院药用植物研究所

新疆维吾尔自治区中药民族药研究所

<120>肉苁蓉寄主植物的鉴定方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>635

<212>dna

<213>聚头绢蒿(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

cagaacgacccgtgaacacgtaaaaacaaccgagcgtcggttggatcaagcgcttgtttg60

atgcaatcgatgctctgtcgatgcgcattcactcgagttcgtctggacccttgtgagtgt120

gtcgttggcgcattaacaacccccggcacaatgtgtgccaaggaaaactaaactctagaa180

ggctcgtcttcatgctgccccgttcgcggtgtgctcatgggatgtggcttctttataatc240

acaaacgactctcggcaacggatatctcggctcacgcatcgatgaagaacgtagcaaaat300

gcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtttttgaacgcaagttgc360

gcccgaagccttttggccgagggcacgtctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgcccccc420

acaactctccgtaaggggaactcgtgttttgggggcggatattggtctcccgtgctcatg480

gcgtggttggccgaaataggagtcccttcgatggacgcacgaactagtggtggtcgtaaa540

aaccctcgtcttttgtttcgtgctgttagtcgcaagggaaactctaagaaaaccccaacg600

tgtcgtcttttgacggcgctcgaccgcgaccccag635

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列-引物1(artificialsequence)

<400>2

ggaagtaaaagtcgtaacaagg22

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列-引物2(artificialsequence)

<400>3

tcctccgcttattgatatgc20