一种苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及杂环化合物和荧光探针，具体为一种苯并噻唑衍生物(btno)及其制备方法，以及该衍生物在监测细胞质ph变化方面的应用。

背景技术：

细胞内ph值是细胞新陈代谢的重要参数之一，在细胞各项生理和病理过程中扮演着十分重要的角色，例如，酶活性调节，蛋白质形态维持，细胞分裂和凋亡，离子运输，胞吞作用，细胞能量产生和转化，膜电位平衡和信息传递等。同时，有研究表明癌症(肿瘤细胞)的生长与转移，多药耐药性、帕金森症和阿兹海默症等疾病都与细胞内ph异常密切相关。因此，对细胞内ph变化进行实时、准确地监测具有极其重要的意义。

近年来，文献报道了许多有机小分子荧光探针用于细胞内ph变化的检测，这些探针大多数都是用于酸性ph响应的荧光探针，例如溶酶体(ph4.0-5.5)。然而细胞内大量存在的细胞质基质和细胞核，线粒体等亚细胞区室的ph呈近中性或弱碱性，有关这类ph探针的报道不多，尤其是基于比率荧光发射技术的探针更是少见。比率荧光发射通过同时记录两个不同发射波长的荧光强度，并计算它们的比值可以有效避免例如：溶剂极性、探针浓度在细胞内负染不均、温度、仪器等其他环境因素的干扰，从而达到对分析物精确的定量分析。因此，非常有必要设计开发新型比例发射型ph荧光探针用于细胞质内ph变化的监测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种苯并噻唑衍生物btno及其制备方法；另一目的是提供该衍生物作为比率型ph荧光探针在监测细胞质内ph变化方面的应用。

本发明提供的一种苯并噻唑衍生物btno，其结构式为：

本发明提供的一种苯并噻唑衍生物btno的制备方法，包括如下步骤：

(1)将6-羟基-2-萘甲醛，2-甲基苯并噻唑，三甲基氯硅烷按摩尔比2:3-10:10溶于少量二氯甲烷并置于高压反应釜中密封后，于105℃下反应24h；待反应冷却至室温后，减压浓缩，将所得固体溶于水，并用na2co3调节溶液的ph至6.0；然后用二氯甲烷萃取，除去溶剂制得产物粗品；

(2)将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品。

步骤(1)中所述的6-羟基-2-萘甲醛，2-甲基苯并噻唑和三甲基氯硅烷的摩尔比为2:3:10。

该衍生物btno合成路线为：

本发明衍生物btno作为探针具有良好的细胞膜渗透能力，可用于细胞质内ph变化的监测。

与现有的ph荧光探针相比，本发明合成的探针btno具有以下优点：(1)本探针属于比率发射型ph荧光探针(f456nm/f526nm)，能够有效降低因探针自身浓度和染色不均等因素造成的干扰；(2)探针btno的pka为7.91±0.034，ph线性响应范围为7.00-9.50，适用于中性细胞质和弱碱性范围ph变化的监测；(3)本探针是基于分子内电荷转移(ict)效应设计的——萘环上的羟基作为电子给体，苯并噻唑为电子受体，在碱性条件下btno的羟基失去电子变成酚氧负离子，使得整个分子的ict效应增强，并导致探针的吸收光谱和发射光谱红移，在自然光和紫外光照射下可用肉眼观察到明显的颜色变化；(4)高的荧光量子产率(以硫酸奎宁为基准物测得本发明探针的荧光量子产率为0.88)，生物成像时能有效降低背景荧光的干扰；(5)探针具有优异的光稳定性，在实时监测生物样品ph变化时，有利于保持较高信噪比，减小误差；(6)大的stokes位移(～132nm)，能有效降低激发光的干扰；(7)本探针对ph响应具有优异的抗干扰能力，不受常见的阴、阳离子，氨基酸活性氧(ros)和活性氮(rns)等物质的干扰；(8)该探针具有优异的细胞膜渗透能力，可利用激光共聚焦成像技术对细胞质内ph的变化实现实时监测；(9)本探针合成步骤简单，成本低廉。

附图说明

图1.本发明btno作为探针随ph值变化的紫外吸收光谱图。

图2.本发明btno作为探针在自然光下结合质子前后颜色变化，颜色由黄色变为浅绿色。

图3.本发明btno作为探针随ph值变化的荧光发射光谱图。

图4.本发明btno作为探针在紫外灯下结合质子前后颜色变化，颜色由绿色变为蓝色。

图5.本发明btno作为探针，其f456nm/f526nm随ph值变化的boltzmann函数关系，pka＝7.91±0.034。

图6.本发明btno作为探针，其f456nm/f526nm随ph值变化的一次函数关系，线性范围为ph7.00-9.50。

图7.本发明btno作为探针在常见阴阳离子和生物体内一些常见氨基酸、活性氧、活性氮等物质存在下，对oh^-的选择性。

图8.本发明btno作为探针分别在ph5.50，ph6.50，ph7.00，ph7.40，ph8.00，ph8.50和ph9.50时，与hela细胞共同孵育30min的激光共聚焦成像图。

图9.本发明btno作为探针与hela细胞共同孵育30min后加入nh4cl处理，分别在0min、10min、20min、30min和40min时的激光共聚焦成像。

图10.本发明btno作为探针与hela细胞共同孵育30min后，分别再加入h2o2和nac(n-乙酰半胱氨酸)孵育1h后的激光共聚焦成像。

具体实施方式

实施例1

1，6-(2-(苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚(btno)的制备：

(1)将6-羟基-2-萘甲醛(10mmol，1.7218g)，2-甲基苯并噻唑的(15mmol，1.89ml)，三甲基氯硅烷(50mmol，6.40ml)，10mlch2cl2的混合溶液在105℃于高压反应釜中，反应24h。减压下除去溶剂，将得到的固体溶于水，并用na2co3调节溶液的ph至6.0后用ch2cl2萃取。除去溶剂制得产物粗品；

(2)将产物粗品经硅胶柱分离纯化，v乙酸乙酯:v正己烷＝1:6为洗脱剂，得到红棕色固体产物btno(1.58g,52％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ10.62(s,1h),10.34(s,1h),10.04(s,1h),9.97(s,1h),9.65(s,1h),8.43(s,1h),8.02(d,j＝8.7hz,2h),7.80(dd,j＝18.1,8.5hz,2h),7.21(d,j＝8.4hz,2h),7.02(s,1h).¹³cnmr(101mhz,d⁶-dmso)δ197.80(s),197.53(s),163.67(s),143.29(s),140.03(s),136.82(s),136.54(s),136.50(s),132.27(s),131.85(s),127.94(s),127.87(s),125.01(s),123.31(s),114.40(s),100.00(s),84.53(s),84.20(s),83.86(s).ms(esi)m/z:calcd304.0791；found304.0787[m+h]⁺.

实施例2

将实施例1的btno浓度保持在150μm，在dmso/水(体积比为2:1)体系中用高浓度小体积的hcl和naoh溶液调节ph值，记录其吸收光谱(图1)。随着ph值的降低，385nm处的吸收峰逐渐降低，321nm处的吸收峰相应增强，并且在349nm处存在一个等吸收点。溶液的颜色也由黄色变为浅绿色(图2)。

实施例3

将实施例1的btno浓度保持在10μm，在dmso/水(体积比为2:1)体系中用用高浓度小体积的hcl和naoh溶液调节ph值，以349nm为激发波长，记录其荧光发射光谱(图3)。随着ph值的降低，526nm处的荧光峰逐渐减弱，而456nm处的荧光峰逐渐增强。紫外灯下溶液的颜色由绿色变为蓝色(图4)。通过boltzmann函数拟合f456nm/f526nm值与ph变化曲线，计算pka值为7.91±0.034(图5)，ph响应线性范围为7.00-9.50。线性回归方程为f456nm/f526nm＝2.13641-0.21119×ph,相关系数r²＝0.9995(图6)。

实施例4

将实施例1的btno浓度保持在10μmol/l，分别考察该探针和常见的阴、阳离子以及生命体中一些氨基酸、ros和rns等物质的响应情况。如图7所示，该探针对上述物质几乎没有响应，证明本探针对oh^-具优异的选择性。图7中物质的顺序和浓度依次为：1,blank；2，k⁺(140mm)；3,cd²⁺(1mm),4,mg²⁺(1mm)；5,li⁺(0.1mm)；6,co²⁺(0.1mm)；7,hg²⁺(0.1mm)；8,ba²⁺(0.1mm)；9,ni²⁺(0.1mm)；10,ca²⁺(0.1mm)；11,fe²⁺(0.1mm)；12,zn²⁺(0.1mm)；13,cu²⁺(0.1mm)；14,mn²⁺(0.1mm)；15,f^-(1mm)；16,br^-(1mm)；17,i^-(1mm)；18,so4^2-(1mm)；19,s2so3^2-(1mm)；20,so3^2-(hso3^-,0.1mm)；21,s^-(hs^-,1mm)；22,no3^-(1mm)；23,no2^-(1mm)；24,ac^-(1mm)；25,co3^2-(hco3^-,1mm)；26,clo^-(1mm)；27,clo4^-(1mm)；28,o2^2-(1mm)；29,onno^-(0.1mm)；30,o^2-(1mm)；31,l-gsh(1mm)；32,hcy(1mm)；33,cys(1mm)。

实施例5

将贴壁的hela细胞与实施例1的btno在ph7.40的条件下，于37℃、5％co2的孵育箱中共同孵育30min，然后用磷酸盐缓冲液(ph7.40)轻轻洗涤3次，除去多余的btno，再使用ph分别为5.50、6.50、7.00、7.40、8.00、8.50和9.50的高k⁺缓冲液(30mmnacl、120mmkcl、1mmcacl2、0.5mmmgso4、1mmnah2po4、5mm葡萄糖、20mmhepes和20mmnaoac)和尼日尼亚菌素处理10min，在激光共聚焦显微镜下观察。固定激发波长为405nm收集蓝色通道430-480nm和绿色通道500-550nm。如图8所示，当ph＝5.50细胞在蓝色通道和绿色通道均能观察到明亮的发光；当ph升高至9.50时，细胞的蓝色荧光明显减弱，而绿色荧光显著增强，通过绿光/蓝光的比率成像也可以明显看到ph的变化趋势。

实施例7

为了证明实施案例1的btno具有对细胞质范围ph变化的快速响应能力，我们分别使用nh4cl(5mm)、h2o2(0.1mm)和nac(0.5mm)处理被btno染色的hela细胞并记录一段时间后各个通道下的细胞内荧光变化。用nh4cl处理后的hela细胞蓝色通道荧光逐渐减弱，绿色通道荧光逐渐增强，这意味着nh4cl处理后的hela细胞ph逐渐升高(图9)。如图10所示，用h2o2处理后的hela细胞相较于未处理的细胞ph明显降低，而nac处理的细胞明显增加。这些结果表明btno能快速响应细胞内ph的波动。