犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒及其应用的制作方法

文档序号:21198771发布日期:2020-06-23 19:04阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种犬瘟热病毒的通用检测引物,其特征在于,所述的引物用于扩增犬瘟热病毒fsp基因保守区域,所述的引物由正向引物和反向引物组成,其中,所述的正向引物的核苷酸序列如seqidno.1所示,所述的反向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。

2.权利要求1所述的通用引物在制备检测犬瘟热病毒试剂中的用途。

3.一种犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒,其特征在于,含有一对用于扩增犬瘟热病毒fsp基因保守区域的通用检测引物,所述引物由正向引物和反向引物组成,其中,所述的正向引物的核苷酸序列如seqidno.1所示,所述的反向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。

4.如权利要求3所述的犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒,其特征在于,还含有用于纳米pcr检测的试剂。

5.如权利要求4所述的犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒,其特征在于,所述的用于纳米pcr检测的试剂包括2×nanopcrbuffer以及taqdnapolymerase。

6.如权利要求3所述的犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒,其特征在于,还含有标准品质粒,所述的标准品质粒是通过以下方法制备得到:提取cdv-3株病毒液的总rna,合成第一链cdna,以合成cdna为模板,通过pcr扩增得到cdv-3的f基因,将纯化的f基因连接至peasy-blunt载体上,即得,其中,优选的,用于扩增f基因的引物由正向引物和反向引物组成,其中,所述的正向引物的核苷酸序列如seqidno.3所示,所述的反向引物的核苷酸序列如seqidno.4所示。

7.如权利要求3-6任一项所述的犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒,其特征在于,用于犬瘟热病毒检测时,按照以下步骤进行:

(1)提取待测样本的总rna,合成第一链cdna;

(2)以步骤(1)合成的cdna为模板,采用用于扩增犬瘟热病毒fsp基因保守区域的通用检测引物进行纳米pcr扩增;

反应体系12μl:2×nanopcrbuffer6μl,10μm正向引物以及反向引物各0.5μl,taqdnapolymerase0.2μl,模板0.2μl,用双蒸水补足至12μl;

反应条件:95℃2min,95℃20s、54℃20s、72℃15s,35cycles;

(3)扩增结束后对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。


技术总结
本发明公开了一种犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒及其应用。本发明通过比对分析GenBank中已登录的23株犬瘟热病毒全基因组序列,根据犬瘟热病毒Fsp基因的保守序列设计了一对通用检测引物。同时对纳米PCR反应的退火温度、引物浓度进行了优化。灵敏度和特异性实验结果表明,本发明的纳米PCR检测方法的最低检测量为3×101拷贝/μL,相较于常规PCR提高了10倍。且本发明的纳米PCR检测方法只能针对犬瘟热病毒实现特异性扩增,而不能扩增犬副流感病毒、狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒和犬腺病毒I型II型。因此,本发明建立的纳米PCR检测方法具有快速、特异性强和灵敏度高的特点,为临床和实验室检测犬瘟热病毒提供了新的技术手段。

技术研发人员:薛向红;闫喜军;卜研;闫鸣昊;朱翔宇;赵建军;张海玲;赵传芳;胡博;王洋
受保护的技术使用者:中国农业科学院特产研究所
技术研发日:2018.12.14
技术公布日:2020.06.23
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