一种维持金针菇菌种活力的方法与流程

本发明属于金针菇领域，更涉及一种金针菇菌种活力维持的方法。

背景技术：

金针菇属于四极性异宗结合的菌类，原拉丁名为flammulinavelutipes，2018年杨祝良研究团队与国内外同行合作发现，从东亚“冬菇”驯化而来的“金针菇”与原初描述于欧洲的毛腿金针菇是两个不同的物种，为此该团队给“冬菇”或“金针菇”起了一个学名，即“f.filiformis”。

金针菇是我们熟悉的一种食用菌，不但味美可口，而且具有抗氧化、提高免疫力等多种功效。它是我国最早实现工厂化栽培的菌类，近年来，随着工厂化技术的日益成熟，其产量不断地提高，2015年产量达261万吨，按产量在我国食用菌中排第4位。然而，金针菇产量的提高，很大程度得益于瓶栽技术的引进，而我国金针菇瓶栽工厂化使用的菌种几乎是从日本引进，且需要定期从日本引进更换菌种，即从日本那引进的金针菇菌种使用一段时间后，容易出现退化，需要重新引进活力好的菌种以保证稳定的生产。

菌种是生产的基础，活力高的菌种是进行稳定生产的前提，因此维持菌种原有的活力显得极其重要。目前，维护食用菌菌种活力的方式主要进行提纯复壮，有组织分离选择法、适当更换培养基、菌丝尖端分离以及其它的方法，如脱毒。这些方法虽能在一定程度上提高菌种的活力，但实际应用中往往不能保证提纯复壮后的菌种与原来的菌种活力一致。如组织分离，若该菌种已出现退化了，则分离的菌种是退化的菌种。因此找到一种方法能维持菌种的活力显得非常重要。

技术实现要素：

鉴于上述背景，本发明提供了一种维持金针菇菌种活力的方法。

本发明采取的技术方案包括金针菇异核体菌种的原生质体单核化，获得其单核化菌株，分别进行常规保藏，使用时金针菇异核体菌种与其单核化菌株进行配对，获得其重生的异核体菌种，这样即可对金针菇菌种的活力进行有效维持。

金针菇品种‘f’泛指所有的金针菇品种。本方法适合于所有的金针菇菌种活力维持。

本发明的金针菇菌种活力维持的方法包括以下步骤：

（1）将金针菇品种‘f’的单核化菌株‘fd1’或‘fd2’从保藏管取出，接种于马铃薯葡萄糖固体培养基中，即pda培养基，正面放置于22～25℃恒温生化培养箱，培养6～10d；

（2）将金针菇品种‘f’从保藏管取出，接种于pda培养基，正面放置于22～25℃恒温生化培养箱，培养5～7d；

（3）在无菌操作环境下，取金针菇品种‘f’新鲜菌块，放于直径9cm的pda培养基平皿中间位置，，同时接入金针菇品种的单核化菌株‘fd1’或‘fd2’的菌块，两者相距1～1.5cm，即配对，正面放置于22～25℃恒温生化培养箱，待两菌丝接触后，继续培养3～5d；

（4）两菌丝充分接触后，在无菌操作环境下，从单核化菌株‘fd1’或‘fd2’的一侧边缘取菌块，标记为‘f-1’，于新的pda培养基，正面放置于22～25℃恒温生化培养箱，培养3～5d；

（5）取‘f-1’前端的菌块于载玻片上、盖上盖玻片、压片，在显微镜下观察其菌丝是否有锁状联合，若能观察到即可，若不能观察到，则增加（3）中的培养时间，重复（4）、（5）步骤，直到可以看到锁状联合。菌丝有锁状联合的‘f-1’即为恢复新活力的‘f’品种。

所述金针菇品种‘f’的单核化菌株‘fd1’或‘fd2’，是指将异核体的金针菇品种‘f’，经过原生质体单核化，获得单核化的菌株‘fd1’或‘fd2’；

金针菇品种‘f’单核化菌株‘fd1’或‘fd2’的获得进行如下操作：

（1）将活化后的金针菇品种‘f’接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，静置培养4～5d；

（2）取新鲜菌丝于无菌的1.5ml离心管，用灭菌过的0.5mol/l的kcl清洗2遍；

（3）加入1ml含2wt.%溶壁酶的0.5mol/l的kcl，30℃恒温水浴酶解1.3～1.8h；

（4）将酶解好的菌丝液用带棉塞的注射器过滤到1.5ml离心管，5000rpm/min离心10min，弃上清保留沉淀；

（5）吸取0.6mol/l甘露醇1ml悬浮沉淀，5000rpm/min离心10min，弃上清保留沉淀；

（6）用0.6～1ml的0.6mol/l甘露醇溶解沉淀，吸50ul镜检，根据原生质体量稀释至一个视野下2～3个原生质体，150～180ul涂布于再生培养基，25℃培养，2~3d观察原生质体萌发情况；

（7）原生质体萌发后在显微镜下将其挑起于新的pda培养基，菌落长至2～3cm后，镜检，选择其菌丝未看到锁状联合的菌株，即为金针菇品种‘f’的单核化菌株‘fd1’或‘fd2’。

（注：菌落肉眼就可以看到，只有单根菌丝才需要在显微镜下看，若是异核体则能看到锁状联合，单核体是不会出现锁状联合这一结构特征的。）

本发明的优点在于：

菌种是科研与生产的基础，本方法从另一个角度上维持菌种的活力，与传统的食用菌菌种提纯复壮不同。本方法在获得单核化菌株的基础上，只需要将原来的品种与其单核化的菌株进行重新配对，获得新生的品种。通过这种方式获得的新生品种，在遗传物质上没有发生改变，保持了原来品种的特性，且菌种活力很高。在操作上简单易行，便可对菌种的活力进行有效地维持。

附图说明

图1金针菇异核菌株‘f’与其单核化菌株‘fd1’或‘fd2’配对，两菌块相距1～1.5cm（双箭头所示两菌块距离），配对后在菌块‘fd1’或‘fd2’一侧边缘取菌块，即为‘f-1’（正方形所示）。

图2为高活力‘农金7号’在栽培料上发菌，菌丝洁白、生长健壮。

图3为高活力‘农金7号’幼小子实体，多且整齐、粗壮。

图4为高活力‘农金7号’的子实体形态特征。

图5为高活力‘农金7号’的子实体重量，单袋重量可超过500g。

图6为低活力的‘农金7号’，在菌袋表面容易长菌皮，难于形成原基。

图7为低活力的‘农金7号’，菌袋长菌皮后，长出的子实体少。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。

试剂与仪器

马铃薯葡萄糖固体培养基（pda）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18～20g，蒸馏水1l，ph自然;

马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1l，ph自然;

再生培养基：甘露醇109g，麦芽糖5g，葡萄糖10g，酵母膏5g，琼脂18～20g，硫胺素30mg，蒸馏水1l，ph自然；

溶壁酶购于广东微生物研究所。

主要仪器：

sw-cj-1fb型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司；

灭菌锅：上海三申；

冷冻离心机：sigma3k30；

显微镜：olympuscx23。

实施例1：金针菇‘农金7号’单核体获得

金针菇‘农金7号’是由福建农林大学菌物研究中心团队选育，并于2016年获得福建省农作物品种审定委员会认定，认定编号：闽认菌2016003。

将金针菇‘农金7号’在pda培养基上活化2次，于25℃恒温生化培养箱培养5d；

将活化好的‘农金7号’接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，25℃恒温、静置培养4d；

在超净工作台中，挑取新鲜菌丝于无菌的1.5ml离心管，加1ml灭菌过的0.5mol/l的kcl，8000rpm/min离心10min，弃上清，重复1次；

加入1ml含2wt.%溶壁酶的0.5mol/l的kcl，30℃水浴酶解1.5h；

将酶解好的菌丝液用带棉塞的注射器过滤到1.5ml离心管，5000rpm/min离心10min，弃上清保留沉淀；

吸取1ml0.6mol/l甘露醇悬浮沉淀，5000rpm/min离心10min，弃上清保留沉淀；

吸取0.8ml0.6mol/l甘露醇溶解沉淀，取50ul镜检，根据原生质体量稀释至一个视野下2～3个原生质体；

吸取150ul稀释液涂布于再生培养基，25℃培养，2d观察原生质体萌发情况；

原生质体萌发后在显微镜下将其挑起于新的pda培养基，25℃恒温培养；

待菌落长至约3cm时，取前端菌块镜检，观察其菌丝是否出现锁状联合，保留无锁状联合的再生菌株，即为‘农金7号’的单核化菌株；

选取长势较好的‘农金7号’单核化菌株1个，标记为‘fnj7d-1’，余下无锁状联合的‘农金7号’单核化菌株与‘fnj7d-1’在pda培养基上进行配对，待两个单核化菌株的菌丝接触5d后，取两菌块交接处的菌丝，观察锁状联合，若出现锁状联合，表示与‘fnj7d-1’发生亲和反应，则这个单核化菌株标记为‘fnj7d-2’，若无锁状联合出现，则这个单核化菌株的交配型同‘fnj7d-1’。

实施例2：金针菇‘农金7号’重生菌株获得，包括以下步骤：

从保藏库中取出金针菇‘农金7号’菌株，转接于pda培养基上，25℃培养6d。

从保藏库中取出金针菇‘农金7号’的单核化菌株‘fnj7d-1’，转接于pda培养基上，25℃培养6d。

取一块新鲜的‘农金7号’菌块于直径9cm含pda培养基的平皿，放置于正中央位置，同时取一块新鲜的‘农金7号’单核化菌株‘fnj7d-1’放于平皿正中央另一侧，离‘农金7号’菌块约1.5cm，正面放置于25℃恒温生化培养箱。

待两菌丝接触后，继续培养4d，在无菌操作下，从‘fnj7d-1’一侧的边缘取菌块于新的pda培养基，标记为‘nj7-1’，25℃恒温培养4d。

‘nj7-1’扩大培养后，取其边缘的菌块，在显微镜下进行锁状联合观察，则可以看到其菌丝较多的锁状联合，此‘nj7-1’即为‘农金7号’重生的菌株。

实施例3：金针菇‘农金7号’重生菌株出菇试验，包括以下步骤：

‘农金7号’重生的菌株‘nj7-1’在pda培养基上扩大培养，进行原种制作，原种长好后转接于常规培养基进行栽培试验，栽培采用工厂化菌袋栽培，出菇时采用再生法进行出菇。原种制作的培养基配方、菌种培养，栽培时的培养基配方、发菌管理技术、出菇管理技术等参见黄年来等主编的《中国食药用菌学》第四十五章金针菇篇。（黄年来，林志彬，陈国良，2010．金针菇．中国食药用菌学．上海：上海科学技术出版社.）

重生后的‘农金7号’菌丝活力高，在栽培料上，菌丝洁白、粗壮，发菌快（图2），满袋时间为29～31d；低温刺激后原基易形成，再生后的子实体生长健壮（图3），整个生长周期稳定，维持在75～80d，子实体性状未见改变（图4），产量也高（图5）。而活力低的‘农金7号’发菌较慢，菌丝不够健壮，满袋时间大于35d；且菌袋表面易长菌皮，低温刺激后难出现原基（图6），严重的则原基无法形成，导致长不出子实体，即菌袋表面只有菌皮，即使后期能形成原基，其原基量少，产生的子实体少（图7），产量自然也低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。