一种快速检测伤寒沙门菌菌血症的血培养PCR方法与流程

本发明涉及伤寒沙门菌检测，尤其涉及一种快速检测伤寒沙门菌菌血症的血培养pcr方法。

背景技术：

每年，全世界大约有2100万伤寒沙门菌(salmonellaentericaserovartyphi,s.typhi)感染病例，尤其在发展中国家每年大约有20万人死于肠热症。在我国，肠热症的的发病率呈逐年下降趋势，但也出现了新的流行特点。不均横的地域发病，病例多为散发，起病隐匿，临床抗生素不规则应用也掩盖了伤寒热的临床症状和增加了无症状携带者的患者人数。因此建立灵敏特异的方法对菌血症中s.typhi的鉴别诊断显得尤为迫切。

目前，患者血培养或者粪便培养分离s.typhi病原体仍然是临床诊断伤寒热的最重要的方法。但是血培养或者粪培养检测s.typhi的阳性率低，大约只有45～70％的伤寒热病人血培养或粪培养阳性。而且，血培养或粪培养周期长，通常需要2～5天的时间才能获得培养报告。血清学方法(肥达氏反应)检测s.typhi抗体在临床上广泛运用，肥达氏反应原理是通过灭活的沙门菌菌体作为抗原检测患者血液中有无特异性s.typhi抗体，但由于存在非特异性的抗原抗体反应，常出现假阳性或假阴性。

相比于上述的方法，分子诊断(pcr方法)无疑具有更大的优势。pcr法理论上只能扩增特异性片段(特异性)，可以检测更低水平的活菌或者死菌(敏感性)。由于s.typhi在血液中的低载量以及血液中大量人类基因组的干扰，从未经处理的菌血症样本中直接提取基因组作为pcr模板，再扩增s.typhi靶基因，扩增效果不佳或存在假阳性或假阴性现象。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一种快速检测伤寒沙门菌菌血症的血培养pcr方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。

根据本发明的一个方面，提供一种快速检测伤寒沙门菌菌血症的血培养pcr方法，包括以下步骤,

步骤s1：培养菌血症样本4～6h；

步骤s2：加入胆汁，制备成胆汁终浓度为0.3～5％的胆汁与菌血症样本混合液，裂解人血细胞；

步骤s3：pbs洗涤去除人类基因组干扰；

步骤s4：提取伤寒沙门菌基因组dna；

步骤s5：用pcr方法检测伤寒沙门菌flic基因。

本发明通过使用胆汁裂解菌血症样本中的血细胞，离心后，pbs洗涤去除人基因组，获得较纯的细菌基因组模板，以此为模板进行pcr反应，扩增效率显著提高。

在一些实施方式中：步骤s1中，每毫升菌血症样本加入3～5mllb液体培养基培养5h。

在一些实施方式中：步骤s1中，菌血症样本培养温度为35～39℃。

在一些实施方式中：步骤s2中在经过培养后的菌血症样本中加入胆汁，制成终浓度为1％的血细胞混合液，在35～39℃下孵育5～20min，裂解人血细胞。

在一些实施方式中：胆汁为小牛胆汁。

在一些实施方式中：步骤s3中，将裂解后的菌血症样本进行离心处理，离心处理后，弃上清，pbs洗涤，收集沉淀物。

在一些实施方式中：离心转速为7000-13000rpm，离心时间为5-20min。

在一些实施方式中：pbs洗涤次数为至少一次。

在一些实施方式中：步骤s4中，通过磁珠法提取细菌基因组试剂盒提取经pbs洗涤后的菌血症样本中的细菌基因组，30-80微升水溶基因组dna，分装，-15～25℃冻存。

在一些实施方式中：步骤s5中，以提取的细菌基因组为模板，检测s.typhi基因flic，flic上游引物tacaccccgaaagaaactgc，flic下游引物ttaagctcaccgcctgttct，扩增片段长度692bp，50μlpcr反应体系：25μl2xmixbuffer,10μm的flicf、flicr各4μl，提取的基因组dna模板2μl，水补足至50μl，扩增条件：94℃5min；94℃30秒，60℃30秒，72℃1min，30个循环；72℃10min。

附图说明

图1是本发明一种快速检测伤寒沙门菌菌血症的血培养pcr方法的小牛胆汁裂解血细胞示意图；

图2是本发明一种快速检测伤寒沙门菌菌血症的血培养pcr方法的oxbile与s.typhi共培养不影响细菌生长的示意图；

图3是本发明一种快速检测伤寒沙门菌菌血症的血培养pcr方法的oxlm提取的细菌基因组与常规方法提取的细菌基因组的质量比较。

具体实施方式

下面结合附图说明，对本发明作进一步详细说明。

菌血症样本制备：

将培养至od600＝0.1的s.typhi菌液，pbs10倍梯度稀释菌液，每管取10μl菌液点种lb固体培养基，37℃培养过夜，计数s.typhi菌落数，并计算od600＝0.1时沙门菌菌落形成单位(cfu/ml)。

将od600＝0.1时的s.typhi菌液用lb液体培养基10倍梯度依次稀释，最后用4.9ml无菌全血与100μl稀释菌液混合，制备成一定细菌含量的菌血症样本。

常规方法提取pcr模板：

5ml菌血症样本(4×10⁵、4×10⁴、4×10³、4×10²、4×10¹、4×10⁰、0cfu/ml)分别加入20mllb液体培养基，37℃，250rpm培养5小时，4000rpm离心10min，弃上清，pbs洗涤两次，收集沉淀，细菌基因组试剂盒(上海生工，磁珠法)提取基因组，50微升水溶基因组dna，分装，-20℃冻存。

采用本发明的胆汁裂解血细胞方法(oxbilelysisingrbcmethod,oblm)提取pcr模板：

5ml模拟菌血症样本(4×10⁵、4×10⁴、4×10³、4×10²、4×10¹、4×10⁰、0cfu/ml)加入20mllb液体培养基，37℃，250rpm培养5小时，加入1.25mloxbile(20％)至终浓度1％，37℃继续孵育10分钟裂解血细胞，10000rpm离心10min，弃上清，pbs洗涤两次，收集菌体，磁珠法提取细菌基因组试剂盒(上海生工,磁珠法)提取细菌基因组，50微升水溶基因组dna，分装，-20℃冻存。

常规血培养方法检测s.typhi菌血症样本：

5ml菌血症样本(4×10²、4×10¹、4×10⁰、0cfu/ml)加入血培养瓶，5h和24h观察血培养瓶阳性报警情况。

本发明血培养pcr方法检测s.typhi菌血症样本：

5ml菌血症样本(4×10²、4×10¹、4×10⁰、0cfu/ml)加入20mllb液体培养基，37℃，250rpm培养5小时，oblm提取s.typhi基因组，以pcr检测s.typhi。

pcr检测s.typhi：

以提取的细菌基因组为模板，检测s.typhi基因flic。flic上游引物tacaccccgaaagaaactgc，flic下游引物ttaagctcaccgcctgttct，扩增片段长度692bp。50μlpcr反应体系：25μl2xmixbuffer,10μm的flicf、flicr各4μl，提取的基因组dna模板2μl，水补足至50μl。扩增条件：94℃5min；94℃30秒，60℃30秒，72℃1min，30个循环；72℃10min。

oxbile(小牛胆汁)裂解血细胞：

1ml无菌全血加入4ml液体lb培养基，模拟血培养混合液，再加入250μloxbile(20％)溶液，制备成胆汁终浓度为1％的oxbile胆汁与菌血症样本混合液，37℃孵育10min裂解血细胞，吸取100μl混合液，显微镜低倍镜下观察血细胞裂解情况。

oxbile与s.typhi共培养：

将培养至od600＝0.1的s.typhi菌液，加入oxbile(20％)溶液，制备成终浓度为1％的oxbiles.typhi混合液，37℃孵育10min，同时以不加oxbile的s.typhi菌液作为对照，观察oxbile对s.typhi生存的影响。

oxbile可以完全裂解血细胞：

血细胞悬液中加入不同量的oxbile后，显微镜低倍镜显示，终浓度为1％、3％和5％的oxbile均能很好的裂解血细胞，而未加oxbile(0％)的血细胞形态完整，见图1。

oxbile不影响s.typhi存活：

取培养至od600＝0.1的菌液加入oxbile(终浓度为1％)，孵育10分钟，10倍梯度稀释法计数菌落形成单位，以不加oxbile的菌液为对照。结果显示,与不加oxbile处理相比，加入oxbile(终浓度为1％)不影响s.typhi存活，见图2。

本发明方法oxlm与常规方法提取的细菌基因组的质量比较：

分别以oxlm和常规方法提取菌血-lb混合液中基因组，提取的基因组凝胶电泳。结果如图3a所示，常规方法提取到大量基因组(主要是人血细胞基因组)，而oxlm提取到的细菌基因组在电泳图上未见。与常规方法提取的基因组相比，oxlm提取的细菌基因组能显著减少背景基因组的量。以提取的基因组为模板，扩增s.typhiflic基因。如图3b所示，以oxlm提取的细菌基因组作为pcr模板，能够检测低至4×10²cfu/ml的菌血症样本；而以常规方法提取的基因组作为pcr模板，只能检测到4×10⁵的菌血症样本。

(a)常规方法与oblm提取的pcr模板相比较，泳道1-7：常规方法提取的pcr模板，泳道8-14：oblm提取的pcr模板；(b)以常规方法与oblm提取的基因组为模板，pcr检测s.typhi敏感性比较，泳道1和8，2和9，3和10，4和11，5和12，6和13，7和14对应的样本分别为4×10⁵，4×10⁴，4×10³，4×10²，4×10¹，4×10⁰，0cfu/ml的菌血症。

血培养pcr方法与常规血培养方法检测s.typhi菌血症样本能力比较：

s.typhi菌血症样本经过5h的增菌，血培养pcr方法能够检测到低至4cfu/ml菌量的菌血症样本。而经过5h的增菌，常规血培养方法没有一个s.typhi菌血症样本报阳性；经过24h的增菌，4×10²和4×10¹cfu/ml的菌血症样本血培养报阳性，然而4cfu/ml菌量的菌血症样本血培养仍然阴性，结果见表1。血培养方法可以快速、准确地鉴定s.typhi菌血症

表1血培养pcr方法与常规血培养方法检测菌血症样本能力比较

注:“+”代表三个重复中一个为阳性；“—”代表三个重复中一个为阴性。

综上，胆汁(bile)是肝细胞分泌的分泌液，在胆囊里储存，胆汁由胆盐、胆色素、胆固醇、卵磷脂、钾、钠、钙等组成。胆汁具有阳离子洗涤剂作用，可选择性的溶解细胞膜上磷脂以及膜蛋白，破坏细胞膜，使细胞裂解。oxbile是从小牛胆囊里提取的胆汁，经脱水后制成商品化的胆汁粉，经复溶后能最大程度的保留胆汁的理化特性。因此，oxbile能够裂解血细胞。肠杆菌科细菌尤其是s.typhi经过长期的进化已经对胆汁耐受，oxbile被用作肠杆菌科的选择性培养基-麦康凯培养基的一种添加剂。本实验发现，如果直接提取菌血症样本的基因组dna，人类基因组的量远多于细菌基因组的量(图3a)，使下一步pcr扩增s.typhiflic基因的扩增效率显著降低(图3b)。因此，本研究通过使用oxbile裂解菌血症样本中的血细胞，离心后，pbs洗涤去除人基因组，获得较纯的细菌基因组模板，以此为模板进行pcr反应，扩增效率显著提高。

目前，血培养是诊断s.typhi感染的金标准，但常规血培养方法通常需要3-5天的时间来分离和鉴定，而临床通常希望快速明确感染病原体以确定治疗方案。肠热证患者外周血中s.typhi载量通常只有0.5-22cfu/ml，而pcr方法的检测限大约在10³copies/ml左右，所以必须通过一定时间的培养，富集到一定量的s.typhi(约10³cfu/ml)才能达到pcr的检测限。细菌大约20分钟分裂一代，所以在营养充足的情况下，5个小时的培养使血培养混合液中单个细菌理论上分裂成2¹⁵＝32768个细菌，即1.3×10³cfu/ml的细菌，超过pcr的约10³cfu/ml的检测限。因此本发明的血培养pcr方法通过5小时的血培养，收集细菌，提取细菌基因组dna进行pcr扩增。

flic基因全长1521bp，是s.typhi的一个重要的鞭毛基因，编码鞭丝蛋白。flic基因在s.typhi属内保守，而在肠杆菌科中特异，因此常被用作s.typhi病原学诊断的靶基因。

本发明的血培养pcr方法，用于检测s.typhi菌血症样本。通过5个小时的血培养，经oxbile裂解血细胞去除背景基因组干扰，最后pcr检测s.typhi特异性基因flic，该方法可以检测到低至4cfu/ml的菌血症样本。整个过程大约8小时，比起3-5天的血培养诊断方法，大大减少了诊断时间；同时，血培养pcr方法检测菌血症样本有很好的灵敏度以及特异性。

以上所述仅是本发明的一种实施方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干相似的变形和改进，这些也应视为本发明的保护范围之内。