一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体为改变启动子和信号肽的方法提高纳豆激酶在地衣芽孢杆菌中表达的方法，以及在50升发酵罐中小试生产的方法。
背景技术：
：纳豆是起源于秦汉时期，是中国和日本的传统发酵豆制品。日本学者须见洋行对纳豆提取物进行研究时发现其具有溶解血栓的作用，并将之命名为纳豆激酶(nattokinase)。纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶，由一条275个氨基酸残基的多肽链折叠而成，无二硫键，分子量27-28kda.纳豆激酶在纳豆杆菌中以酶原的形式分泌到胞外，随后信号肽和前肽被切除，形成具有活性的纳豆激酶。纳豆激酶具有显著的溶血栓作用，与尿激酶、链激酶、蚓激酶相比，纳豆激酶更加温和，不会引起出血，半衰期长达8小时。并且该酶可以通过肠壁计入血液，口服就可以发挥溶血栓作用。目前，纳豆激酶的生产是以纳豆杆菌发酵产生纳豆激酶，经过后期的提取纯化得到产品，但是直接发酵的酶活较低，市售的发酵纳豆的活力仅在10fu/g左右，日本营养健康食品协会规定纳豆激酶的每日正常维持量应该不低于2000fu，仅靠使用发酵纳豆不能满足溶血栓的需要，并且发酵纳豆具有特殊的气味，消费者的接受程度不高。从发酵纳豆中提取的纳豆激酶也具有浓烈的特殊气味，感官性质受到较大的影响。目前，纳豆激酶的纯化方法主要有：盐析、超滤、层析过滤以及凝胶过滤。日本生物科学实验室公司有限公司(us730504)以玉米粉和大豆粉为原料，液体深层发酵后，经过壳聚糖絮凝除掉菌体，直径采用超滤膜浓缩，然后添加纤维素冻干得到产品。但是这种方法生产的纳豆激酶气味浓烈。王刚等人通过硫酸铵沉淀和sephadexg-50凝胶层析过滤的方法得到纯度较高的纳豆激酶，回收率在42.1％。日本、韩国、美国等已有10余家公司生产纳豆激酶的胶囊和片剂。但是在国家食品药品监督进口保健食品数据库中还没有纳豆激酶相关产品的批准文号。这正是我们发展我们自有知识产权纳豆激酶保健品的最佳时机。在我们的前期研究中，我们从传统的发酵纳豆中分离出一株纳豆激酶的高产菌株，利用深层发酵技术中可以很大的提高纳豆激酶的产量，但是发酵液非常粘稠，无法絮凝和进行后续的纯化处理。技术实现要素：本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法。通过纳豆激酶表达载体构建，得到能够在地衣芽孢杆菌中高效分泌表达的重组菌株，有效的提高纳豆激酶的活力降低发酵液的黏度，有利于后期的纳豆激酶的分离纯化。本发明通过以下技术方案实现：一种纳豆激酶，该纳豆激酶基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。一种纳豆激酶表达载体，包括纳豆激酶基因序列的自主复制型表达质粒，其中纳豆激酶基因序列如seqidno.1所示。以上所述的纳豆激酶表达载体，所述自主复制型表达质粒包括任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒。以上所述的纳豆激酶表达载体，所述自主复制型表达质粒包括pwb980、php13、pht01、pht43、pht304、pmk3、pmk4、phcmc04、phcmc05、pma5或pbe中的任意一种。以上所述的纳豆激酶表达载体，所述自主复制型表达质粒的启动子可由以下启动子中的任意一种所替代：pamyq、papre、pveg、plepa、pnpre、psoda、pxyla、pahpf、pwpra。一种以上所述的纳豆激酶表达载体的构建方法，通过引物扩增seqidno.1序列，回收扩增产物，连接到t载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切t载体和自主复制型表达质粒，通过dna连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到。以上所述的纳豆激酶表达载体的构建方法，扩增seqidno.1序列的引物为nk-f：gctgccggaaaaagcagtacagaaaag和nk-r:ttattgtgcagctgcttgtacgttga。一种整合型纳豆激酶表达载体，其包括整合了以上所述的seqidno.1序列的整合型质粒。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒包括任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到染色体上的质粒。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒为pdg364，pmlk83，pdg1661，pdg1662，pdg1728，pdg1730，pdg1664，pax01，psg1170，psg1729，pmad，pcbs，pcbs595，pcbs221，pcbs345或pcbs412中的任意一种。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒的启动子可由包括以下任意一种的启动子替代：pamyq、papre、pveg、plepa、pnpre、psoda、pxyla、pahpf或pwpra。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒的信号肽由包括以下任意一种的信号肽替代：spnpre、spamyl、spapre、spbpr、spwpra或spvpr。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒的启动子可为pamyq、papre、pveg、plepa、pnpre、psoda、pxyla、pahpf或pwpra中任意两个启动子的组合，可以为pamyq+papre、pamyq+pveg、pamyq+plepa、pamyq+pnpre、pamyq+psoda、pamyq+pxyla、pamyq+pahpf、pamyq+pwpra、papre+pvegpapre+plepa、papre+pnpre、papre+psoda、papre+pxyla、papre+pahpf、papre+pwpra、pveg+plepa、pveg+pnpre、pveg+psoda、pveg+pxyla、pveg+pahpf、pveg+pwpra、plepa+pnpre、plepa+psoda、plepa+pxyla、plepa+pahpf、plepa+pwpra、pnpre+psoda、pnpre+pxyla、pnpre+pahpf、pnpre+pwpra、psoda+pxyla、psoda+pahpf、psoda+pwpra、pxyla+pahpf、pxyla+pwpra、pahpf+pwpra中的任意一种。一种用于生产以上所述的纳豆激酶的培养基，包括种子培养基和发酵基料培养基；其中，种子培养基组分包括：麦芽糖、葡萄糖、大豆粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙；具体配方可以为麦芽糖40g/l、葡萄糖10g/l、大豆粉40g/l、磷酸氢二钾1g/l、磷酸二氢钠4g/l、硫酸镁0.5g/l、氯化钙0.2g/l，ph7.6；发酵基料培养基组分包括：葡萄糖，大豆粉，磷酸氢二钾，磷酸二氢钠，硫酸镁，氯化钙；具体配方可以为葡萄糖10g/l，大豆粉40g/l，磷酸氢二钾1g/l，磷酸二氢钠4g/l，硫酸镁0.5g/l，氯化钙0.2g/l，调节ph至7.6。以上所述的纳豆激酶的培养基，还包括发酵补料培养基，其中发酵补料培养基组分包括：麦芽糖浆、葡萄糖、大豆粉；具体配方可以为麦芽糖浆500g/l、葡萄糖10g/l、大豆粉200g/l。一种生产以上所述的纳豆激酶的方法，采用以上所述的培养基进行种子培养和发酵培养，发酵过程中使用磷酸和氨水控制ph在7.6-7.8之间，通气量每升发酵液0.5l/min，转速500-700rpm，温度37度；通过权利要求15所述的发酵补料培养基补料控制生长对数期总还原糖控制在2％左右，稳定期总还原糖控制在1％左右；在发酵的10小时后，均匀流加大豆粉溶液，直至结束；发酵时间为48-72小时，在发酵24小时后，每2小时测一次酶活，酶活出现下降趋势时结束发酵，然后将纳豆激酶纯化。以上所述的方法，纳豆激酶纯化的过程为在发酵液适当稀释后，添加5％的珍珠岩和0.1％的絮凝剂，通过板框压滤使上清液的通光率大于99％，通过微滤去除固体颗粒，再通过超滤浓缩发酵液；然后加入硫酸铵至80％饱和度，过夜沉淀，离心后收集沉淀，用磷酸盐缓冲液重悬后，过阴离子交换柱交换，最终样品脱盐后加入壳聚糖，冻干保存。本发明涉及到的纳豆激酶在地衣芽孢杆菌中的表达，通过改变启动子和信号肽等方式极大地提高了纳豆激酶的产量，并且实现了50l的小试规模生产，打通了纳豆激酶从菌种改造到发酵生产的全部流程，实现了纳豆激酶的工业化生产。附图说明图1纳豆激酶扩增；图2纳豆激酶活力与酪蛋白平板水解圈大小的标准曲线；图3培养基成分对纳豆激酶产量的影响；图4重组地衣芽孢杆菌在50l发酵罐中的纳豆激酶活力；图5、发酵液蛋白电泳(sds-page)图。具体实施方式：实施例1：纳豆激酶基因获得前期研究中我们从发酵纳豆中得到一株高产纳豆激酶的菌株，以纳豆激酶的保守序列为参考，设计引物nk-f：gctgccggaaaaagcagtacagaaaag(seqidno.2)和nk-r:ttattgtgcagctgcttgtacgttga(seqidno.3)，扩增纳豆激酶基因，pcr条件如下预变性95℃5min。变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min；30个循环。最终延伸72℃10min。1％琼脂糖电泳回收目的条带(图1)，送金斯瑞测序。测序结果如seqidno.1所示。实施例2：纳豆激酶活力快速检测纳豆激酶的酶活检测有纤维蛋白平板法、纤维蛋白原溶解时间法、酶联免疫法等。市售纳豆激酶产品的单位均为fu，这也是日本官方健康营养食品协会制定的纳豆激酶产品的标准单位。该方法采用的是纤维蛋白原块溶解后测定水解后的水溶性氨基酸含量来表示纳豆激酶的活力。该方法耗时长，测量误差较大，检测的范围小。本实施例中描述了一种快速、大量检测纳豆激酶活力的方法，适用于对大量的纳豆激酶样品进行快速检测。因为纳豆激酶是一种蛋白酶，具有水解脱脂乳中酪蛋白的能力，以酪蛋白的水解表示纳豆激酶的活力是可行的。该方法具体为：通过2％脱脂乳平板上的水解圈来表示纳豆激酶活力的大小。利用已知活力的纳豆激酶样品制作标准曲线(图2)，待测样品稀释后添加到脱脂乳平板的孔中，37℃处理12小时，测量抑菌圈大小即可得到纳豆激酶的活力。实施例3：自主复制型表达质粒构建自主复制型质粒可以是任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒，可以是pwb980，php13，php13-43，pht01，pht43，pht304，pmk3，pmk4，phcmc04，phcmc05，pma5，pbe等中的任意一种。本实施例中以pht43质粒为例描述自主复制型质粒的构建过程，其他的质粒构建原理和过程与此相同。通过引物nk-f2：ggatccgctgccggaaaaagcagtacaga(seqidno.4)和引物nk-r2：tctagattattgtgcagctgcttgtacgt(seqidno.5)(小写字母为酶切位点bamhⅰ和xbaⅰ)扩增纳豆激酶基因(seqidno.1)，pcr条件如下：预变性95℃5min。变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min；30个循环。最终延伸72℃10min。产物通过pcr产物回收试剂盒(omega)回收后，连接到t载体peasy-blunt(全式金生物)。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。利用限制性内切酶bamhⅰ和xbaⅰ(thermofisherscientific)酶切t载体和表达载体pht43，通过t4dnaligase(takara)连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，得到重组质粒pht43-pul。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落pcr验证连接情况。从阳性克隆子中提取质粒，电转化枯草芽孢杆菌b.subtilis168和bs001。从氯霉毒的抗性平板上挑取单菌落pcr验证转化情况。按照同样的方法可以构建密码子未优化的纳豆激酶基因表达载体，阳性克隆子发酵测纳豆激酶活性，见表1。表1.重组地衣芽孢杆菌发酵酶活转化子酶活(fu/ml)转化子酶活(fu/ml)115.5618.7212.3711.2311.4812.5410.5915.4514.91014.9实施例4：整合型表达质粒构建整合型质粒可以是任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到染色体上的任何质粒，可以是pdg364，pmlk83，pdg1661，pdg1662，pdg1728，pdg1730，pdg1664，pax01，psg1170，psg1729，pmad，pcbs，pcbs595，pcbs221，pcbs345，pcbs412等中的任意一种。整合位点可以是枯草芽孢杆菌中的amye基因座、xyla基因座、gntp基因座以及其他任何的枯草芽孢杆菌生长非必须基因的位置。该实施例中以pcbs质粒，整合位点为amyl基因座为例描述整合型质粒的构建过程，其他的质粒构建原理和过程与此相同。通过引物hamyl-up-f:agatctatgtctggcaaaccatcatttcgatg(seqidno.6)和引物hamyl-up-r:ccatggcacatgcccttcatgcttctgtaaagc(seqidno.7)(小写字母为酶切位点bglⅱ和ncoⅰ)扩增地衣芽孢杆菌淀粉酶基因(amyl)上游同源臂，pcr条件如下：预变性95℃5min。变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min；30个循环。最终延伸72℃10min。按照同样的方法，通过hamyl-down-f:gtagacaagagcagagaggacggatttcc(seqidno.8)和引物hamye-down-r:ggatccccgagcgcgattcggtccgaagcgca(seqidno.9)(小写字母为酶切位点salⅰ和bamhⅰ)扩增地衣芽孢杆菌淀粉酶基因(amyl)下游同源臂。上下游同源臂连接t载体，提取质粒如实施例3所述。利用限制性内切酶bglⅱ和ncoⅰ酶切t载体和表达载体pcbs，t4dna连接酶孵育后转化大肠杆菌dh5α，方法同实施例3所述。采用同样的方法将下游同源臂连接到质粒pcbs上，得到具有同源臂的重组载体pcbs2。通过引物nk-f3：gaattcgctgccggaaaaagcagtacaga(seqidno.10)和引物nk-r3：gtcgacttattgtgcagctgcttgtacgt(seqidno.11)(小写字母为酶切位点ecorⅰ和salⅰ)扩增纳豆激酶基因(seqidno.1)，pcr条件及质粒筛选如实施例3所述。得到不具有启动子和信号肽的重组质粒pcbs2-nk。实施例5：整合型质粒启动子和信号肽的选择在该实施例中，我们实验了不同的启动子和信号肽对纳豆激酶发酵酶活的影响。以实施例4构建的质粒pcbs2-nk为基础，利用限制性内切酶ncoⅰ、kpnⅰ和ecorⅰ酶切处加入不同的启动子和信号肽，形成具有不同启动子和信号肽的效果的载体。本实施例中以其中一种启动子和信号肽(apre启动子和apre信号肽)为例描述载体pcbs2-papre-spapre-nk的构建，其余启动子和信号肽的载体构建原理和方法与此相同。通过引物papre-f：ccatggctagtgttcttttctgtatgaa(seqidno.12)，papre-r：ggtaccgttcagagtagacttactta(seqidno.13)(小写字母为酶切位点ncoⅰ和kpnⅰ)扩增apre启动子；通过引物spapre-f:ggtaccttaagcaaaaggagagggacgc(seqidno.14)，spapre-r:gaattcagcctgcgcagacatgttgc(seqidno.15)(小写字母为酶切位点kpnⅰ和ecorⅰ)扩增apre信号肽，二者通过酶切连接到载体pcbs2-nk上，方法如实施例3所述，得到表达载体pcbs2-papre-spapre-nk。从阳性克隆子中提取质粒，电转化地衣芽孢杆菌bl001。从红霉毒的抗性平板上挑取单菌落pcr验证转化情况。阳性克隆子发酵测纳豆激酶活性，发酵酶活见表2。其他的组合包括：pamyq、pveg、plepa、pnpre、psoda、pxyla、pahpf、pwpra以及信号肽spnpre、spamyl、spapre、spbpr、spwpra、spvpr之间的任意组合，均可以按照上述描述的方法构建。表2.整合型质粒中不同信号肽和启动子对发酵酶活的影响实施例6：双启动子组合提高纳豆激酶产量为提高启动子的转录效率，我们通过酶切连接的方法将两个启动子组合在一起，以提高启动子的强度。本实施例以复合启动子pamyq+papre为例描述复合启动子的构建过程。在实施例5构建的载体pcbs2-papre-spapre-nk基础上，将启动子amyq添加到启动子apre前面。通过引物pamyq-f:ccatggtcgattgtttgagaaaagaag(seqidno.16)和pamyq-r：ccatggttatattttcaaattttcaag(seqidno.17)(小写字母为酶切位点ncoⅰ)扩增amyq启动子，产物回收及连接t载体如实施例3所述。采用ncoⅰ酶切后与pcbs2-papre-spapre-nk连接得到双启动子载体pcbs2-pamyq-apre–nk。其他的双启动子包括：pamyq、pveg、plepa、pnpre、psoda、pxyla、pahpf、pwpra以及信号肽spnpre、spamyl、spapre、spbpr、spwpra、spvpr中所有启动子的两两复合，构建原理和方法同上。该实施例中不做详细描述，发酵酶活见表3。表3.整合型质粒中双启动子组合对发酵酶活的影响实施例7：发酵培养基优化根据重组地衣芽孢杆菌的生长条件，我们设计了初始培养基，包括：葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l、磷酸氢二钠8g/l、硫酸镁0.2g/l和消泡剂1ml/l。随后，我们采用不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、土豆淀粉和玉米淀粉)、氮源(大豆粉、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、酪蛋白、胰蛋白胨、玉米浆、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、乙酸铵、碳酸铵、柠檬酸铵和磷酸氢二铵)、磷酸盐(磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾)和无机盐(氯化钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸亚铁、氯化钴和氯化铝)探索培养基成分对纳豆激酶产量的影响(见图3)。实施例8：发酵及产物纯化本实施例中描述了纳豆激酶中试和生产的发酵方法及产物的纯化方法。在50l的小试发酵罐中的发酵参数：菌种：实施例6中酶活最高的菌株，含有pamyq+papre双启动子的整合到基因组。菌种从甘油管中取出，在lb平板上划线，37℃静置培养12小时，挑选单菌落接种到种子培养基。种子培养基：麦芽糖浆40g，葡萄糖10g，大豆粉40g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钠4g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.2g，调节ph至7.6。发酵基料培养基(g/l)：葡萄糖10g，大豆粉40g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钠4g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.2g，调节ph至7.6。发酵补料培养基(g/l)：，麦芽糖浆500g、葡萄糖10g、大豆粉200g。.(单独灭菌，分开补料)。发酵过程中使用磷酸和氨水控制ph在7.6-7.8之间。通气量每升发酵液0.5l/min，转速500rpm，温度37度。通过补料控制生长对数期总还原糖控制在2％左右，稳定期总还原糖控制在1％左右。在发酵的10小时后，均匀流加大豆粉溶液，直至结束。发酵时间48-72小时，发酵24小时后，每2小时测一次酶活，酶活出现下降趋势时结束发酵。发酵过程的酶活变化见图4，蛋白表达情况见图5。在发酵液适当稀释后，添加5％的珍珠岩和0.1％的絮凝剂(巴斯夫zetag8125)，通过板框压滤使上清液的通光率大于99％。通过微滤去除可能存在的固体颗粒，再通过超滤浓缩发酵液。加入硫酸铵至80％饱和度，过夜沉淀，离心后收集沉淀，用磷酸盐缓冲液(100mm，ph8.0)重悬后，过阴离子交换柱(cm-sepharosefastflowchromatography)。样品脱盐后加入壳聚糖，冻干保存。该方法回收率在69％，并且产品为白色粉末，无特殊气味，活力高达到15000fu/g。序列表<110>南京福斯弗瑞生物科技有限公司南京农业大学<120>一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法<160>17<170>siposequencelisting1.0<210>17<211>1146<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatg60gcgttcagcaacatgtctgcgcaggctgccggaaaaagcagtacagaaaagaaatacatt120gtcggatttaagcagacaatgagtgccatgagttccgccaagaaaaaggatgttatttct180gaaaaaggcggaaaggttcaaaagcaatttaagtatgttaacgcggccgcagcaacattg240gatgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagatccgagcgttgcatatgtggaagaagat300catattgcacatgaatatgcgcaatctgttccttatggcatttctcaaattaaagcgccg360gctcttcactctcaaggctacacaggctctaacgtaaaagtagctgttatcgacagcgga420attgactcttctcatcctgacttaaacgtcagaggcggagcaagcttcgttccttctgaa480acaaacccataccaggacggcagttctcacggtacgcatgtcaccggtacgattgccgct540cttaataactcaatcggtgttctgggcgtagcgccaagcgcatcattatatgcagtaaaa600gtgcttgattcaacaggaagcggccaatatagctggattattaacggcattgagtgggcc660atttccaacaatatggatgttatcaacatgagccttggcggacctactggttctacagcg720ctgaaaacagtagttgataaagcggtttccagcggtatcgtcgttgctgccgcagccgga780aacgaaggttcatccggaagcacaagcacagtcggctaccctgcaaaatatccttctact840attgcagtaggtgcggtaaacagcagcaaccaaagagcttcattctccagcgtaggttct900gagcttgatgtaatggctcctggcgtgtccatccaaagcacacttcctggaggcacttac960ggcgcttataacggaacgtccatggcgactcctcacgttgccggagcagcagcgctaatt1020ctttctaagcacccgacttggacaaacgcgcaagtccgtgatcgtttagaaagcactgca1080acatatcttggaaactctttctactatggaaaagggttaatcaacgtacaagcagctgca1140caataa1146<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gctgccggaaaaagcagtacagaaaag27<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ttattgtgcagctgcttgtacgttga26<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggatccgctgccggaaaaagcagtacaga29<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tctagattattgtgcagctgcttgta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