犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种病毒检测试剂盒，特别涉及一种用于犬瘟热病毒检测的纳米pcr检测试剂盒及其应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术：

犬瘟热(caninedistemper,cd)是由犬瘟热病毒(caninedistempervirus,cdv)感染犬、狐貉和水貂等食肉动物而引起的一种急性热性、高度接触性传染病。该病发病率高，临床症状多样，感染后期容易继发混合感染，死亡率高达30％-100％。近年来cdv自然感染宿主不断增多，随着人类对犬猫等宠物拥有数量的增多，犬瘟热病毒在给动物养殖业、生物多样化带来了极大损失和危害的同时，还威胁着社会公共安全。cdv是副黏病毒科麻疹病毒属成员，其基因组为单股负链不分节段rna。从3’到5’端依次是3’端前导序列、核蛋白(n)基因、磷蛋白(p)基因、基质蛋白(m)基因、融合蛋白(f)基因、血凝素蛋白(h)基因、聚合酶蛋白(f)基因和5’尾随序列。其中，h基因是cdv野毒株分子流行病学调查的主要靶基因。基于h基因的多样性,cdv可分为asia1、asia2、europe、europeanwildlife、america-2、arctic和america-1型(又称疫苗型)。目前我国流行毒株主要是asia1，对cdv的控制，主要采取弱毒活疫苗免疫措施，但疫苗免疫失败的现象却时有发生，甚至引起一定范围疫情暴发。实际感染案例中，犬瘟热病毒感染存在3-9天的潜伏期，这期间内病毒排出量较低。因此，高效、特异和灵敏的快速检测犬瘟热病毒感染对于及时发现和控制cdv感染、蔓延及流行至关重要。

传统的实验室诊断cdv方法有：病毒分离、免疫荧光、elisa和pcr等方法。这些方法要么操作复杂，费时费力，要么敏感度不高。后来学者们建立的鉴别cdv强弱毒方法有：复合反转录-套式聚合酶链式反应(rt-npcr)，联合rt-pcr，rt-lamp方法，sybrgreeni荧光定量rt-pcr方法。但这些方法需要专业技能人员操作和专用仪器。

纳米pcr技术是一种基于直径为1-100nm的胶体金颗粒缓冲液的新型pcr技术。纳米金具有良好的导热性和吸附dna作用，能使pcr反应快速达到靶向温度，减少非特异性扩增。目前尚未有应用纳米pcr技术检测犬瘟热病毒的报道。本发明根据cdvfsp基因的保守区域建立了cdv纳米pcr检测方法，可用于临床和实验室cdv感染的检测与诊断。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于犬瘟热病毒检测的纳米pcr检测试剂盒及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过比对分析genbank中已登录的23株犬瘟热病毒全基因组序列，根据犬瘟热病毒fsp基因的保守序列设计了一对通用检测引物nano-f/nano-r。同时对纳米pcr反应的退火温度、引物浓度进行了优化，确定了纳米pcr检测犬瘟热病毒的最佳退火温度54℃和最佳引物浓度0.5μl(10pmol/μl)。对纳米pcr的特异性和灵敏度进行了鉴定，结果表明，与普通pcr灵敏度3×10²拷贝/μl相比，本发明的纳米pcr检测方法的最低检测量为3×10¹拷贝/μl，灵敏度提高了10倍。特异性检测结果表明，该本发明的纳米pcr检测方法只能针对犬瘟热病毒实现特异性扩增，而不能扩增犬副流感病毒、狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒和犬腺病毒i型ii型。

本发明提出的一种犬瘟热病毒的通用检测引物，所述的引物用于扩增犬瘟热病毒fsp基因保守区域，所述的引物由正向引物和反向引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。

进一步的，本发明还提出了所述的通用引物在制备检测犬瘟热病毒试剂中的用途。

更进一步的，本发明还提出了一种犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒，其中含有一对用于扩增犬瘟热病毒fsp基因保守区域的通用检测引物，所述引物由正向引物和反向引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。

其中，优选的，所述的犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒中还含有用于纳米pcr检测的试剂。

其中，优选的，所述的用于纳米pcr检测的试剂包括2×nanopcrbuffer以及taqdnapolymerase。

其中，优选的，所述的犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒中还含有标准品质粒，所述的标准品质粒是通过以下方法制备得到：提取cdv-3株病毒液的总rna，合成第一链cdna，以合成cdna为模板，通过pcr扩增得到cdv-3的f基因，将纯化的f基因连接至peasy-blunt载体上，即得，其中，优选的，用于扩增f基因的引物由正向引物和反向引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述的反向引物的核苷酸序列如seqidno.4所示。

其中，优选的，使用本发明所述的犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒检测犬瘟热病毒时，按照以下步骤进行：

(1)提取待测样本的总rna，合成第一链cdna；

(2)以步骤(1)合成的cdna为模板，采用用于扩增犬瘟热病毒fsp基因保守区域的通用检测引物进行纳米pcr扩增；

反应体系12μl：2×nanopcrbuffer6μl，10μm正向引物以及反向引物各0.5μl，taqdnapolymerase0.2μl，模板0.2μl，用双蒸水补足至12μl；

反应条件：95℃2min，95℃20s、54℃20s、72℃15s，35cycles；

(3)扩增结束后对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明针对cdvfsp区域建立了犬瘟热病毒纳米pcr检测方法及其试剂盒，与常规pcr相比，犬瘟热病毒纳米pcr方法的最低检出量为3×10¹个拷贝，灵敏度是普通pcr的10倍。犬瘟热病毒纳米pcr方法具有高度特异性，对其他相关病毒无任何扩增，对犬瘟热病毒不同毒株均具有特异性扩增。因此，本发明建立的犬瘟热病毒纳米pcr检测方法为cdv检测提供了一种快速、高度灵敏和高度特异的检测方法，可用于临床诊断与实验室检测。

附图说明

图1为pblunt-f的鉴定结果；

m：dnamarker15000，1：限制性内切酶kpnⅰandnotⅰ双切质粒pblunt-f，2：质粒pblunt-f。

图2为退火温度和引物浓度的优化实验结果；

a：不同退火温度优化，泳道1-5分别为52℃、54℃、56℃、58℃和60℃；b：不同引物浓度扩增结果，泳道1-3分别为0.5μl、1μl、1.；5μl；m：dl2000bpdnamarker；

图3为纳米pcr(a)和普通pcr扩增(b)灵敏度检测结果；

m：dl2000bpdnamarker：泳道1-8：含有10⁷-10⁰拷贝/0.2μl的模板pblunt-f进行普通pcr(a)和纳米pcr(b)；

图4为纳米pcr反应的特异性。

泳道1-4是纳米pcr检测方法对犬瘟热病毒hbf-1,sd(14)07,or12和cdv/r-20/8的扩增结果，泳道5-10是纳米pcr检测方法对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬腺病毒ⅰ型和犬腺病毒ⅱ型的扩增结果，m：dl2000bpdnamarker。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1犬瘟热病毒纳米pcr检测方法的建立

1材料与方法

1.1毒株

cdv强毒hbf-1株和sd14(7)株、cdv疫苗毒cdv-3株、cdv/r-20/8株和cdv-or12株、犬副流感病毒(cpiv)、狂犬病病毒(rabv)、犬冠状病毒(ccov)、犬细小病毒(cpv)、ⅰ型犬腺病毒(cav-ⅰ)和ⅱ型犬腺病毒(cav-ⅱ)，均由中国农业科学院特产研究所疫病防控研究室保存。

1.2主要试剂和仪器

普通pcr扩增仪geneamppcrsystem2700和分光光度计nanodrop2000购自thermo；质粒小量提取试剂盒购自axygen；纳米pcr试剂盒nhs20-3购自上海户实；普通pcr试剂盒2×transstarteasytaqpcrkit购自transgen。

1.3标准品的制备

取cdv-3株病毒液200μl，按照rneasyminikit说明书，提取cdv-3株病毒液的总rna。按照superscriptⅲfirst-strandsynthesissupermix操作说明，合成第一链cdna。利用软件primerpremier5.0设计特异性引物f-f和f-r(序列见表1)，送上海生工公司合成。以合成cdna为模板，pcr扩增cdv-3的f基因，纯化目的产物后连接至peasy-bluntvector上，挑取阳性重组子，小量提取质粒pblunt-f。用分光光度计测定质粒在260nm与280nm波长下吸光度(a)值，判断质粒纯度(1.8>a260/a280<2.0)，测定质粒浓度，计算拷贝数/μl＝质粒浓度×6.02×10²³/660×质粒总长度(其中，6.02×10²³是阿伏加德罗常数，660是碱基对平均分子质量)。最后，标准品质粒分装后保存至-20℃待用。

表1扩增f基因用引物

1.4纳米pcr引物设计与合成

参照genbank中已公布的23株cdvf基因序列，具体如下：01-2689(ay649446)、007lm/b(ab490680)、onderstepoort(af378705)、cdvsy(kj466106)、ln(10)1(kp765764)、98-2654(ay466011)、00-2601(ay443350)、sd(14)7(kp765763)、hlj1-06(jx681125)、98-2646(ay542312)、98-2645(ay445077)、cdv2784-2013(kf914669)、a7517(af164967)、hebei(kc427278)、cdv3(eu726268)、m25cr/h(ab490681)、50cbi/h(ab490678)、011c/h(ab490674)、ps(jn896331)、snyderhill(gu138403)、164071(eu716337)、cdv-rd-jl(kj848781)、cdv-zc(kj994343)。选取fsp基因序列的保守区域设计1对通用检测引物nano-f/nano-r，送上海生工公司合成(序列见表2)。

表2纳米pcr检测用引物序列

1.5纳米pcr反应的优化

采用上海户实公司的纳米pcr产品，反应体系12μl：2×nanopcrbuffer6μl，nano-f以及nano-r各0.5μl(10μm)，taqdnapolymerase0.2μl，模板(标准品质粒)0.2μl，用双蒸水补足至12μl。设定52℃、54℃、56℃、58℃和60℃进行退火温度(tm)的优化；之后，改变引物浓度0.5μl、1μl、1.5μl优化反应体系。用geneamppcrsystem2700pcr仪进行自动化扩增，反应条件：95℃2min，95℃20s、tm20s、72℃15s，35cycles。扩增结束后对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

普通pcr反应体系用10×reactionbuffer1.2μl，dntp(2.5mm)1μl，其余同纳米pcr完全一致。

1.6灵敏性试验

利用建立的cdv检测用纳米pcr方法，选取含有3.0×10⁷，3.0×10⁶，3.0×10⁵，3.0×10⁴，3.0×10³，3.0×10²，3.0×10¹，3.0×100拷贝/0.2μl的标准品质粒pblunt-f为模板，分别进行纳米pcr和普通pcr，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，比较两者的灵敏度。

对本室保存的cdv强毒hbf-1株、sd(14)7株和疫苗毒or12株和cdv/r-20/8株，及其他6种非犬瘟热病毒：犬副流感病毒(cpiv)、狂犬病病毒(rabv)、犬冠状病毒(ccov)、犬细小病毒(cpv)、犬腺病毒ⅰ型(cav-ⅰ)和犬腺病毒ⅱ型(cav-ⅱ)的基因组进行检测。其中，rna病毒基因组需要进行cdna合成。验证该纳米pcr检测方法的特异性。

2结果

2.1cdvf基因重组质粒的鉴定

克隆cdv疫苗毒cdv-3株的f基因，连接至peasy-blunt载体上。重组质粒pblunt-f经kpnⅰ和notⅰ双酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，均获得大小约为2600bp(f基因)和4000bp(peasy-blunt载体)的两个片段(如图1)。测序鉴定完成正确。分光光度计测定质粒pblunt-f的浓度和纯度。pblunt-f浓度为101ng/μl，a260/a280比值分别为1.83，均符合纯度要求。根据拷贝数公式，计算出pblunt-f质粒溶液中dna拷贝数为1.5×10¹⁰/μl。

2.2纳米pcr反应条件和体系的优化

为确定纳米pcr反应的最佳引物浓度和反应条件。通过比较不同退火温度和不同引物浓度，试验结果表明：在本研究建立的纳米pcr反应中，引物浓度和退火温度对扩增产物量没有明显影响(如图2)。因此选择0.5μl(10μm)为引物最佳工作浓度，最佳退火温度为54℃。

2.3灵敏性试验

选取10倍系列稀释的含有3.0×10⁷～3.0×100拷贝/0.2μl的标准品质粒pblunt-f为模板，进行常规pcr和纳米pcr。结果可见：普通pcr的最小检测量3×10²个拷贝。而纳米pcr的最小检测量为3×10¹个拷贝(见图3)。

2.4特异性试验

用本发明建立的纳米pcr方法，对2种cdv强毒株、2种cdv疫苗毒和6种其他非犬瘟热病毒病原基因组cdna和dna进行检测。结果显示：建立的纳米pcr反应能对不同毒株犬瘟热病毒实现有效扩增，对其他相关病原扩增均为阴性(见图4)。

序列表

<110>中国农业科学院特产研究所

<120>犬瘟热病毒纳米pcr检测试剂盒及其应用

<130>klpi180995

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

gcaagccaacaggtcaaccaggtccac27

<210>2

<211>27

<212>dna

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ttccgaggcaccacaggactaaccagg27

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<211>23

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<400>3

tcagggtcttttcaaaattctct23

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<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

tggtaagagagcattgytggact23