一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及基因修饰后DC细胞的应用与流程

本发明属于基因修饰技术领域，具体涉及一种提高dc细胞hpv病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及基因修饰后dc细胞的应用。

背景技术：

树突状细胞(dc细胞)来源于骨髓cd34⁺造血干细胞，因突起的伪足像树枝，故命名为树突状细胞，根据来源不同分为淋巴系dc和髓系dc两大类，淋巴系dc的前体与nk细胞、t细胞相同，髓系dc前体细胞与单核细胞和粒细胞相同。根据成熟度不同dc功能有差异，未成熟的dc内含重要细胞器，包括内体或称mhcli类小室和溶酶体等，高表达补体、toll样受体，为dc摄取抗原提供结构基础；当未成熟dc摄取抗原后或受到某些因子刺激则分化为成熟dc，高表达共刺激因子(cd80、cd86、cd40、cd40l等)和粘附因子(il12p35、il12p40、il12p70、ifn-γ等)，获得递呈抗原(mhc-i和mhc-ii)及活化t细胞的能力。

2002年，duma等在总结前人研究的基础上，经过大量基础和临床试验验证提出“肿瘤免疫编辑”假设，认为肿瘤形成在免疫应答中分为3个阶段：清除、平衡、逃逸，其中dc在免疫应答中起到关键作用。在肿瘤的发生发展中，当宿主细胞发生癌变后，未成熟的dc经趋化作用从外周血进入肿瘤微环境，在肿瘤抗原刺激下形成成熟dc，上调抗原递呈能力，高表达共刺激因子，摄取肿瘤抗原与mhc结合成mhc-抗原肽复合物作为第一活化信号激活初始t细胞使之活化分化成为t辅助细胞(th)和细胞毒t淋巴细胞(ctl)，从而启动体液免疫应答消灭表达hla多肽的癌变细胞；同时高表达il-12、il-6、tnf-a和il-10，增强自然杀伤细胞的直接杀伤作用，作为第二活化信号增强机体对炎症或肿瘤的免疫应答。dc分泌的趋化因子可专一性趋化初始型t细胞，促进t细胞在肿瘤部位的聚集，增强t细胞激发相应的免疫应答。然而，由于肿瘤细胞遗传的不稳定性及异质性，可逃避dc识别和摄取，从而导致肿瘤细胞不断增殖甚至转移。

有研究证实：肿瘤细胞一般低表达或不表达mhci、mhcⅱ类分子和细胞黏附分子，同时释放vegf，tgf-β阻碍dc分化成熟，不利于加工形成mhc-抗原肽复合物，从而丧失抗原呈递功能，最终出现肿瘤增殖及转移。也有研究表明：与正常供体dc相比，从肿瘤分离得到的dc明显缺乏抗原提呈功能，进一步支持了该假说。且目前的dc疫苗均可以诱发特异性细胞毒性t细胞(ctl)反应和促使感染消退，但是存在操作步骤复杂，操作时间长，且dc细胞维持抗原提呈时间短等缺点。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高dc细胞hpv病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及基因修饰后dc细胞的应用，所述基因修饰的dc疫苗能够表达全蛋白序列，且包含所有的抗原位点；可以长期表达抗原和细胞因子或共刺激分子，增强了dc细胞抗原递呈的能力，促进t细胞的激活。同时还可以帮助dc细胞对抗肿瘤对其的抑制，延长自身寿命和促进t细胞、nk细胞的活化。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种提高dc细胞hpv病毒抗原提呈效率的基因修饰方法，包括以下步骤：1)将融合基因构建进pgem-t载体质粒中，得到重组质粒pgem-t-rhpv16-e6e7；所述融合基因的序列如seqidno.1所示；

2)将所述重组质粒pgem-t-rhpv16-e6e7经限制性内切酶spei进行线性化，以得到的线性化质粒作为模板，启动t7启动子驱动的体外转录过程，获得改良的hpv16mrna分子；

3)利用所述改良的hpv16mrna分子转染dc细胞，获得基因修饰的dc细胞。

优选的，步骤1)所述融合基因中依次包括：kozak序列、信号肽、hpv16亚型的e6、e7序列和分子转运信号。

优选的，步骤2)所述体外转录的体系为20μl体系，包括：

优选的，步骤3)所述转染前还包括浓缩所述改良的hpv16mrna分子，所述浓缩的方法包括：向体外转录的反应体系中加入30μl无核酸酶双蒸水和30μl氯化锂沉淀液，-20℃放置30～60min；4℃条件下，离心去除上清，收集rna沉淀；利用te缓冲液溶解所述rna沉淀，用紫外分光光度计对rna溶液进行定量并于-70℃保存。

优选的，所述氯化锂沉淀液包括以下含量的组分：7.5m的licl和50mm的edta，所述氯化锂沉淀液的ph值为8.0。

优选的，步骤3)所述转染的方法为电转染。

优选的，步骤3)所述dc细胞的培养方法，包括：利用感染hpv后的外周静脉血50ml，加25ml淋巴细胞分离液离心分层，取第二层单个核细胞层的细胞，利用无血清x-vivo-15培养基对所述细胞进行稀释，于37℃5％co2培养箱中孵育2.5小时，获取贴壁的单个核细胞层；用pbs洗去悬浮细胞，加入含有800iu/ml粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和500iu/ml白介素-4细胞因子的x-vivo-15培养基培养24小时，得到未成熟的树突状细胞；每3天半量换液一次，并补足粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4细胞因子；在x-vivo-15培养基加入重组人tnf-α、il-1b、il-6和pge2，诱导dc细胞成熟。

优选的，所述感染hpv为感染hpv16亚型且发展为cin2和cin3时期。

优选的，在所述x-vivo-15培养基中，所述tnf的终浓度为10ng/ml，所述il-1b的终浓度为10ng/ml，所述il-6的终浓度为1000u/ml，所述pge2的终浓度为1mg/ml。

本发明还提供了利用上述基因修饰方法获得的基因修饰的dc细胞在制备诱导特异性免疫应答药物中的应用。

本发明提供了一种提高dc细胞hpv病毒抗原提呈效率的基因修饰方法，以修饰后的mrna序列进行dc细胞修饰，使细胞可以持续表达抗原，并刺激dc细胞成熟，可提高dc细胞特异性提呈hpv16型病毒抗原的能力，进而增加自体杀死hpv16病毒的免疫细胞数量，并提高免疫细胞杀伤活性，增强免疫功能，达到彻底清除hpv16病毒，阻止宫颈病变发展的目的。利用本发明所述方法不会复制感染性病毒颗粒，但可诱发全身免疫及mhc-i、mhc-ii限制性ctl反应，并且不受体内已有载体抗体的干扰，具有安全性好，有效性强的特点。

附图说明

图1为融合基因结构示意图；

图2为融合蛋白的结构示意图及细胞因子表达水平；

图3为接种本发明所述dc疫苗后，外周血中cd4⁺/cd8⁺t细胞数量。

具体实施方式

本发明提供了一种提高dc细胞hpv病毒抗原提呈效率的基因修饰方法，包括以下步骤：1)将融合基因构建进pgem-t载体质粒中，得重组质粒pgem-t-rhpv16-e6e7；所述融合基因的序列如seqidno.1所示；

2)将所述重组质粒pgem-t-rhpv16-e6e7经限制性内切酶spei进行线性化，以得到的线性化质粒作为模板，启动t7启动子驱动的体外转录过程，得改良的hpv16mrna分子；

3)利用所述改良的hpv16mrna分子转染dc细胞，得基因修饰的dc细胞。

在本发明所述提高dc细胞hpv病毒抗原提呈效率的基因修饰方法中，将融合基因构建进pgem-t载体质粒中，得重组质粒pgem-t-rhpv16-e6e7；所述融合基因的序列如seqidno.1所示。本发明所述融合基因的结构示意图如图1所示：依次包含kozak序列、信号肽、hpv16亚型的e6和e7序列和分子转运信号，并且在信号肽序列的5’端添加了kozak序列(gccacc)，提高蛋白的翻译效率，信号肽序列可编码跨膜蛋白和分子转运信号。本发明对所述融合基因构建进pgem-t载体质粒的方法并没有特殊限定，优选经t4连接酶直接连接进载体，方法如下：

在0.2ml反应管中加入下列成分：

补超纯水至总体积为10μl，可以16℃或4℃过夜。

转化：

1.将50μl感受态细胞jm109或dh5α于冰浴上解冻；

2.将5μl连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30min；

3.42℃热休克90秒，立即冰浴3-5min。

得重组质粒pgem-t-rhpv16-e6e7后，本发明将所述重组质粒pgem-t-rhpv16-e6e7经限制性内切酶spei进行线性化，以得到的线性化质粒作为模板，启动t7启动子驱动的体外转录过程，得改良的hpv16mrna分子。本发明对所述线性化的方法并没有特殊限定，利用本发明的常规酶切方法即可。本发明所述体外转录的体系优选为20μl体系，具体包括：

本发明所述体外转录的方法优选在水浴中进行，所述水浴的温度优选为37℃，所述水浴的时间优选为2h。本发明在进行所述水浴前，优选还包括用移液器轻柔吹打溶液使其充分混匀，2000rpm离心30秒，收集液体于pcr反应管底部。

得改良的hpv16mrna分子后，本发明利用所述改良的hpv16mrna分子转染dc细胞，得基因修饰的dc细胞。本发明在所述转染前优选还包括浓缩所述改良的hpv16mrna分子，所述浓缩的方法优选包括：向体外转录的反应体系中加入30μl无核酸酶双蒸水和30μl氯化锂沉淀液，-20℃放置30～60min；4℃条件下，离心去除上清，收集rna沉淀；利用te缓冲液溶解所述rna沉淀，用紫外分光光度计对rna溶液进行定量并于-70℃保存。本发明所述氯化锂沉淀液优选包括以下含量的组分：7.5m的licl和50mm的edta，所述氯化锂沉淀液的ph值为8.0。本发明在所述收集rna沉淀后，优选还包括向收集得到的rna沉淀中加入1ml乙醇洗涤rna沉淀，并于4℃条件下，再次离心收集rna沉淀。本发明所述乙醇优选为乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的体积分数优选为60～80％，更优选为65～75％，最优选为70％。本发明对所述转染的方法并没有特殊限定，优选为电转染，具体包括：按照1g/10⁶细胞的用量进行转染。把mrna置于灭菌的电转杯内，用genepulserxcell电穿孔完全系统(货号1652660，bio-rad公司)以300v/150f进行电转染。本发明对所述dc细胞的来源并没有特殊限定，优选利用自制的dc细胞，其培养方法优选的包括：利用感染hpv后的外周静脉血50ml，加25ml淋巴细胞分离液离心分层，取第二层单个核细胞层的细胞，利用无血清x-vivo-15培养基对所述细胞进行稀释，于37℃5％co2培养箱中孵育2.5小时，获取贴壁的单个核细胞层；用pbs洗去悬浮细胞，加入含有800iu/ml粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和500iu/ml白介素-4细胞因子的x-vivo-15培养基培养24小时，得到未成熟的树突状细胞；每3天半量换液一次，并补足粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4细胞因子；在x-vivo-15培养基加入重组人tnf-α、il-1b、il-6和pge2，诱导dc细胞成熟。本发明所述感染hpv优选为感染hpv16亚型且发展为cin2和cin3时期。在所述x-vivo-15培养基中，所述tnf的终浓度优选为10ng/ml，所述il-1b的终浓度为10ng/ml，所述il-6的终浓度为1000u/ml，所述pge2的终浓度为1mg/ml。

本发明还提供了利用上述基因修饰方法获得的基因修饰的dc细胞在制备诱导特异性免疫应答药物中的应用。

在本发明所述应用中，优选将得到的所述基因修饰的dc细胞注射入富含淋巴结的腋下，每隔1周接种一次，共进行3次，即可显著增强人树突状细胞(dcs)中mhc-i类和ii类抗原表位的表达，通过mhc-i类途径进行抗原递呈，产生cd4⁺及cd8⁺杀伤性t细胞，修复患者特异性体液免疫和细胞免疫，进而对hpv16感染组织细胞进行杀伤，全面清除长期感染的hpv16病毒，不留后患，阻止宫颈癌的发生。

下面结合实施例对本发明提供的提高dc细胞hpv病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

利用人工合成的方法合成seqidno.1的融合基因序列，同时将该融合基因序列构建进pgem-t载体中，得pgem-t-rhpv16-e6e7质粒，使融合基因在宿主菌中实现原核表达。

启动t7启动子驱动的体外转录过程，获得改良的hpv16mrna分子并浓缩。

获取感染hpv16亚型且发展为cin2和cin3的外周静脉血50ml，加入淋巴细胞分离液离心分层，取第二层单个核细胞层的细胞，用无血清x-vivo-15培养基把细胞进行稀释，把细胞于37℃5％co2培养箱中孵育2.5小时，获取贴壁的单个核细胞层；用pbs洗去悬浮细胞，加入含有800iu/ml粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和500iu/mlril-4的x-vivo-15培养基培养24小时，得到未成熟的树突状细胞(immaturedc，idc)；每3天半量换液一次，并补足gm-csf和il-4细胞因子；在培养的第6天，在x-vivo-15培养基加入重组人tnf-(10ng/ml)、il-1b(10ng/ml)、il-6(1000u/ml)和pge2(1mg/ml)，诱导dc细胞成熟。

按照1g/10⁶细胞的用量进行电转染。把mrna置于灭菌的电转杯内，用genepulserxcell电穿孔完全系统以300v/150f进行电转染。

实施例2

把基因修饰的dc细胞注射入在cin2和cin3期患者富含淋巴结的腋下，每隔1周接种一次，共进行3次；在第四周，抽取2ml外周静脉血，用elisa法检测细胞因子的表达水平，具体结果如图2和表1所示：

表1.细胞因子的表达水平

可见，经过dc疫苗接种后，血液中细胞因子ifn、tnf和il2的表达水平显著增加，其中il2的水平增加最为明显。

通过流式细胞术检测cd4⁺和cd8⁺t细胞的数量，如图3所示，表明被接种者体内的免疫系统被活化，同时被接种者的cd4⁺和cd8⁺t细胞的数量也显著增加。

本发明提供了一种提高dc细胞hpv病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及其应用，获得的所述经基因修饰的dc细胞，能够显著增强人树突状细胞(dcs)中mhc-i类和ii类抗原表位的表达，通过mhc-i类途径进行抗原递呈，产生cd4⁺及cd8⁺杀伤性t细胞，修复患者特异性体液免疫和细胞免疫，进而对hpv16感染组织细胞进行杀伤，全面清除长期感染的hpv16病毒，不留后患，阻止宫颈癌的发生，可用于制备防治宫颈癌药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>河北省健海生物芯片技术有限责任公司

<120>一种提高dc细胞hpv病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及基因修饰后dc细胞的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1298

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gccaccatgctggttatggcgccgcgtaccgttctgctgctgctgtctgcggcgctggcg60

ctgaccgaaacctgggcgcaccaaaagagaactgcaatgtttcaggacccacaggagcga120

cccagaaagttaccacagttatgcacagagctgcaaacaactatacatgatataatatta180

gaatgtgtgtactgcaagcaacagttactgcgacgtgaggtatatgactttgcttttcgg240

gatttatgcatagtatatagagatgggaatccatatgctgtatgtgataaatgtttaaag300

ttttattctaaaattagtgagtatagacattattgttatagtttgtatggaacaacatta360

gaacagcaatacaacaaaccgttgtgtgatttgttaattaggtgtattaactgtcaaaag420

ccactgtgtcctgaagaaaagcaaagacatctggacaaaaagcaaagattccataatata480

aggggtcggtggaccggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatcaagaacacgtagagaa540

acccagctgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagag600

acaactgatctctactgttatgagcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaata660

gatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgt720

tgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtact780

ttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaacca840

catggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgat900

ctctactgttatgagcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtcca960

gctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgt1020

gactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaagac1080

ctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccatcgttggta1140

tcgttgcgggtctggcggttctggcggttgttgttatcggtgcggttgttgcggcggtta1200

tgtgccgtcgtaaatcttctggtggtaaaggtggttcttactctcaggcggcgtgctctg1260

actctgcgcagggttctgacgtttctctgaccgcgtga1298