一种大黄鱼哈维氏弧菌病关联的SNP标记及其引物和应用的制作方法

本发明涉及鱼类分子鉴定
技术领域：
，尤其涉及一种大黄鱼哈维氏弧菌病关联的snp标记及其引物和应用。
背景技术：
：大黄鱼(larimichthyscrocea)是我国近海的重要经济鱼类之一。随着大黄鱼人工养殖规模的迅速扩大以及集约化程度的不断提高，由细菌、寄生虫、病毒等引起的大黄鱼养殖疾病不断出现且日趋严重。其中，弧菌病发病时间长、发病和死亡率高，成为大黄鱼养殖产业化的重要制约因素，由哈维氏弧菌(vibrioharveyi)引起的哈维氏弧菌病是养殖大黄鱼最常见的传染性弧菌疾病之一。为控制哈维氏弧菌病害，养殖者往往大量使用抗生素等药物。不仅导致水产品药物残留等食品安全问题，还造成了病原微生物耐药性增加、水体污染、养殖环境恶化等一系列问题。因此，筛选与抗病性状相关联的分子标记，利用标记辅助育种，培育大黄鱼抗病优良品种成为控制病害发生的有效途径之一。分子标记辅助育种(markerassistedselection，mas)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记，鉴定不同个体的基因型，从而进行辅助选择育种的一项新型分子育种技术手段。分子标记辅助育种能有效结合基因型与表型鉴定，避免选种的盲目性和不可预测性，从而显著提高选择的准确性和育种效率，从而加快育种进程缩短育种周期。snp标记是继微卫星之后最为高效的标记，由于其是双等位型标记，具有在全基因组多态性高、含量丰富、遗传稳定、分析简单等优点，广泛用于多种动物及少数鱼类选择育种中。然而，大黄鱼抗病相关snp未见报道，能有效用于大黄鱼抗病相关性状选育的snp标记有待挖掘。技术实现要素：本发明是为了克服现有技术中没有能够用于大黄鱼抗病相关性状选育的snp标记的问题，提供了一种能够有效的用于大黄鱼抗病性状的选育，快速检测大黄鱼对哈维氏弧菌病的抗病能力的一种大黄鱼哈维氏弧菌病关联的snp标记及其引物和应用。为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：一种大黄鱼哈维氏弧菌病关联的snp标记，所述snp标记核苷酸序列如seqidno.1所示，序列自5’端起第343位碱基位g或t。一种用于检测权利要求1所述的snp标记的引物对，所述的snp标记的引物对核苷酸序列如seqidno.2-3所示。一种用于检测权利要求1所述的snp标记的试剂盒，包含上述的引物对。一种检测大黄鱼对哈维氏弧菌病易感性的方法，通过对待测大黄鱼进行上述snp标记的检测，确定所述待测大黄鱼对哈维氏弧菌病是否易感。作为优选，所述的检测方法包括以下步骤：(1)提取待测大黄鱼的基因组dna；(2)利用权利要求2所述的引物对，将步骤(1)获取的dna进行pcr扩增，以获得pcr扩增产物；(3)对步骤(2)获得的pcr扩增产物进行测序，获得测序结果后根据结果确定待测大黄鱼的snp标记的基因型；(4)根据步骤(3)确定的snp标记的基因型确定待测大黄鱼对哈维氏弧菌病是否易感。作为优选，所述snp标记的个体基因型为gt的大黄鱼对哈维氏弧菌病更易感。即所述snp位点的基因型为gt的大黄鱼感染哈维氏弧菌病的概率显著高于其他基因型个体。本发明提供的检测大黄鱼哈维氏弧菌病关联snp的检测方法中，基因组提取不受特别限制，可以采用传统酚氯仿提取，也可采用试剂盒提取，本发明中的具体实施例是采用试剂盒提取，试剂盒操作简便、快速、提取的dna质量高。另外，待测大黄鱼个体基因型检测方法不受特别限制，飞行时间质谱、taqman探针、单链构象多态性聚合酶链式反应、直接测序等技术均可用于snp的检测。其中，直接测序是最为准确的方法，也是snp检测的金标准。通常情况下，纯合型snp位点的测序峰为单一峰型，而杂合型snp位点的测序峰为套峰，因而很容易将其区分开来。通过直接测序方法进行snp检测的检出率接近100％。因此，本发明采用直接测序方法检测snp标记。本发明的有益效果在于：本发明经研究发现，在本发明所述snp位点处，基因型为gt的大黄鱼感染哈维氏弧菌病的概率显著高于纯合gg型个体。因此，通过检测大黄鱼上述snp，能够有效地确定其是否易患哈维氏弧菌病。具体讲，该位点基因型为杂合gt时大黄鱼容易患哈维氏弧菌病，则说明该位点g突变为t后，大黄鱼易患哈维氏弧菌病。因此，本发明的snp标记与大黄鱼哈维氏弧菌病紧密相关，在亲本选育中淘汰gt基因型个体利于提高后代抗哈维氏弧菌感染的能力，利于本发明标记进行辅助育种，进而加快大黄鱼抗病优良品种培养进程。利于上述snp位点的引物对可以有效的检测待测大黄鱼的基因型，其结果一方面可以判断待测大黄鱼是否易感染哈维氏弧菌病，另一方面可以为亲本选择提供参考，例如，在该位点处基因型都为gg的个体为亲本，淘汰基因型为gt的个体，则后代个体在该位点处基因型都为纯合cg，后代个体不会出现易患哈维氏弧菌病的gt基因型个体。因此，利用本发明的snp位点引物可检测大黄鱼基因型，判断该个体是否易患哈维氏弧菌病，能够有效用于大黄鱼分子标记辅助选择育种，加快大黄鱼抗病优良品种培育进程。本发明还提供了一种用于检测所述的snp标记的试剂盒，该试剂盒可以有效检测大黄鱼抗哈维氏弧菌感染，用于大黄鱼分子标记辅助育种。因此，本发明具有以下有益效果：(1)能够有效地确定其是否易感染哈维氏弧菌病；(2)有利于提高后代抗哈维氏弧菌病感染的能力；(3)加快大黄鱼抗病品种培养进程。附图说明图1为10个snpspcr扩增电泳图。图2为snp位点测序峰图。具体实施方式下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为个例，而不能以此来限制本发明的保护范围。1.1大黄鱼群体样本来源待测大黄鱼取自舟山市水产研究所同一批次人工繁育的3月龄的大黄鱼，随机挑选健康大黄鱼200尾，体重在50g/尾左右，采用腹腔注射法向大黄鱼注射1.0×107cfu/ml浓度的哈维氏弧菌菌液0.2ml，10天内死亡个体并具有典型哈维氏弧菌感染症状的个体为易感个体，无感染症状的个体为抗病个体。获得易感组和抗病组各80个个体，剪取其肌肉，保存于无水乙醇中，用于基因组dna提取。1.2待测大黄鱼基因组dna提取基因组dna提取采用苯酚-氯仿抽提方法提取，具体方法如下：取肌肉组织约30mg，加入200ul消化液(1l消化液含5ml2mol/lnacl，5ml2mol/ltris-cl，100ml5％sds和100ml1mol/ledta，ph8.0)，20ul10mg/ml的蛋白酶k，56℃水浴锅消化1～3小时；加入500ul(ph8.0)平衡酚，充分颠倒混匀，12000g离心10min，小心吸取上清；加500ul的苯酚-氯仿-异戊醇混合物(苯酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1)，充分颠倒混匀10min，12000g离心10min，小心吸取上清；加500ul的氯仿-异戊醇混合物(氯仿:异戊醇体积比为24:1)洗涤一次；加500ul无水乙醇，12000g离心5min，小心倒去乙醇保留沉淀；加入200ul75％乙醇，缓慢混匀，12000g离心5min，去乙醇；75％乙醇重复洗涤一次；风干15min，加入100ul去离子水溶解，利用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测dna的提取质量和浓度，-20℃保存备用。1.3测序及snp标记开发随机选择上述易感组和抗病组大黄鱼各10尾，对每尾鱼的免疫相关基因分别进行pcr扩增(电泳图见图1)和直接测序(测序峰图见图2)，对获得的10尾易感组和10尾抗病组大黄鱼序列进行比对分析和snps筛选，获得了1个与哈维氏弧菌病相关的snp位点，该snp位点位于seqidno.1核苷酸序列(全长546bp)自5’端起第343bp处，该位点碱基以k表示，k代表g或t。seqidno.1所示核苷酸序列来自发明人前期研究获得的大黄鱼功能基因序列。1.4pcr扩增及检测以大黄鱼基因组dna为模板，采用如seqidno.2-3所示引物进行pcr扩增。pcr反应条件为：95℃5分钟；95℃30秒，56℃30秒，72℃延伸20秒，32个循环；72℃延伸10分钟。反应体系以50μl计为：0.5μm引物2μl，taqpolymerase预混液(takara)25μl，10ng基因组dna1μl，灭菌双蒸水22μl。pcr产物利用abi3730dnasequencer测序仪进行直接测序，根据测序峰图分析snp的位点信息。1.5snp位点与哈维氏弧菌病的关联分析采用spss19.0的一般线性模型中的多元方差分析和独立样本t检验对snp位点的基因型和等位基因与抗病性关联进行分析，等位基因型及基因型在两组间的差异分析结果见表1和表2。表1等位基因在两组间的分布差异统计表等位基因易感组(％)抗病组(％)卡方值p值g80(0.25)136(0.85)18.05280.0035t66(0.75)24(0.15)表2基因型在两组间的分布差异统计表等位基因易感组(％)抗病组(％)卡方值p值gg14(0.175)56(0.7)16.72110.0027gt66(0.825)24(0.3)由表1和表2可知，在该位点处，等位基因和基因型频率在抗病和易感群体中都存在极显著差异(p<0.01)，在抗病群体中，等位基因g和t的频率分别为85％和15％，基因型gg和基因型gt的基因型频率分别为70％和30％。进而证明seqidno.1所示核苷酸序列(全长546bp)自5’端起第343位碱基g或t与大黄鱼哈维氏弧菌病显著相关，为大黄鱼疾病关联snp标记，本发明的snp标记可用于大黄鱼抗病性状选育。序列表<110>浙江海洋大学<120>一种大黄鱼哈维氏弧菌病关联的snp标记及其引物和应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>2<211>546<212>dna<213>大黄鱼哈维氏弧菌病关联的snp标记(snpmarkersassociatedwithharm'sdiseaseinlargeyellowcroaker)<400>2ttctttttgacttatttgaatctcatctttcaggacactttaatcatggatataaacatt60gttatgctggatggaaagacccacatcctgagggtgaacccacatgacacagtgggctct120ctgaaaacgctcatccagaacaaagtgggagttccccctcagaaacaaaagctgatcttt180gtgaacggacagaggacacctctcagcgacgactcccagtatatcagccactacggtctg240cagtccggctctcaggtgtctctgctgatcacacagcccaagaccttccaggtgttcctg300aacaacctgcagggtcagaagagcacctatgatatcaaacctkgacgagactgtgatgaa360cttcaagaggagggtggagcaaagagagggggtccctgtgaaccagcagaggctgctcca420ccaaagcagggagctgctggatgggaaactttcagactacgacgtcaaggaactgagcac480catcaacatgacaggccgcctgagaggaggttaaaatgtcagaaagataaaatagtatac540tttaca546<210>2<211>20<212>dna<213>引物-f(primer-f)<400>2gccactacggtctgcagtcc20<210>3<211>21<212>dna<213>引物-r(primer-r)<400>3ttgatggtgctcagttccttg21当前第1页12