本发明涉及一种酶活力的检测方法，尤其涉及羧酸酯酶活力的检测方法，属于羧酸酯酶活力的检测领域。
背景技术：
羧酸酯酶(carboxylesterase，ces)是一类重要的ⅰ相药物代谢酶，参与许多临床抗癌药物、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类杀虫剂、环境中有毒物质以及前致癌物的体内代谢。
在羧酸酯酶的应用实践中常常涉及到检测其酶活力，目前羧酸酯酶活力的检测方法主要如下：
1)称取对硝基苯酚乙酸酯11mg，溶于1ml的无水甲醇，完全溶解后，取400μl的对硝基苯酚乙酸酯溶液加入到9.6ml的ph8.050mmtris-hcl缓冲液，制备底物溶液(冰上操作，减少底物自然水解)；
2)用移液枪分别吸取2ml的底物溶液，分别加入到4根干燥的小试管中，其中一管作为空白对照，另外三管作为待测样品；
3)空白对照管加入100μl的ph8.050mmtris-hcl缓冲液，40℃恒温水浴，开始计时；
4)每间隔30s，取100μl稀释后的酶液加入底物溶液中，40℃恒温水浴，重复操作，直至全部加完；
5)计时3min时，将空白对照转移到比色皿，405nm标定吸光值，每间隔30s依次测定待测样品的吸光值，并记录。
由于酯类会自然水解，酶活测定过程中，需要严格控制反应时间，间隔时间，瞬间稳定读取od值。
上述的酶活测定过程中，由于对硝基苯酚乙酸酯在ph8.050mmtris-hcl缓冲液特别容易水解，酶活检测误差较大，有待改进。
技术实现要素：
本发明的主要目的是提供一种新的羧酸酯酶活力的检测方法，该检测方法od值读数稳定并且读数平行性较好，酶活检测误差小。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种羧酸酯酶活力的检测方法，包括：1)制备硝基苯酚乙酸酯底物溶液；2)分别吸取tris-hcl缓冲液分别加入到四个试管中；其中一管作为空白对照，另外三管作为待测样品；3)空白对照管加入tris-hcl缓冲液，其它三根试管中分别加入待测酶液；恒温水浴，开始计时；4)每间隔30s，每根试管中加入底物溶液，恒温水浴；5)计时3min时，405nm标定吸光值，每间隔30s依次测定待测样品的吸光值并记录，根据吸光值数据计算羧酸酯酶活力；其特征在于：步骤5)中在计时3min时，用预冷的纯净水作为终止液暂停反应。
优选的，步骤5)中在计时3min时，用2ml预冷的纯净水作为终止液暂停反应。
优选的，步骤1)所述的硝基苯酚乙酸酯底物溶液制备包括：称取对硝基苯酚乙酸酯50mg，溶于1ml的无水甲醇，混匀至完全溶解即为底物溶液。
优选的，步骤2)中用移液枪分别吸取885μlph8.050mmtris-hcl缓冲液，分别加入到4根干燥的小试管中。
优选的，步骤3)中空白对照管加入100μl的ph8.050mmtris-hcl缓冲液，其它三根试管中分别加入100μl待测酶液；40℃恒温水浴。
优选的，步骤4)中每间隔30s，每根试管中加入15μl底物溶液，40℃恒温水浴。
现有的羧酸酯酶酶活力测定过程中，由于对硝基苯酚乙酸酯在ph8.050mmtris-hcl缓冲液特别容易水解，并且酶活检测过程中没有终止剂，酶活检测误差较大；本发明发现，在计时3min时，加入2ml预冷的纯净水作为终止液暂停反应，低温抑制酶活性，底物对硝基苯酚乙酸酯在纯水中基本不自然水解，od值读数稳定并且读数平行性较好，酶活测定非常准确，误差小。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
菊酯酶活力定义：对硝基苯酚乙酸酯在酯酶的水解作用下生成黄色的对硝基苯酚。用分光光度计于405nm时测定对硝基苯酚生成量，即可对酯酶酶活性进行测定。1单位的酯酶的活性(u)为ph6.5，40℃时，每分钟催化生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量。
菊酯酶酶活计算公式：
实施例1羧酸酯酶酶活的检测
1)制备底物溶液：称取对硝基苯酚乙酸酯50mg，溶于1ml的无水甲醇，混匀至完全溶解即为底物溶液。
2)用移液枪分别吸取885μlph8.050mmtris-hcl缓冲液，分别加入到4根干燥的小试管中，其中一管作为空白对照，另外三管作为待测样品。
3)空白对照管加入100μl的ph8.050mmtris-hcl缓冲液，其他三根试管中分别加入100μl待测酶液。40℃恒温水浴，开始计时；
4)每间隔30s，每根试管中加入15μl底物溶液，40℃恒温水浴。
5)计时3min时，用2ml预冷的纯净水暂停反应，405nm标定吸光值，每间隔30s依次测定待测样品的吸光值，并记录。注意：由于酯类会自然水解，酶活测定过程中，需要严格控制反应时间，间隔时间，瞬间稳定读取od值。
检测结果见表1。
对比实施例1
1)称取对硝基苯酚乙酸酯11mg，溶于1ml的无水甲醇，完全溶解后，取400μl的对硝基苯酚乙酸酯溶液加入到9.6ml的ph8.050mmtris-hcl缓冲液，制备底物溶液(冰上操作，减少底物自然水解)。
2)用移液枪分别吸取2ml的底物溶液，分别加入到4根干燥的小试管中，其中一管作为空白对照，另外三管作为待测样品。
3)空白对照管加入100μl的ph8.050mmtris-hcl缓冲液，40℃恒温水浴，开始计时；
4)每间隔30s，取100μl稀释后的酶液加入底物溶液中，40℃恒温水浴，重复操作，直至全部加完；
5)计时3min时，将空白对照转移到比色皿，405nm标定吸光值，每间隔30s依次测定待测样品的吸光值，并记录。注意：由于酯类会自然水解，酶活测定过程中，需要严格控制反应时间，间隔时间，瞬间稳定读取od值。
检测结果见表1。
表1羧酸酯酶酶活的不同检测方法的检测结果
根据检测结果可见，对比实施例1的检测方法中由于对硝基苯酚乙酸酯在ph8.050mmtris-hcl缓冲液特别容易水解，并且酶活检测过程中没有终止剂，酶活检测误差较大；实施例1的检测方法中在计时3min时，加入2ml预冷的纯净水作为终止液暂停反应，低温抑制酶活性，底物对硝基苯酚乙酸酯在纯水中基本不自然水解，od值读数稳定并且读数平行性较好，酶活测定非常准确，误差小。