与水稻稻瘟病抗性基因Pigm紧密连锁的分子标记R060939的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，特别是涉及一种与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在水稻稻瘟病抗性基因pigm定位或水稻遗传育种中的用途。
背景技术：
：水稻稻瘟病(riceblast)是水稻的重要病害之一,该病害可引起水稻产量大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至绝收。稻瘟病的防治对于我国粮食安全的保障起着至关重要的作用。目前种植抗病品种是防治该病害最经济有效的措施，但生产上的抗病品种较少且许多抗病品种在推广种植3～5年后就丧失了抗稻瘟病抗性。因此，培育出具有持久广谱抗稻瘟病的水稻是确保水稻安全生产的重要手段。传统抗病育种是根据分离群体的表现和育种者的经验进行选择，通常受环境条件、显隐性关系、基因上位等因素的影响，费时、费力、不准确，具体地，针对抗稻瘟病育种，在常规育种实践中，一般通过田间稻瘟病病菌接种实验或者在稻瘟病易发区来鉴定材料的稻瘟病抗性，通过实验，根据植株菌斑面积和发病叶片数等信息来判定苗子的稻瘟病抗性级别，进行分级，从而选择具有稻瘟病抗性的材料。总之，从鉴定一个植物抗病种到培育出抗病良种需花费十多年时间，而病原菌一旦侵袭，其扩散速度要比育种速度快得多。近年来生物技术的发展，尤其是分子标记技术的应用给水稻遗传育种带来了巨大变化。分子标记辅助选择为育种者提供了对目标性状进行选择的有效手段，它大大加速了育种进程，提高了育种选择效率，同时减少了盲目选择和人力、物力的大量浪费，展示出极其广阔的应用前景。目前，虽然已经定位了一些水稻稻瘟病的抗性基因和抗病位点，如pi-a、pii、pik，pigm等，但由于水稻抗稻瘟病的遗传机制较复杂，仍然缺乏足够数量的与抗稻瘟病性相关的qtls及分子标记。随着基因组学和生物信息的发展，通过基因组测序，开发与抗稻瘟病基因尤其是具有广谱持久的抗性且对中国大多数稻瘟病生理小种具有抗性的pigm基因紧密连锁的分子标记，将为水稻的遗传研究及育种开辟新的思路和方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记。本发明的另一目的是提供一种可用于pcr扩增与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记的引物对，以及由该引物对扩增获得的分子标记。本发明的再一目的是提供上述分子标记在水稻稻瘟病抗性基因pigm定位、检测以及水稻辅助育种中的用途以及上述分子标记的检测方法。本发明的目的还包括提供一种包括上述分子标记的重组载体，以及含有该重组载体的重组细胞；提供一种包括使用上述分子标记的水稻稻瘟病抗性基因pigm的定位方法，和使用所述分子标记的水稻辅助育种方法。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：本发明公开了一种与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记，所述分子标记含有seqidno：1所示核苷酸序列；优选的，所述分子标记为seqidno：1所示核苷酸序列。其中，需要说明的是，发明人针对pigm基因具有广谱持久抗性的特点，利用分子标记技术，开发出了上述与pigm基因连锁的标记。发明人发现，该分子标记与pi2、pi9、pigm、pi50、piz、piz-t等稻瘟病抗性基因均紧密连锁，其将在培育水稻抗稻瘟病新品种中发挥重要的作用。利用该标记可以迅速将具有广谱性的抗稻瘟病基因实现聚合，用于抗病育种时能够培育出持久广谱抗性品种。本发明还公开了一种扩增与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记的引物对，所述引物对扩增的目标序列包含seqidno：1所示序列；在本发明的一个实施方案中，所述引物对的引物1含有seqidno：2所示核苷酸序列，引物2含有seqidno：3所示核苷酸序列。在本发明的另一实施方案中，所述引物1为seqidno：2所示核苷酸序列，所述引物2为seqidno：3所示核苷酸序列。本发明还公开了一种与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记，所述分子标记是由上述引物对以抗稻瘟病的水稻基因组dna为模板经pcr扩增得到的。优选的由上述引物对扩增得到的分子标记含有seqidno：1所示核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段)为水稻基因组中seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段，即所包含的seqidno：1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是水稻基因组中的序列，优选的，为水稻基因组中seqidno：1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测抗白叶病的水稻基因组dna中的该分子标记，必然能够检测或扩增得到含有seqidno：1所示的序列。seqidno：1的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、小于800bp、或者小于500bp。在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段)所包含的seqidno：1的5’端和/或3’端可操作地连接有人工序列和/或控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地”在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于seqidno：1的一个位置上，以致该控制序列指导seqidno：1编码的多肽的产生。本发明还公开了一种载体，其含有本发明的分子标记。所述载体可以是插入有本发明的分子标记的表达重组载体或者克隆重组载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以理解，根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还公开了一种含有所述重组载体的重组细胞。本发明还公开了本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤：使用抗稻瘟病的水稻基因组dna作为模板，以上述引物对进行pcr扩增，得到的扩增产物即含有所述分子标记；优选地，还包括将pcr扩增产物进行纯化的步骤。对本领域技术人员而言，可以理解，也可以dna化学合成的方法得到本发明的分子标记。本发明还公开了本发明的分子标记的检测方法，包括步骤：根据上述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测水稻基因组dna为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。优选的，所述引物为上述分别含有seqidno：2和seqidno：3的引物对。例如，可以以被检测水稻的基因组dna为模板，以上述引物(seqidno：2和seqidno：3)进行pcr扩增，得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。本发明还公开所述分子标记或者所述分子标记引物对在水稻稻瘟病抗性基因pigm定位或检测中的用途。本发明还公开了一种水稻稻瘟病抗性基因pigm定位的方法，所述方法包括使用本发明的分子标记或分子标记引物对的步骤。本发明还公开了所述的分子标记或者所述分子标记引物对在水稻辅助育种中的用途。本发明还公开了一种水稻辅助育种方法，所述方法包括检测本发明的分子标记或用本发明的分子标记引物对进行检测的步骤。本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选水稻是否含有稻瘟病抗性基因pigm。所述检测可以是pcr检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对。所述检测还可以通过测序方法进行。该水稻辅助育种方法具有简便、快速、高通量的优点。由于采用以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：本发明提供了与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记，该分子标记将基因组dna序列与水稻稻瘟病抗性基因pigm联系起来，有利于水稻分子标记辅助育种体系的建立；所述分子标记与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于水稻育种实践和资源及品种鉴定。附图说明图1：分子标记引物(seqidno：2和seqidno：3)父本、母本和杂交f1代扩增的电泳检测结果，其中：父本扩增片段约为800bp，母本扩增片段约为550bp，杂交f1代同时含有这两个扩增片段；图2为部分f2个体利用分子标记引物(seqidno：2和seqidno：3)扩增的结果。具体实施方式本发明公开了一种引物对以及与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记r060939(seqidno：1所示的核酸序列)。利用本发明的引物对，以水稻基因组dna为模板进行pcr，可以得到与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记，该分子标记在本发明中命名为分子标记r060939。需要指出的是，本领域技术人员可以理解，除了通过上述pcr扩增获得本发明的分子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。本发明的引物对分别含有序列表seqidno：2和seqidno：3所示核苷酸序列。本领域技术人员熟知，在上述seqidno：2和seqidno：3所示核苷酸序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～10个碱基，所增加的碱基类型可根据水稻基因组dna上与seqidno：2和seqidno：3相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物对与seqidno：2和seqidno：3的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的dna序列相同)。因此，上述在seqidno：2和seqidno：3的5’端或3’端分别增加1～10个碱基并能扩增得到基本相同dna片段的引物对，均包括在本发明的引物对中。在本发明具体的实施方式中，本发明的引物对优选为seqidno：2和seqidno：3所示核苷酸序列。下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自illumina公司。实施例11、水稻f2代分离群体的构建父本为谷梅4号，是一个来在四川的地方品种，具有广谱持久的抗稻瘟性，即抗性表现为广谱高抗。母本为宁粳43号，是一个优质水稻品种，由宁夏农林科学院研究所以宁粳12号、意大利4号、92夏温37选育而成。株高95cm，株型紧凑，茎杆较粗壮，叶色深绿，长势繁茂，分蘖力中等，主茎叶片15片，半直立穗型，穗大粒多，每穗结实92粒以上，结实率84％以上，千粒重24.6g，籽粒长粒型，颖壳黄略偏灰白色，无芒。经农业部食品质量监督检测中心(武汉)测定：糙米率81.2％，精米率80.6％，整精米率78.8％，垩白粒率10％，垩白度0.5％，粒长5.6mm，长宽比2.1，透明度1级，碱消值7.0级，胶稠度82mm，直链淀粉16.8％，米质达到国际优质米1级。全生育期150-155天，晚熟品种。耐肥抗倒，耐低温，抗稻瘟病能力较差。母本经去雄处理后，用父本花粉和母本杂交得到f1，f1代自交产生f2代群体，共198个单株。将f2群体种植在深圳华大农业大鹏园区中，观察子代的稻瘟病抗性，测定表型数据。表型数据显示：在198个f2后代中，其中147个个体植株未感染稻瘟病，具有稻瘟病抗性性状；另外51个个体植株感染了稻瘟病，不具有稻瘟病抗性。经卡方检测可知，f2稻瘟病抗性性状分离比为3:1，符合单基因控制性状的孟德尔遗传规律，可知在此群体中稻瘟病抗性是显性单基因控制质量性状。表1水稻f2群体稻瘟病抗性分离比例2、父母本以及f1代、f2代个体基因组dna的提取用改良的ctab法分别提取父母本、f1代以及f2代个体的基因组dna，具体方法如下：1)取样：取幼嫩的叶片1g左右，置于2ml离心管中。2)样品冷冻抽干：取好的样品家研磨珠，打开管盖放入真空冷冻抽干机，-50℃条件下持续冷冻抽干12小时以上(一般冷冻抽干过夜)。3)样品研磨：将冷冻抽干的样品置于高通量机械研磨仪中，启动程序研磨，将样品粉碎。机械研磨仪程序运行需5分钟，通量为96份样品/5分钟。4)样品研磨充分后，在管内加入65℃预热1h的ctab提取液，混匀，65℃水浴40分钟，期间每隔5分钟颠倒混匀一次。5)将水浴后的样品从水浴锅内拿出，冷却至室温后，加入与ctab等体积的氯仿(三氯甲烷/异戊醇按照24:1比例混合)，轻轻混匀10分钟，至下层液体变为深绿色。(本步骤需在通风厨内操作)6)混匀后将离心管转入高速离心机内离心，转速12000rpm，离心15分钟。离心后样品上层为清夜。7)抽取适量的上清液于1.5ml离心管中，并加等体积的异丙醇，轻轻混匀(此时可以看到有絮状沉淀析出)，然后将样品置于-20℃的冰柜30分钟，以沉淀dna。8)样品冷冻30分钟后转移至高速离心机内离心，转速12000rmp，离心10分钟。9)弃掉清夜，dna沉淀用75％乙醇洗涤2次，洗涤后将乙醇倒掉，敞开管口放置于通风厨内晾干。10)待乙醇完全挥发后，加入50微升te缓冲液(加rna酶)溶解dna，并于-20℃保存。3、遗传图谱构建和基因定位(1)遗传图谱构建针对步骤2中获得的f2代个体的基因组dna，基于rad-seq的基因分型技术对f2群体的个体进行基因分型，获得f2群体的基因型数据。用mapmaker3.0软件(constructinggeneticmapswithmapmaker/exp3.0，slincoln，mdaly，elander-cambridge，ma:whiteheadinstitute，1992)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。(2)基因定位由于父母本在稻瘟病抗性表现上有明显的差异(父本广谱抗病，母本低抗稻瘟病)，对f2个体进行性状分析，并根据性状与分子标记之间的连锁关系将源自于父本的抗稻瘟病基因定位在遗传图谱上。具体地，根据步骤1获得的f2群体的表型数据，结合群体基因型以及遗传连锁图，通过winqtlcart2.5软件进行qtl定位。结果显示，其中一个水稻抗稻瘟病基因pigm定位在6号染色体9395664和9396272区间内，长度约608bp。4、分子标记的开发根据rad-seq的测序结果，利用华大自主开发的soap软件比对测序reads，然后用soapsv寻找片段差异较大的分子标记，便于用凝胶电泳区分鉴别。选择靠近抗稻瘟病基因pigm所在区段的标记r060939作为候选。所述分子标记表现为seqidno：1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性。根据本发明的实施例，seqidno：1所示核苷酸序列如下(336bp)：gaaagactggcagagtaaggctgtctttagttcacactaaaattttagttgaaattggtacgatgtgataggaaagttgtgtgtgtatgaaatgtttgatgtgatagaaaattggaagtttggaaaaaaaactttggaactaggctatgtttagttcagcgcaaagtttggattttggttgaaattggagatgatgtgaccgaaaagttgtgtgtgtatgataggttgatatgatggaaaaggactgaagcttgaatccatctaaacacagcctaaacaggacctaaacaaattcctaactactctagctaaaatatcgcagaaaccctccccaca(seqidno：1)。5、候选分子标记验证对步骤4中确定的水稻抗稻瘟病候选分子标记r060939(seqidno：1所示的核酸序列)进行验证，具体如下：针对上述候选分子标记设计引物，引物序列如下所示：正向引物:5’-ctcagcaaaccatgttcagt-3’(seqidno：2)反向引物:5’-aaacagctcgtggtttcgct-3’(seqidno：3)利用上述引物，通过pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该候选分子标记的多态性和扩增稳定性。具体地，以步骤3中提取的父母本、f1代、f2代的基因组dna为模板，利用上述扩增引物进行pcr扩增，其中，pcr反应体系如下：无菌水20.2μl10*buffer(含mg2+)2.5μldntps(25mm)0.15μltaq酶(5u/μl)0.15μl正向引物0.5μl反向引物0.5μl模板1.0μl总体积25μlpcr反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。pcr扩增产物经纯化后于4℃下保存。经上述扩增过程得到分子标记，取部分pcr扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到多态性电泳条带，结果见图1-2。如图1所示，父本扩增片段约为800bp，母本扩增片段约为550bp，杂交f1代同时含有这两个扩增片段。图2为部分f2个体用此标记引物扩增结果，凡是扩增条带为800bp或者同时含有两个扩增片段的个体，其植株具有稻瘟病抗性；凡扩增条带为550bp的个体，其植株不具有稻瘟病抗性。由此证明该分子标记r060939(seqidno：1所示的核苷酸序列)在父母本之间具有多态性，并与抗稻瘟病性状紧密连锁。然后，利用3730测序仪对各扩增产物进行测序，结果，父本及f2代中抗稻瘟病的单株扩增条带，与母本及f2代中不抗稻瘟病的单株扩增条带相比增加了一些序列，即为候选分子标记r060939。由此，证明该候选分子标记r060939在父母本之间具有多态性，该候选分子标记与水稻抗稻瘟病性状紧密相关，且具有与稻瘟病抗性基因pigm连锁遗传的稳定性。因为候选分子标记具有多态性、与稻瘟病抗性基因pigm连锁遗传的稳定性，所以该候选分子标记可作为稻瘟病抗性基因pigm的分子标记使用。多态性指的是：分子标记在抗稻瘟病和不抗稻瘟病水稻基因组中的序列不同，可以区分。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。序列表<110>中国农业科学院深圳生物育种创新研究院深圳市华大农业应用研究院深圳华大生命科学研究院<120>与水稻稻瘟病抗性基因pigm紧密连锁的分子标记r060939<130>p2018-1-0111.cn<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>336<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<400>1gaaagactggcagagtaaggctgtctttagttcacactaaaattttagttgaaattggta60cgatgtgataggaaagttgtgtgtgtatgaaatgtttgatgtgatagaaaattggaagtt120tggaaaaaaaactttggaactaggctatgtttagttcagcgcaaagtttggattttggtt180gaaattggagatgatgtgaccgaaaagttgtgtgtgtatgataggttgatatgatggaaa240aggactgaagcttgaatccatctaaacacagcctaaacaggacctaaacaaattcctaac300tactctagctaaaatatcgcagaaaccctccccaca336<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成(artificial)<400>2ctcagcaaaccatgttcagt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成(artificial)<400>3aaacagctcgtggtttcgct20当前第1页12