本发明属于发酵工程技术领域，具体地说，涉及一种半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法。
背景技术：
吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinine，pqq)是一种水溶性的醌类化合物，最早在微生物中发现，在细菌细胞中作为膜结合脱氢酶的氧化还原辅酶，随后的研究表明其也广泛存在于动植物体内，是葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅酶，日本学者认为pqq完全符合维生素的特征(nature2003；422:832)，主张将其列为第14种维生素。目前的研究发现，pqq具有调节体内自由基水平、刺激机体生长、促进神经生长因子合成、保护心脏、防治肝损伤、消炎、抑制某些肿瘤细胞、预防白内障、预防阿兹海默症、调节骨代谢平衡等多种生理功能。pqq作为一种具有多种生理医学功效的生物活性物质，在抗衰老，以及炎症、溶血性贫血、传输神经兴奋失调症、肝病、骨质疏松症等疾病的治疗或辅助治疗方面具有很大的潜力，具有良好的医疗和保健开发前景。
因为微生物发酵法生产pqq具有巨大的成本优势，化学合成法生产pqq的工艺已经被淘汰，能大量产生pqq的微生物主要有甲基杆菌属(methylobacteriumsp.)、甲基单胞菌属(methylomonassp.)、食甲基菌属(methylovorussp.)、黄色杆菌属(xanthobactersp.)、生丝微菌属(hyphomicrobiumsp.)等，而工业上已应用的生产pqq的菌种主要是生丝微菌属(hyphomicrobiumsp.)，所用到的发酵方法都是传统的补料分批发酵法。
目前传统的pqq分批发酵生产工艺具有两个突出的问题，一是每批发酵都要花大量时间培养增殖菌体，另一个是由于菌体和代谢产物的不断积累，pqq高速合成期维持时间很短，限制了pqq发酵产量的进一步提高。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法。
与一般的抗生素发酵不同，pqq发酵有两大特点：其一，pqq的发酵培养基配方是由低浓度的可溶性的无机盐和各种微量元素组成，配制好的pqq新鲜发酵培养基无色透明，od600值基本为零，因此在发酵中途向发酵罐中补充新鲜的发酵培养基，一方面能补充菌体生长和代谢需要的各种无机盐和微量元素，另一方面可以起到很好的稀释发酵液的作用。其二，pqq发酵具有一些初级代谢的特征，整个发酵过程中，菌体生物量是一直增加的，而且在一定的范围内，pqq的生物合成量(pqq发酵单位增长速度)与菌体的生物量(发酵液od600值)是正相关的。pqq发酵的这两个特点使得半连续发酵工艺具有很好的应用基础。
鉴于此，为了实现本发明目的，本发明提供一种半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法，以生丝微菌属(hyphomicrobiumsp.)微生物作为发酵菌种，采用半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌；所述方法包括以下步骤：
a、采用补料发酵的方法，待发酵液od600＝35-60(优选od600＝35-45)，进行部分放料和补充新鲜发酵培养基，将发酵液稀释至od600＝25-30(优选od600值为30左右)，继续发酵；
b、待发酵液od600＝35-60(优选od600＝35-45)，按照步骤a的方法进行放料和补充新鲜发酵培养基，然后继续发酵；
c、重复步骤b2-15次(优选8-10次)，结束发酵。
前述的方法，步骤a中放料的体积为发酵液总体积的10-90％，优选25-30％。
步骤a补料发酵的具体方法为：
a1、制备种子液；
a2、将步骤a1制备的种子液接入发酵培养基中，进行发酵培养，发酵全程用流加的方式补料甲醇，发酵液中甲醇浓度控制在0.1-1.0g/l。
其中，步骤a1包括将活化后的斜面菌种接种至种子培养基内进行培养，培养温度为29-31℃，通气搅拌培养至od600＝0.8-1.0，作为种子液。
步骤a2中种子液的接种量为5-10％，发酵培养条件为：29-31℃，转速100-600rpm，通气量0.5-1.0vvm，do≥30％；通过补氨水(浓度25-28％)控制发酵液的ph值为6.8-7.0。
本发明中使用的种子培养基的配方为：(nh4)2so42.4-3.6g/l，na2hpo4·12h2o2.4-3.6g/l，kh2po41.1-1.7g/l，mgso4·7h2o0.8-1.2g/l，cacl2·2h2o17-25mg/l，znso4·7h2o12-18mg/l，feso4·7h2o4.2-6.3mg/l，mnso4·4h2o2.5-3.8mg/l，cuso4·5h2o0.42-0.63mg/l，nacl0.8-1.2mg/l，(nh4)6mo7o24·4h2o17-25μg/l，ki17-25μg/l，cocl2·6h2o17-25μg/l，h3bo317-25μg/l，甲醇8-12ml/l，以水配制。
优选地，种子培养基的配方为：(nh4)2so43.0g/l，na2hpo4·12h2o3.0g/l，kh2po41.4g/l，mgso4·7h2o1.0g/l，cacl2·2h2o21mg/l，znso4·7h2o15.75mg/l，feso4·7h2o5.25mg/l，mnso4·4h2o3.15mg/l，cuso4·5h2o0.525mg/l，nacl1.05mg/l，(nh4)6mo7o24·4h2o21μg/l，ki21μg/l，cocl2·6h2o21μg/l，h3bo321μg/l，甲醇10ml/l，以水配制。
发酵培养基配方为：(nh4)2so42.4-3.6g/l，na2hpo4·12h2o2.4-3.6g/l，kh2po41.1-1.7g/l，mgso4·7h2o0.8-1.2g/l，cacl2·2h2o17-25mg/l，znso4·7h2o12-18mg/l，feso4·7h2o4.2-6.3mg/l，mnso4·4h2o2.5-3.8mg/l，cuso4·5h2o0.42-0.63mg/l，nacl0.8-1.2mg/l，(nh4)6mo7o24·4h2o17-25μg/l，ki17-25μg/l，cocl2·6h2o17-25μg/l，h3bo317-25μg/l，以水配制。
优选地，发酵培养基配方为：(nh4)2so43.0g/l，na2hpo4·12h2o3.0g/l，kh2po41.4g/l，mgso4·7h2o1.0g/l，cacl2·2h2o21mg/l，znso4·7h2o15.75mg/l，feso4·7h2o5.25mg/l，mnso4·4h2o3.15mg/l，cuso4·5h2o0.525mg/l，nacl1.05mg/l，(nh4)6mo7o24·4h2o21μg/l，ki21μg/l，cocl2·6h2o21μg/l，h3bo321μg/l，以水配制。
本发明所用的发酵生产pqq的菌种为生丝微菌(hyphomicrobiumsp.)dsm1869，购自德国微生物菌种保藏中心(dsmz)。
pqq的补料分批发酵有一个显著的特点，发酵单位的增长速度与发酵液od600值在一定范围内是正相关的，发酵前期发酵液od600值很低，基本上没有什么发酵单位增长，随着菌体的增殖，当od600值达到20以上时，发酵单位的增长速度逐渐加快，当od600值达到35～45时，发酵单位的增长速度是最快的，但随着发酵的继续进行，菌体会不停增殖，当发酵液od600值增长到60以上时，由于菌浓过高、溶氧不足、菌体老化、产物的反馈抑制等多方面因素的综合影响，发酵单位增长速度变慢，最后停止增长。
本发明提供的半连续发酵工艺在常规的补料发酵进行到发酵单位增长速度最快的阶段(发酵液od600值35～45)时，通过部分(总体积的25～30％)放料，再补充放料体积90％左右的新鲜发酵培养基，将发酵液稀释至od600值30左右，然后继续发酵，来维持发酵液的od600值一直在一个合适的范围内(发酵液od600值25～45)，另外还可以排出部分老化的菌体以及排出部分发酵产物。通过循环进行补料发酵、部分放料、补充新鲜发酵培养基、继续补料发酵的过程从而维持发酵罐内环境的相对稳定，保持发酵液较长时间处在发酵单位高速增长期中。
在半连续发酵的每一个循环中，培养条件、甲醇补料以及补氨水控制ph的方法与补料分批发酵是完全一样的。在每一个循环中，补入的甲醇和氨水的体积约占循环开始时补充的新鲜培养基的10～12％，因此每次放料后只补充放料体积90％的新鲜培养基，能够保持发酵液体积基本恒定。
半连续发酵的循环次数为2～15次，结束循环后，全部发酵液一次性放罐。半连续发酵的循环次数越多，设备利用效率越高，但是随着循环次数增加，发酵液中老化菌体所占的比例会越来越高，发酵罐中积累的代谢废物浓度也越来越高，总体上发酵单位的增长速度是在下降的，一般循环10次是较优的选择，10次之后相对于补料分批发酵已经不具有优势了。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)提高了生产效率和设备利用率。半连续发酵工艺通过巧妙的设计将pqq短暂的高速合成期变得可循环可重复，大大延长了pqq的高速合成期，从而提高了生产效率和设备利用率。按照平均循环10次计算，提高了生产效率和设备利用率30～50％；当生产规模越大，产量越大，由于可以多个半连续发酵罐共用种子罐以及新鲜发酵培养基储罐，提高设备利用率的效果就越明显。
(二)降低了生产原料成本。pqq的高速合成期也是原料的高效利用期，在相同产量的情况下，半连续发酵工艺降低了主要原料甲醇消耗的12～20％，从而降低了生产成本。
(三)降低了能耗。因为半连续发酵工艺大大减少了种子罐培养的次数以及相对减少了发酵罐前期的菌体增殖培养阶段，从而节省了一部分种子罐灭菌和菌体培养的能耗。
(四)提高了生产连续性。半连续发酵工艺使提取工序接料变得较连续和均匀，提高了生产连续性，这也有利于提高提取工序的设备利用率和生产效率(与传统分批发酵生产工艺相比，生产效率提高了25～50％)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的基础培养基的配方为：(nh4)2so43.0g/l，na2hpo4·12h2o3.0g/l，kh2po41.4g/l，mgso4·7h2o1.0g/l，cacl2·2h2o21mg/l，znso4·7h2o15.75mg/l，feso4·7h2o5.25mg/l，mnso4·4h2o3.15mg/l，cuso4·5h2o0.525mg/l，nacl1.05mg/l，(nh4)6mo7o24·4h2o21μg/l，ki21μg/l，cocl2·6h2o21μg/l，h3bo321μg/l，以水配制。
斜面培养基是在基础培养基的基础上添加20g/l的琼脂，灭菌后冷却到50℃左右，加入2％(v/v)的甲醇摇匀，摆成斜面冷却待用。
斜面菌种的培养：将生丝微菌(hyphomicrobiumsp.)dsm1869的菌种接种于斜面培养基，在温度29～31℃，湿度30～60％的条件下培养6～8天，得到成熟的斜面菌种。
实施例1pqq的摇瓶种子培养
按照基础培养基配方配制种子瓶培养基，种子瓶装量30ml/250ml，灭菌后，接种前，每瓶加入0.3ml的甲醇。
从斜面菌种接种到种子瓶，种子瓶培养工艺：培养温度30℃，摇床转速250rpm，培养时间48h，培养好的摇瓶种子液od600值为0.92。
实施例2pqq的摇瓶发酵
按照基础培养基配方配制发酵瓶培养基，发酵瓶装量30ml/250ml，灭菌后，接种前，每瓶加入0.6ml的甲醇。
将按照实施例1中方法培养好的摇瓶种子液转种到到发酵瓶，发酵瓶培养工艺：转种量10％v/v，培养温度30℃，摇床转速250rpm，培养时间5天，三个发酵瓶的发酵单位分别为9.2mg/l、11.7mg/l、13.6mg/l，平均为11.5mg/l。
pqq的生产菌种生丝微菌在摇瓶培养过程中，发酵液ph下降很快，逐渐偏离最适生长ph6.90越来越远，由于摇瓶发酵不便补氨水控制ph，因此摇瓶发酵的单位较低，摇瓶发酵单位与us005344768a实施例1的水平基本一致。
实施例3pqq的分批补料发酵小试
本实施例中使用的发酵设备为一套二联发酵小试罐设备，种子罐体积为5l，发酵罐体积为50l。
种子罐种子培养：种子罐培养基的配方同基础培养基配方，种子罐装量为3l/5l，灭菌后，接种前加入60ml甲醇，然后将按照实施例1中方法培养好的摇瓶种子液按照1.0％(30ml)的接种量接种到种子罐，种子罐培养工艺：培养温度30℃，通气量0.8vvm，搅拌转速100～300rpm，搅拌转速与溶解氧(do)关联，控制do≥30％，培养时间48h，培养好的种子液od600值为0.95。
发酵罐补料分批发酵：发酵罐培养基的配方同基础培养基配方，发酵罐装量为30l/50l，将培养好的种子罐种子液按照10％(3l)的转种量转种到发酵罐，发酵罐培养工艺：培养温度30℃，通气量0.8vvm，搅拌转速100～600rpm，搅拌转速与溶解氧(do)关联，控制do≥30％，发酵全程通过补氨水(浓度25-28％)控制发酵液的ph值6.8～7.0。
发酵罐补料工艺：转种后用蠕动泵连续流加补料甲醇，每8h取样测定发酵液中的甲醇含量和发酵液od600值，根据甲醇含量调整蠕动泵的补料速度，将发酵液中的甲醇浓度控制在0.1～1.0g/l之间。
发酵过程中每天取样测一次发酵单位。本实施例发酵到11天，发酵单位达到1550mg/l，发酵单位增长停滞，于是结束发酵并放罐，本批初始体积30l，共补入甲醇7.2l，补入氨水1.7l，因取样和蒸发等原因，最终放罐体积为33l。本实施例中发酵液的od600值和发酵单位增长情况如表1所示：
表1发酵液的od600值和发酵单位增长情况
从表1中可以看出，发酵前两天是菌体增殖阶段，基本没有发酵单位产生，发酵3-5天，随着发酵液od600值的增长，发酵单位的增长逐渐加快，发酵6-8天，是发酵单位的高速增长期，但在分批发酵时，由于菌体不停累积和衰老，高速增长期仅能够维持3天，发酵8天之后，发酵单位的增长速度就迅速减慢了。
实施例4pqq的半连续发酵小试(50l罐)
本实施例中所用到的发酵设备与实施例3中为同一套设备。
种子罐种子培养：种子罐培养基的配方同基础培养基配方，种子罐装量为3l/5l，灭菌后，接种前补入30ml甲醇，将按照实施例1中方法培养好的摇瓶种子液按照1.0％(30ml)的接种量接种到种子罐，种子罐培养工艺：培养温度30℃，通气量0.8vvm，搅拌转速100～300rpm，搅拌转速与溶解氧(do)关联，控制do≥30％，培养时间48h，培养好的种子液od600值为0.92。
发酵罐发酵工艺控制：发酵罐培养基的配方同基础培养基配方，发酵罐装量为30l/50l，将培养好的种子罐种子液按照10％(3l)的转种量转种到发酵罐，发酵罐工艺控制：培养温度30℃，通气量0.8vvm，搅拌转速100～600rpm，搅拌转速与溶解氧(do)关联，控制do≥30％，发酵全程通过补氨水(浓度25-28％)控制发酵液的ph值6.8～7.0。
发酵罐补料工艺：整个半连续发酵过程中一直用蠕动泵连续流加补料甲醇，每8h取样测定发酵液中的甲醇含量和od600值，根据甲醇含量调整蠕动泵的补料速度，将发酵液中的甲醇浓度控制在0.1～1.0g/l之间。发酵过程中每天测一次发酵液的发酵单位。
半连续发酵：发酵到168h时，发酵液od600值达到42.3，发酵单位达到1080mg/l，与实施例3基本同步，此时的发酵液体积约31.5l，放出9.5l发酵液，然后补入8.6l已灭菌的新鲜发酵培养基，继续按照上述的发酵控制工艺和补料工艺进行补料发酵，继续发酵24hh，取样测发酵液的od600值为43.8，再次放料9.5l发酵液，然后补入8.6l已灭菌的新鲜发酵培养基。之后每24h左右一个循环，每个循环的开始，放料约9.5l(30％)，然后补充8.5l左右的新鲜发酵培养基，继续补料发酵约24h，取样测发酵液od600值在35～45之间，则进入下一个循环。第10次循环结束时，因受菌体老化和代谢废物累计的影响，发酵单位日增幅已经降低到了205mg/l，不再部分放料和补充，继续发酵两天后全部发酵液一次性放罐，放罐单位1016mg/l，放罐体积32.5l，共计耗用甲醇约16.1l，耗用氨水约4.2l。本实施例中，每个循环开始时发酵液的od600值、发酵单位、放料体积和补充体积如表2所示：
表2发酵液的od600值、发酵单位、放料体积和补充体积情况
从表2中可以看出，本批发酵前6天同常规的补料发酵完全一样，经过发酵前期的菌体增殖阶段，同样进入了发酵单位的高速增长期，从发酵7天开始进行半连续发酵循环，通过半连续发酵循环，把补料分批发酵时仅能维持3天的发酵单位高速增长期，延长到了10天，从而大大提高了pqq的发酵生产效率。
本实施例中，所有放罐料液中pqq产量共计130.90g，发酵周期共19天，以50l小试罐的工作体积30l计算，半连续发酵的生产效率为230mg/l/天，实施例3中分批发酵的放罐料液中pqq产量为51.15g，发酵周期11天，分批发酵的生产效率为155mg/l/天。可以看出，使用同一套设备，半连续发酵比分批发酵的生产效率提高了48％。本实施例中，每发酵得到1克pqq消耗甲醇约122.2ml，实施例3中每发酵得到1克pqq消耗甲醇约139.8ml，半连续发酵相比分批发酵，主要原料甲醇的单耗降低了约13％。
实施例5pqq的半连续发酵试生产(20m3罐)
种子罐种子培养：种子罐培养基的配方同基础培养基配方，种子罐容积为2000l，装量为1500l，灭菌后，接种前，补入15l甲醇，将按照实施例1中方法培养好的摇瓶种子液按照0.1％(1500ml)的接种量接种到种子罐，种子罐培养工艺：培养温度30℃，通气量0.8vvm，搅拌转速100～200rpm，搅拌转速与溶解氧(do)关联，控制do≥30％，培养时间67h，培养好的种子液od600值为0.88。
发酵罐发酵工艺控制：发酵罐培养基的配方同基础培养基配方，发酵罐装量为15m3/20m3，将培养好的种子罐种子液按照10％(1500l)的转种量转种到发酵罐，发酵罐工艺控制：培养温度30℃，通气量0.6vvm，搅拌转速50～200rpm，搅拌转速与溶解氧(do)关联，控制do≥30％，发酵全程通过补氨水(浓度25-28％)控制发酵液的ph值6.8～7.0。
发酵罐补料工艺：整个半连续发酵过程中一直用蠕动泵连续流加补料甲醇，每8h取样测定发酵液中的甲醇含量和od600值，根据甲醇含量调整蠕动泵的补料速度，将发酵液中的甲醇浓度控制在0.1～1.0g/l之间。发酵过程中每天测一次发酵液的发酵单位。
半连续发酵：发酵到168h时，发酵液od600值达到39.6，发酵单位达到1018mg/l，此时的发酵液体积为16m3，放出4.5m3发酵液，然后补入4.1m3已灭菌的新鲜发酵培养基，继续按照上述的发酵控制工艺和补料工艺进行补料发酵，继续发酵24hh后，取样测发酵液的od600值为38.8，再次放料4.5m3发酵液，然后补入4.1m3已灭菌的新鲜发酵培养基。之后每24h左右一个循环，每个循环的开始，放料约4.5m3，然后补充4.1m3左右的新鲜发酵培养基，继续补料发酵约24h后，取样测发酵液od600值在35～45之间，则进入下一个循环。循环10次后不再部分放料和补充，继续发酵一天后全部发酵液一次性放罐，放罐单位985mg/l，放罐体积16.7m3，共计耗用甲醇约7650l，耗用氨水约1850l。本实施例中，每个循环开始时发酵液的od600值、发酵单位、放料体积和补充体积如表3所示：
表3发酵液的od600值、发酵单位、放料体积和补充体积情况
本实施例中，所有放罐料液中pqq产量共计约62.8kg，发酵周期共18天，以20m3发酵罐的工作体积15m3计算，半连续发酵的生产效率为232.5mg/l/天，相比实施例3的分批发酵，生产效率提高了49.8％。每发酵得到1克pqq消耗甲醇约121.8ml，比实施例3降低了约15％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。