本发明涉及食品检测技术领域，具体为一种大肠菌群计数的检测方法。
背景技术：
大肠菌群是一群在37℃、24h能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌。这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，但动物(包括人类)的排泄物是其主要来源，且与肠道病原菌的生活能力接近，我国和世界其他各国广泛地采用其作为饮用水受粪便污染的指标，推断有无肠道致病菌污染的可能，评价其卫生质量。
目前，普遍采用的大肠菌群的检测方法为多管发酵法和平板计数法，两种方法均为食品安全国家标准，但由于其检测时间长(72h-96h)，而影响了其在食品和食品相关领域的应用，尤其是在餐饮环节，样品保质期普遍较短，一到两天，无法在样品保质期内出具检测结果。在检测工作中迫切需要能够快速检测到大肠菌群数的检测方法，尽可能的缩短其检测时间，具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种大肠菌群计数的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种大肠菌群计数的检测方法，包括以下步骤：
a、样品的稀释：
a、固体和半固体样品:称取10g样品,放入盛有90ml生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min-10000r/min均质1min-2min,或放入盛有90ml生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min-2min,制成1∶10的样品匀液；
b、液体样品:以无菌吸管吸取10ml样品置盛有90ml生理盐水的无菌锥形瓶，瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠；或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液；
c、样品匀液的ph在6.5-7.5之间,必要时分别用1mol/lnaoh或1mol/lhcl调节；
d、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1ml,沿管壁缓缓注入9ml生理盐水的无菌试管中,振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液；
e、根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液，每递增稀释1次,换用1支1ml无菌吸管或吸头，从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程小于15min；
b、发酵试验：每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液,每个稀释度接种3管伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管,每管接种1ml,在35℃-37℃温度下培养22h-26h,观察试管内是否有沉淀生成，倒管内是否有气泡产生，未产气或未生成沉淀者为大肠菌群阴性，生成沉淀并产气者,计为大肠菌群阳性管；
c、大肠菌群最可能数的报告：按步骤b检出的大肠菌群阳性管数,检索mpn表,报告每g(ml)样品中大肠菌群的mpn值。
优选的，所述步骤b中伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管内包括蛋白胨20g、胆盐5g、煌绿0.0135g、伊红0.4g、美蓝0.065g、蒸馏水1000ml，该伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管在121℃温度下高压蒸汽灭菌15min。
优选的，所述生理盐水制备方法：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明操作简单，利用大肠菌群可以发酵乳糖，产酸、产气的原理，在发酵管内添加抑制革兰氏阳性菌的抑菌剂等，无需复发酵的确证实验，在24小时内确定大肠菌群的数量，检测精度高。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明提供如下技术方案：一种大肠菌群计数的检测方法，包括以下步骤：
a、样品的稀释：
a、固体和半固体样品:称取10g样品,放入盛有90ml生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min均质1min,或放入盛有90ml生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min,制成1∶10的样品匀液；
b、液体样品:以无菌吸管吸取10ml样品置盛有90ml生理盐水的无菌锥形瓶，瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠；或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液；
c、样品匀液的ph在6.5-7.5之间,必要时分别用1mol/lnaoh或1mol/lhcl调节；
d、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1ml,沿管壁缓缓注入9ml生理盐水的无菌试管中,振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液；
e、根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液，每递增稀释1次,换用1支1ml无菌吸管或吸头，从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程小于15min；
b、发酵试验：每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液,每个稀释度接种3管伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管,每管接种1ml,在35℃温度下培养22h,观察试管内是否有沉淀生成，倒管内是否有气泡产生，未产气或未生成沉淀者为大肠菌群阴性，生成沉淀并产气者,计为大肠菌群阳性管；
c、大肠菌群最可能数的报告：按步骤b检出的大肠菌群阳性管数,检索mpn表,报告每g(ml)样品中大肠菌群的mpn值。
其中，步骤b中伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管内包括蛋白胨20g、胆盐5g、煌绿0.0135g、伊红0.4g、美蓝0.065g、蒸馏水1000ml，该伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管在121℃温度下高压蒸汽灭菌15min。
生理盐水制备方法：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
实施例二：
一种大肠菌群计数的检测方法，包括以下步骤：
a、样品的稀释：
a、固体和半固体样品:称取10g样品,放入盛有90ml生理盐水的无菌均质杯内,10000r/min均质2min,或放入盛有90ml生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打2min,制成1∶10的样品匀液；
b、液体样品:以无菌吸管吸取10ml样品置盛有90ml生理盐水的无菌锥形瓶，瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠；或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液；
c、样品匀液的ph在6.5-7.5之间,必要时分别用1mol/lnaoh或1mol/lhcl调节；
d、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1ml,沿管壁缓缓注入9ml生理盐水的无菌试管中,振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液；
e、根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液，每递增稀释1次,换用1支1ml无菌吸管或吸头，从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程小于15min；
b、发酵试验：每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液,每个稀释度接种3管伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管,每管接种1ml,在37℃温度下培养26h,观察试管内是否有沉淀生成，倒管内是否有气泡产生，未产气或未生成沉淀者为大肠菌群阴性，生成沉淀并产气者,计为大肠菌群阳性管；
c、大肠菌群最可能数的报告：按步骤b检出的大肠菌群阳性管数,检索mpn表,报告每g(ml)样品中大肠菌群的mpn值。
其中，步骤b中伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管内包括蛋白胨20g、胆盐5g、煌绿0.0135g、伊红0.4g、美蓝0.065g、蒸馏水1000ml，该伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管在121℃温度下高压蒸汽灭菌15min。
生理盐水制备方法：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
实施例三：
一种大肠菌群计数的检测方法，包括以下步骤：
a、样品的稀释：
a、固体和半固体样品:称取10g样品,放入盛有90ml生理盐水的无菌均质杯内,9000r/min均质1.5min,或放入盛有90ml生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1.5min,制成1∶10的样品匀液；
b、液体样品:以无菌吸管吸取10ml样品置盛有90ml生理盐水的无菌锥形瓶，瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠；或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液；
c、样品匀液的ph在6.5-7.5之间,必要时分别用1mol/lnaoh或1mol/lhcl调节；
d、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1ml,沿管壁缓缓注入9ml生理盐水的无菌试管中,振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液；
e、根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液，每递增稀释1次,换用1支1ml无菌吸管或吸头，从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程小于15min；
b、发酵试验：每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液,每个稀释度接种3管伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管,每管接种1ml,在36℃温度下培养24h,观察试管内是否有沉淀生成，倒管内是否有气泡产生，未产气或未生成沉淀者为大肠菌群阴性，生成沉淀并产气者,计为大肠菌群阳性管；
c、大肠菌群最可能数的报告：按步骤b检出的大肠菌群阳性管数,检索mpn表,报告每g(ml)样品中大肠菌群的mpn值。
其中，步骤b中伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管内包括蛋白胨20g、胆盐5g、煌绿0.0135g、伊红0.4g、美蓝0.065g、蒸馏水1000ml，该伊红美蓝煌绿胆盐乳糖发酵管在121℃温度下高压蒸汽灭菌15min。
生理盐水制备方法：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
本发明操作简单，利用大肠菌群可以发酵乳糖，产酸、产气的原理，在发酵管内添加抑制革兰氏阳性菌的抑菌剂等，无需复发酵的确证实验，在24小时内确定大肠菌群的数量，检测精度高。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。