相关申请的交叉引用本申请要求于2018年7月13日提交的标题为“驱动所需基因表达的质粒成瘾系统”的美国临时专利申请号62/697531以及于2017年7月21日提交的标题为“驱动所需基因表达的质粒成瘾系统”的美国临时专利申请号62/535596的优先权，两者的公开内容在此通过引用整体并入。本发明的领域涉及用于使用琥珀酸途径的基因在微生物生产菌株中维持目标染色体外元件以确保子细胞中元件的包含和表达的方法和工艺。更具体地，本发明涉及质粒成瘾系统的用途，该系统确保修饰的微生物细胞将维持携带涉及产生所需表达产物的基因的质粒。
背景技术：
：：本发明涉及一种操纵培养中的微生物细胞以维持至少一种含有至少一种目标基因的目标染色体外元件的方法。通常，该染色体外元件是质粒，尽管噬菌体、原噬菌体、噬菌粒、粘粒、细菌人工染色体(bac)也含有染色体外元件以含有异源目标转基因。尽管天然存在于细菌中，但并非所有野生型质粒都含有在正常条件下维持宿主细胞活力所需的遗传信息。然而，质粒可以含有遗传信息，该遗传信息可在特定的环境挑战(例如抗生素抗性或对环境中存在的有害化合物的抗性)下为宿主提供选择性优势。然而，在不存在不利环境条件的那些情况下，质粒的存在实际上是细胞的代谢负担(nordstrom和austin，1989)。换句话说，相对于那些不携带所述质粒的细胞，维持质粒所需的代谢活性对宿主细胞产生了很小但真实的代谢成本。这种代谢负担就是为什么如果它们可以继续存在或可没有它而繁殖，随着时间许多子细胞容易“丢失”目标质粒。这种丢失或染色体外元件复制受限的过程还在那些需要存在质粒遗传组分以产生目标产物的实验中导致效率降低，因此用大量不含有目标质粒的子细胞进行培养为进行中的实验提供了降低的效率。在那些依赖于规模经济和目标分子的持续产生来确定其成本目标的发酵实验中，这尤其严重。缺乏所需质粒或染色体外元件的子细胞在整个生产中代表了培养基和能量汇，并有助于发酵成本的经济利益。在生物技术工业中，质粒和类似的染色体外元件已成为微生物基因工程、目标蛋白表达和商业合成生物学中非常重要的工具。可以操纵和设计这样的元件以迫使宿主细胞带它们向前或灭亡(balbas2001；baba2006)。从这个意义上讲，尽管随之而来的代谢负担，细胞仍不可逆转地“成瘾”于维持细胞中的染色体外元件(因此称为“质粒成瘾系统”或“pas”)。有了这样的系统，研究人员就可以专注于驱动宿主细胞培养以不仅维持和表达pas系统基因，而且表达含在这种染色体外元件上的所有基因。根据本发明，这可能需要在微生物系统中表达许多目标基因和潜在的基因产物。质粒成瘾系统和替代品鉴于此类技术可以驱动目标蛋白的表达，已开发了各种方法来确保质粒在细胞中的稳定维持是不足为奇的(nordstrom和austin，1989)。这包括：(i)作为用于高拷贝质粒系统的质粒维持系统起作用的位点特异性重组系统(grindley等人，2006)；(ii)主动分配系统(funnell和slavcev，2004年)；以及如上所述，(iii)阻止了不含和不表达目标质粒基因的细胞的持续存活/复制的类似于本文所提供发明的质粒成瘾系统(pas)(gerdes等人，2005)。位点特异性重组控制系统位点特异性重组是一种遗传重组，其中在具有至少一定程度的序列同源性的区段之间发生dna链交换。在该系统中，位点特异性重组酶(ssr)通过识别并结合短dna序列(位点)来进行dna区段的重排，在该序列处它们切割dna主链，交换涉及的两个dna螺旋，然后重新加入dna链(datsenko和wanner，2000年)。尽管在某些位点特异性重组系统中，仅一个重组酶和相应的重组位点就足以进行所有这些反应，在其它系统中，还需要许多辅助蛋白和/或辅助位点-每次添加都会增加复杂性，从而降低该系统的可靠性和通用性(baba等人，2006)。另外，所需重组酶的组成型表达也可能导致不希望的基因型改变，就重组酶基因向子代的转移而言，在系统的最初开发方面的使用可能会具有挑战性。质粒不稳定性如上所述，由于维持质粒本身和表达其中所含基因的持续代谢负担，微生物容易消除质粒或限制质粒在细胞中的繁殖(rosano等人，2014)。另外，当所讨论的质粒可以含有基因时，细胞可能不支持质粒复制和表达，当表达时，在细胞或其细胞的直接环境中产生有毒产物。当然，那些利用这种微生物系统的人的目标是维持工程化的遗传改变以及随之而来的插入基因的表达。从这个意义上讲，质粒和宿主的稳定遗传通常要求：(1)质粒必须每代复制一次；(2)在细胞分裂之前必须迅速纠正拷贝数偏差；以及(3)细胞分裂后，必须以可靠且一致的方式将质粒复制的产物分配给两个子细胞(balbas等人，1986)。通常，细菌中低拷贝数质粒的稳定维持由分配机制主动驱动，所述分配机制负责在复制前将质粒定位在细胞内。各种这样的分配系统在微生物界是普遍存在的，并且由许多细菌染色体以及质粒编码。这些系统尽管在序列和机制上不同，但通常由两个蛋白和所讨论质粒上的一个dna分配位点或原核着丝粒组成。一种蛋白与着丝粒结合以形成分配复合物，另一种蛋白根据需要使用核苷酸结合和水解的能量转运质粒。对于质粒，这个最小的盒足以进行适当的分离。在最佳设置中，选择携带目标质粒的菌株将具有提供或一致且可靠质粒复制的分配系统(balbas等人，1986；rawlings1999)。工程化质粒稳定系统存在经工程化以稳定维持目标质粒的系统。一种特别常见的系统是使用抗生素作为选择工具。在这样的系统中，目标质粒中的抗生素抗性基因可以保护携带它的细胞，同时当细菌细胞在富含相应抗生素的培养基中生长时，该基因可以有效地“迫使”细胞维持它(cranenburgh，r.m等人，2001)。然而，这种方法受到许多困难和关注。抗生素抗性方法价格昂贵，需要使用昂贵的抗生素，有些人可能会认为它是一种令人反感的培养方法，因为当用于工业生产方法时，这种方法可能会加速和/或扩散可能负面影响人类和/或动物种群的细菌抗生素抗性的发展。而且，在大规模生产应用中，抗生素的使用可能施加其它限制。关于商业生物反应器，抗生素抗性机制可以降解抗生素本身，并允许大量的无质粒细胞在培养物中持续存在。这种无质粒细胞是无效的，并且降低生物反应器的总产量，从而增加成本并降低效率(balbas2001；baba2006)。分离质粒维持功能稳定的较低拷贝数的质粒通常具有分配功能，该功能主动在子细胞之间分配质粒拷贝。分配机制的示例包括：psc101、f因子、p1原噬菌体和incfii抗药质粒。这些功能在复制期间起到物理分离质粒的作用。就功能而言，许多小质粒依赖于分配在整个细胞中的高拷贝数以确保分裂时由每个子细胞维持至少一个拷贝。另一方面，许多大的、低拷贝数的质粒编码主动分离系统以避免随机丢失。存在各种分配系统，但大多数依赖于三个组件：着丝粒dna区域、细胞动力丝和连接两者的衔接蛋白。在ii型分离中，细菌肌动蛋白样蛋白(alp)动力丝驱动质粒分离(balbas等人，2001；balbas1986；schumacher2014)。分离后杀死(psk)功能天然存在的psk质粒维持功能通常采用两组分毒素-抗毒素系统，并且通常如下运行：质粒编码毒素和抗毒素。抗毒素没有毒素稳定，该毒素往往是很稳定的。在无质粒子细胞中，不再产生毒素和抗毒素。然而，不稳定的抗毒素会迅速降解，从而释放出毒素以杀死周围区域的细胞，而不存在抗毒素(gerdes1990)。该毒素通常是小蛋白，该抗毒素是小蛋白或反义rna，它们与编码毒素的mrna结合而阻止其合成(例如：反义系统，如hok-sok)。在反义维持系统中，该抗毒素是抑制毒素编码mrna翻译的反义rna。像抗毒素肽一样，反义rna的稳定性没有编码毒素的mrna稳定。质粒的丢失允许现有的抗毒素降解，从而允许合成杀死宿主细胞的毒素。hok-sok系统的限制是当hok-sok系统被hok开放阅读框内的突变灭活时，会产生大量的无质粒细胞(gerdes1990)。平衡致死系统在平衡致死系统(psk功能)中，编码必需结构蛋白或酶的染色体基因从细菌染色体上缺失或发生突变，使得该基因不再起作用(fu.,2000)。然后将除去或受损的基因替换为包含完全操作基因的质粒。质粒的丢失导致必需蛋白的不足和无质粒细胞的死亡。基于催化酶生产的平衡致死系统存在许多缺陷。特别地，由于染色体基因缺失的互补仅需要单个基因拷贝，因此天生地难以维持多于几个拷贝的表达质粒。质粒较少的宿主菌株必须在特殊培养基上生长以化学补充现有的代谢缺陷(fu2000)。商业努力与需要生物技术生产过程通常在成熟的原核和真核宿主中用基于质粒的表达系统进行操作，例如分别为大肠杆菌或酿酒酵母。基因工程生物可产生重要的化学物质、生物聚合物、生物燃料和胰岛素等高价值蛋白。在这些生物过程中，重组宿主中的质粒对生产率具有重要影响(krollj.，2010)。无质粒细胞会导致整个产品回收的损失，并降低整个过程的利润率(表1)。通常，在工业发酵中使用抗生素不是维持质粒稳定性的可用或理想的选择。特别是在基于药物或gmp的发酵过程中，必须灭活并除去已部署的抗生素。如上所述，它们也很昂贵。文献中已经描述了几种质粒成瘾系统(pas)，并在上面进行了引用。当前的pas提供了一种新型方法，该方法是无抗生素的，仍然是细胞复制和稳定所绝对必需的，并允许在培养物中有效地维持多个携带基因的质粒等。鉴于以上，在本领域中仍然需要一种新型pas，其依赖于平衡致死系统，不需要抗生素对工业有用，并且可以以商业上有效的方式驱动大量目标化合物的生产。技术实现要素：本发明包括设计质粒成瘾系统的改进方法，该系统可以增强目标蛋白的产量并以商业规模如此进行。根据当前发明，提供了一种用于在微生物系统中产生一种或多种目标蛋白的生物合成方法。通过细菌培养获得携带目标基因的重组质粒。为了选择细菌转化体，并且为了确保质粒在细菌宿主细胞中的维持，传统上在质粒主链中包括抗生素抗性基因。质粒的选择是通过使细胞在含有相应抗生素的培养基中生长而实现的，其中只有带有质粒的细胞才能生长，通常包括标记基因。已经存在许多质粒成瘾系统(pas)，主要是作为毒素-抗毒素系统，其将质粒限制为单拷贝或旨在用于开放环境(例如生物修复环境)中。然而，很少存在基于营养的质粒成瘾系统的示例，或在工业环境中表现出长期稳定性的示例。本发明提供了两者。根据本发明的利用琥珀酸途径作为条件突变体的质粒成瘾系统，其中关键染色体基因已被除去并置于质粒中以在子细胞中表达和维持。这样的系统可以用于产生特异性的淀粉酶、途径基因、脂肪酶、蛋白酶、维生素或抗生素，并且根据当前发明，可以被迫维持多达四个不同的质粒。根据本发明的优选实施方式，本申请人提供了基于双突变体sucad或四突变体sucabcd的合成致死缺失的质粒成瘾系统，其中天然突变在一种或多种质粒上互补。目标质粒无需补充dap或任何其它中间体即可实现接近野生型的生长，并且在没有选择标记的情况下可以保留许多代。它在实验室环境中很有用，因为在没有任何额外补充下转化体可以在lb板上生长；在不补充dap下亲本菌株无法生长。其中既不需要也不希望使用抗生素或其必需的选择标记基因在工业环境中很有用。鉴于最多包括四个必需基因，这意味着可以将不同组成的四种质粒保留在目标发酵中，且成本较低。也就是说，可以用单个目标基因或多达四个不同的质粒类型来维持单种质粒，每种质粒具有四个必需基因之一，携带其它目标基因可以在当前系统中有效且低成本地提供。附图说明图1a-1b.显示了大肠杆菌中枢代谢和细胞壁生物合成背景下的琥珀酸酯和琥珀酰辅酶a(图1a和1b)。图2a-2c.显示了多个缺失sucad(图2b)和sucabcd(图2c)，它们在大肠杆菌染色体中是合成致命性的。本发明天然大肠杆菌菌株-bw25113及其琥珀酰辅酶a操纵子的基因组背景示于图2a；图2b提供大肠杆菌bw25113δsucad的基因组背景的示意图；图2c提供大肠杆菌bw25113δsucabcd的基因组背景的示意图。图3a-3e.显示了设计用于表达sucab和sucabcd互补体而不是抗生素抗性标记的pdvs和pdvq质粒、克隆载体的质粒图谱。pdvk-sucad(图3a)；pdvk-sucabcd(图3b)；pdvs-kan缺失(图3c)和pdvq-kan-缺失(图3d)；pdvk-sucbc(图3e)。图4a-4b.显示了琥珀酸途径敲除突变体例如bw25113δsucad(图4a)和bw25113δsucabcd(图4b)不能在丰富的发酵培养基上生长。图5.相关细胞在非选择性培养基上的生长曲线。显示了双敲除或四敲除的互补之间的差异。图6a-6b.经工程化以表达gfp的琥珀酸成瘾载体的质粒图谱，dvp-a8-skb-sfgfp(图6a)和pdvq-gfp(图6b)。图7.显示了根据本发明的经转化细胞系统的gfp的生产水平。图8.显示了补板表明系统保留了两种质粒。具体实施方式以下缩写在说明书中具有指定的含义：术语解释：细胞系统是提供异位蛋白表达的任何细胞。它包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。它包括原核细胞和真核细胞。它还包括基于细胞组分(例如核糖体)的蛋白的体外表达。使细胞系统生长。生长包括提供适当的培养基，该培养基将在琥珀酸途径发生变化的情况下使细胞繁殖和分裂。它还包括提供资源以便细胞或细胞组分可以翻译并制备重组蛋白。根据当前发明，细胞在lb培养基上生长。除非为这些细胞提供了120μmdap，否则它们不会生长。蛋白表达。必要的基因表达后可能会产生蛋白。它由将dna转录成信使rna(mrna)之后的阶段组成。然后将mrna翻译成多肽链，最终将其折叠成蛋白。dna通过转染(有意将核酸引入到细胞中的过程)而存在于细胞中。该术语通常用于真核细胞中的非病毒方法。它也可以是指其它方法和细胞类型，但优选其它术语：“转化”更常用于描述细菌、非动物真核细胞(包括植物细胞)中非病毒dna的转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转化也用于指这些细胞中进展为癌态(致癌)。转导通常用于描述病毒介导的dna转移。对于该应用，转化、转导和病毒感染包括在转染的定义下。缩略语：tca–三羧酸dap–二氨基庚二酸pas–质粒成瘾系统tb–terrific肉汤lb–luria肉汤y(e)pd–酵母提取物蛋白胨葡萄糖(培养基)suca–大肠杆菌基因编码2-氧戊二酸脱氢酶的e1组分sucb–大肠杆菌基因编码2-氧戊二酸脱氢酶的e2组分succ–大肠杆菌基因编码琥珀酰辅酶a合成酶的β亚基sucd–大肠杆菌基因编码琥珀酰辅酶a合成酶的α亚基替代标记基因如果当前发明的一个或多个基因需要标记基因，则示例包括：编码限制性核酸酶的基因(例如cviaii，源自小球藻(chlorella)病毒pbcv-1的限制性核酸内切酶(zhang等人，1992)；ecori(torres等人，2000))，编码与蛋白相互作用的毒素的基因(例如如szafransky等人，1997；kaplan等人，1999；sano等人，1995所述的链霉亲和素或stv13(截短的、易溶的链霉亲和素变体)，其通过剥夺细胞生长中必需的蛋白生物素来发挥作用)；编码破坏膜蛋白的基因(φx174的e基因蛋白(ronchel等人，1998；haidinger等人，2002)、gef(jensen等人，1993；klemm等人，1995)、relf(knudsen等人，1995))；编码其它细菌毒素的基因(例如ccdb基因(bernard和couturier，1992)，该基因编码来自捕获dna促旋酶的f质粒的有效细胞杀伤蛋白或来自枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的sacb(gay等人，1983)；或编码对细菌宿主有毒的真核毒素的基因(例如fus；crozat等人，1993)。当使用有毒基因时，至关重要的是它们的表达可以被诱导型启动子调节。该启动子在没有诱导剂下必须是无活性的，而应在诱导后提供足以抑制细胞生长的表达。在某些实施方式中，该标记基因选自编码限制性核酸酶、链霉亲和素的基因或具有间接毒性作用的基因，例如sacb，如上所述。抑制子是与位于操纵子的启动子内的操纵基因结合的蛋白，从而下调位于所述操纵子内的基因的转录。适用于本发明抑制子的示例是四环素抑制子(tet)蛋白tetr(其调节革兰氏阴性细菌中四环素抗性决定簇家族的转录并与四环素结合(williams等人，1998；beck等人，1982；postle等人，1984))、色氨酸抑制子(trp)(其与含有色氨酸生物合成基因的trp操纵子的操纵基因结合)。诱导型启动子的示例是其中转录是在添加物质后开始的，因此可被环境调节的启动子(例如lac启动子)，该启动子是由iptg(jacob和monod，1961)诱导的，由阿拉伯糖诱导的阿拉伯糖启动子(pbad)(guzman等人，1995)，铜诱导的启动子(rouch和brown，1997)和cumate诱导启动子(choi等人2010)。可替代地，可以使用组成型启动子，其中无论生长期或环境变量如何，始终驱动所需转基因的转录。在另一个实施方式中，可以通过使用标记基因作为报告基因来监测单个目标基因的表达。可用于提供此功能的基因包括编码gfp(绿色荧光蛋白)、hsod(人超氧化物歧化酶)、lacz(β-葡萄糖苷酶)、cat(氯霉素乙酰基转移酶)、nptii(新霉素磷酸转移酶)或萤光素酶的基因。每当需要关于宿主细胞中质粒存在与否或质粒拷贝数的信息时，该报告基因在培养过程中均有用。当要优化发酵过程以控制质粒拷贝数时，此类信息特别有用。报告基因也可以用作毒性标记基因的替代物，因此可以用于实验环境中，该实验环境旨在证明构建体用于基因调节或沉默并确定其对毒性标记基因作用的功能。在本发明的某些实施方式中，该标记基因可以是内源宿主基因，其可以是旨在被调控的任何目标基因。在这种情况下，对宿主细胞进行工程化，使得编码该序列的序列与相关的宿主基因可操作地结合。尽管本公开易于进行各种修改和替代形式，但是其特定实施方式在附图中以示例的方式示出并且将在本文中进行详细描述。然而，应理解的是，本文所呈现的附图和详细描述并非旨在将本公开限制为所公开的特定实施方式，但是相反地，其目的是覆盖落入由所附权利要求书限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。参考附图，在本发明优选实施方式的以下详细描述中，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。本发明涉及一种用于微生物系统中目标蛋白的改进生产方法的系统，该系统不需要标记、抗生素并且可以高水平地生产目标蛋白。细菌菌株和生长条件bw25113和δsuca::kanr和δsucd::kanr的缺失获自大肠杆菌遗传储备中心(cgsc)。细胞通常在luria肉汤(lb)中生长，但实验也在tb、ypd、yepd、含玉米浆的营养肉汤和其它丰富培养基中进行(miller，1972)。二氨基庚二酸(sigmad1377)以120μm用于辅助筛选，因为δsucad的双重缺失是合成致死的(mattozzi等人，2013；yu等人，2006)。染色体突变菌株的构建p1vir转导(miller，1972)用于产生大肠杆菌bw25113的卡那霉素抗性双敲除菌株并在lb卡那霉素板上用120μmdap进行筛选。通过菌落pcr进行这些δsuca和δsucd缺失的筛选。该kanr供体菌株还用于产生大肠杆菌菌株bl21、bl21(de3)、mg1655、mg1655(de3)δlacy和w3110的双敲除。使用基于plp20/frt的重组酶将质粒pcp20用于除去卡那霉素抗性标记(baba等人，2006；datsenko和wanner，2000)。由于suca和sucd仅相隔6kb，通常在pcp20flp重组酶步骤后将表现出四倍缺失δsucabcd的kan敏感细胞分离(datsenko和wanner，2000)。重组质粒的构建合成了编码suca、sucb、succ和sucd的密码子优化序列(quintarabioworks，加利福尼亚州埃默里维尔)。将cider大肠杆菌模块化克隆(iverson等人，2016)用于产生sucabcd天然操纵子和sucad合成操纵子的版本。两种版本均基于大肠杆菌mg1655天然序列，但在框架内替换了非法的bsai和bpii位点以免影响蛋白序列。进行额外的密码子优化以最小化重组效应。除了缺失了sucb的起始密码子和succ的终止密码子之间的序列，操纵子sucabcd和sucad是相同的(yu等人，2005)。根据当前发明，通过电穿孔将质粒转化到δsucad和δsucabcd菌株中，并在无需任何额外的补充的lb板上选择；在不补充dap下，亲本菌株无法生长。通过序列确认克隆。质粒成瘾菌株的培养带有质粒的大肠杆菌菌株在lb中生长，无需在24孔板和biolector花板中额外添加(funke等人，2009)。本发明可广泛用于最先进的发酵中，用于质粒dna的生产和重组蛋白的生产。已经描述了几种用于pdna发酵的方法，这些方法可用于应用本发明。用于产生质粒dna的方法在施加于细胞的控制水平和影响发酵的多种因子方面有所不同。为了获得更高数量的质粒，可以在所谓的“分批发酵”中在受控发酵罐中培养细胞，其中在开始时提供所有营养，并且在培养期间不添加营养(reinikainen，p.等人；1988)。可用含有所谓的“复杂组分”作为碳源和氮源的培养基进行这种类型的培养，例如o'kennedy等人，2003；lahijani等人，1996；以及wo96/40905，美国专利号5,487,986和wo02/064752中所述的。可替换地，合成培养基可以用于pdna生产，例如定义了专门为生产pdna设计的培养基(wang等人，2001；wo02/064752)。本发明还可以用于大肠杆菌的补料分批发酵中，其中通过补料将一种或多种营养物提供给培养物，通常通过使用通过补料营养的反馈控制算法以便将过程参数控制在定义的设定点。因此，反馈控制与整个发酵过程中的细胞活性直接相关。可用于发酵的反馈控制的控制参数包括ph值，在线测量的细胞密度或溶解氧张力(dot)。在wo99/61633中描述了一种用于通过补料速率将溶解氧张力控制在限定的设定点的反馈算法。可替代地，本发明可以应用于生产质粒dna的方法中，其中大肠杆菌细胞首先在预培养中生长，然后在主培养中发酵，该主培养是包括分批阶段和补料阶段的分批补料过程。对分批阶段的培养基和在进料阶段期间添加的培养基进行化学定义，并且进料阶段的培养基含有限制生长底物，并以遵循预定指数函数的进料速率添加，从而将比生长率控制在预定值。当标记基因处于诱导型启动子的控制下时，可以在开始和/或以脉冲方式(分批和分批补料培养)将诱导剂添加至分批中。在进料阶段期间，可以以脉冲方式或连续地添加诱导剂。发酵过程结束时收获细胞并根据本领域已知的方法分离并纯化质粒dna，例如通过如美国专利号5,981,735中所述的基于阴离子交换和凝胶渗透色谱的方法或通过使用如美国专利号6,197,553中所述的两个色谱步骤，即第一步是阴离子交换色谱法，第二步是反相色谱。wo03/051483中描述了另一种用于制造质粒dna的合适方法，该方法使用两个不同的色谱步骤，并与整体载体(monolithicsupport)结合。除了将本发明应用于质粒生产外，例如为了生产用于基因疗法的质粒，它也可用于重组蛋白的生产(rawlings1999)。关于重组蛋白的生产，原理上，可以使用已证明可用于表达大肠杆菌中目标基因的任何方法，特别是来自cole1型质粒的大肠杆菌(参见综述，例如jonasson等人，2002；balbas，2001)。使用复杂的、合成的或半合成的培养基，可以在细胞内(完全或部分溶解或作为包涵体)或通过分批发酵或优选通过分批补料培养的分泌(进入细胞培养基或周质空间)获得该蛋白。在质粒dna的生产中，通常是用于基因疗法应用的质粒dna，目标基因不在细菌宿主细胞中表达。鉴于其在哺乳动物中的应用，优选在人类中，在最终要表达的地方，目标基因通常与真核启动子可操作地结合。相反地，用于在大肠杆菌中重组生产蛋白，因此，目标基因将在原核启动子的控制下在宿主细胞中表达。用于重组生产蛋白，两个启动子(即控制标记基因的启动子和控制目标基因的启动子)可以不同或相同，只要不发生干扰任一个表达的干预。有利地，由于它们的活性在关于转录的时间点和水平方面彼此独立，因此，启动子受到不同的调节。优选地，控制标记基因的启动子在发酵过程开始时是有活性的，并产生适量的mrna，而目标基因的启动子相当强并且在发酵期间的选定时间点被活化。如果将诱导型启动子用于目标基因和标记基因，通常选择它们使得它们被不同的诱导剂启动。可替代地，标记基因可以在诱导型启动子下，而目标基因在组成型启动子下，反之亦然。如上所述，这既适用于其中将标记基因构建体整合到细菌宿主基因组中的方法，又适用于其中标记基因构建体含在质粒或噬菌体中的方法。关于在发酵的各个阶段中诱导启动子，适用上述质粒dna生产的原理。本发明具有很大的优点，即所有复制的质粒都没有抗生素抗性基因，因此，除了基因疗法应用之外，适用于需要或希望没有抗生素抗性基因的所有应用，例如旨在用于人类和动物食品生产或用于产生重组植物的重组酵母菌株的产生。发酵期间的表达和维持异源dna的维持表现出工业系统中的主要挑战。已经存在许多系统，但是每个系统都有缺点。将基因整合到基因组中可能很慢，需要进行广泛筛选，并且仅限于每个细胞一个拷贝。较大的dna环(像粘粒和细菌人工染色体(bac))可能很难从染色体dna或细胞碎片沉淀中分离出来，并且同样限于拷贝数。噬菌体可能难以保持含在目标细胞类型中。它们可能会意外地分解，从而在工厂规模内造成严重后果。因此，将异源dna引入并维持到大肠杆菌和其它细菌培养物中最常见的方式是通过质粒，其中，目标基因被维持在dna小环上，该小环含有包含复制起点和通常抗生素抗性标记的序列。该标记可能有问题：培养基中的抗生素可能很昂贵，并且会污染具有类似化学性质的最终小分子产品。同样，编码这些标记的基因也带来了生物安全性问题：发酵中所用的抗生素与临床环境中所用的抗生素相同或类似。尽管实验室防护通常是好的，但抗生素抗性基因的大规模使用可能会鼓励例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)等危险抗性细菌的传播。本发明的原理，即琥珀酰辅酶a合成致死缺失的代谢环境如图1所示。在本发明的实施方式中，以下组分是有用的：宿主细胞由于它们的复制取决于宿主机制，因此，许多质粒是宿主范围狭窄的质粒。复制通常限于大肠杆菌和相关细菌，例如沙门氏菌和克雷伯氏菌(kues和stahl，1989)。然而，根据当前发明，各种各样的功能宿主都是可用的，包括真核系统。其它合适的宿主包括：棒杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、弧菌属、伯克霍尔德氏菌属的细胞以及实际上能够稳定地维持异源质粒并具有肽聚糖细胞壁的任何其它细菌。宿主细胞的优选遗传特征是改善质粒稳定性和质量或完整重组蛋白回收的突变。理想的基因缺失的示例为：suca–大肠杆菌基因编码2-氧戊二酸脱氢酶的e1组分sucb–大肠杆菌基因编码2-氧戊二酸脱氢酶的e2组分succ–大肠杆菌基因编码琥珀酰辅酶a合成酶的β亚基sucd–大肠杆菌基因编码琥珀酰辅酶a合成酶的α亚基。该操纵子中的每个基因都编码tca周期内的一部分异二聚酶。由于sucab和succd是合成致死的(yu等人2006)，sucab或succd对可能会被缺失并仍然允许细胞生长；由于细胞无法使用氧气作为末端电子受体，因此可以降低生长速率。这最终会导致细胞死亡、生长速率降低、最大细胞密度降低以及碳源利用效率低下。缺失sucabcd簇中的至少三个基因(或从相反的共轭对中的缺失两个，例如δsucad)产生对琥珀酰辅酶a营养缺陷的细胞。因为琥珀酰辅酶a本身不稳定并且商业上购买昂贵，所以发现在培养基中补充dap可以允许细胞生长。这是因为可以将外部dap掺入到细胞壁中，从而消除了对琥珀酰辅酶a辅因子的需要(图1)。细胞仍然可以生长，但是由于它们不能充分利用氧气作为末端电子受体而具有生长缺陷。用于工程化宿主细胞的构建体适用于工程化宿主细胞的构建体的原理如图2所示：宿主菌株是通过p1转导产生的(上述)，质粒是通过gibson组装、克隆、金门(goldengate)和/或模块克隆产生的。系统质粒的特征需要质粒以表达宿主菌株中特异性缺失的基因。在该示例中，在质粒上表达大肠杆菌sucad和sucabcd的密码子优化版本，分别弥补了bw25113δsucad和δsucabcd的缺失。实施例从大肠杆菌基因组缺失表达三羧酸(tca)循环必需蛋白的两个或者四个关键基因。以前，这些基因已被证明是合成致死的(yu等人，2006)。因此，这些细胞对于琥珀酰辅酶a是营养缺陷的。细胞可以简单地通过发酵生长来满足tca循环的能量需要，但是缺乏完整的tca循环会导致生长效率低下以及有毒发酵副产物乙醇和乙酸盐的积累，因为细胞无法有效地使用氧气作为末端电子受体。这最终会导致细胞死亡、生长速率降低、最大细胞密度降低以及碳源利用效率低下。除tca循环外，琥珀酰辅酶a还用作许多代谢途径中的辅助因子。也许最重要的是赖氨酸合成途径，其中需要琥珀酰辅酶a作为用于产生二氨基庚二酸(dap)的必需辅助因子。dap是胞壁质或肽聚糖细胞壁中的关键单体，因此是生长所必需的。以前，我们利用该事实建立了一个系统(mattozzi等人，2013)作为对碳固定系统的测试。然而，敲除仅用作来自嗜热光全绿丝菌细胞代谢过程的替代物，而不是细胞保留质粒或驱动目标蛋白产生的能力。含有表达琥珀酰辅酶a：(s)-苹果酰辅酶a转移酶操纵子的质粒的双突变δsucad细胞减少，但并未完全消除系统中对dap的需要。细菌菌株和生长条件bw25113和δsuca::kanr和δsucd::kanr的缺失获自耶鲁大学的大肠杆菌遗传储备中心(cgsc)。细胞通常在luria肉汤(lb)中生长，但实验也在tb、ypd、yepd、含玉米浆的营养肉汤和其它丰富培养基中进行(miller，1972)。二氨基庚二酸(sigmad1377)以120μm用于辅助筛选，因为δsuca(b)δsuc(c)d的双重缺失是合成致死的(mattozzi等人，2013；yu等人，2006)。染色体突变菌株的构建p1vir转导(miller，1972)用于产生大肠杆菌bw25113的卡那霉素抗性双敲除菌株并在lb卡那霉素板上用120μmdap进行筛选。通过菌落pcr进行这些δsuca和δsucd缺失的筛选。该kanr供体菌株还用于产生大肠杆菌菌株bl21、bl21(de3)、bl21*(de3)、mg1655、mg1655(de3)δlacy、c41和w3110的双敲除。使用基于plp20/frt的重组酶将质粒pcp20用于除去卡那霉素抗性标记(baba等人，2006；datsenko和wanner，2000)。由于suca和sucd仅相隔6kb，通常在pcp20flp重组酶步骤后将表现出四倍缺失δsucabcd的kan敏感细胞分离(datsenko和wanner，2000)。重组质粒的构建cider大肠杆菌模块化克隆(iverson等人，2016)是一种基于金门(goldengate)的技术，用于产生sucabcd天然操纵子和sucad合成操纵子的版本。两种版本均基于大肠杆菌mg1655天然序列，但在框架内替换了非法的bsai和bpii位点以免影响蛋白序列。除了缺失了sucb的起始密码子和succ的终止密码子之间的序列，操纵子sucabcd和sucad是相同的，通过电穿孔将质粒转化到δsucad和δsucabcd菌株中，并在无需任何额外的补充的lb板上选择；在不补充dap下，亲本菌株无法生长。通过序列确认克隆。通过电穿孔将质粒转化到δsucad和δsucabcd菌株中，并在无需任何额外的补充的lb板上选择；在不补充dap下，亲本菌株无法生长。通过序列确认克隆。在图1a中，我们看到了琥珀酰辅酶a、二氨基庚二酸和胞壁质细胞壁上的肽聚糖的一般代谢情况。由sucab和succd的基因产物产生的琥珀酰辅酶a用于产生大肠杆菌细胞壁(肽聚糖或胞壁质)生物合成关键要求的赖氨酸及其直接生化前体二氨基庚二酸酯(dap)。图1b提供了琥珀酰辅酶a辅因子在二氨基庚二酸酯和赖氨酸代谢中的详细代谢情况(摘自michelandschomberg2012)。在图2a中，提供了本发明的天然大肠杆菌菌株bw25113及其琥珀酰辅酶a操纵子的基因组背景。根据当前发明，其dna序列为(seqidno：1)。图2b提供了大肠杆菌bw25113δsucad的基因组背景的示意图。这是大肠杆菌基因组中p1转导的结果，其中δsuca::kanr被用作供体。受体菌株是大肠杆菌bw25113δsucd::kans，通过pcp20介导的frt切除除去卡那霉素抗性而产生(从而提供seqidno：2)。图2c提供了大肠杆菌bw25113δsucabcd的基因组背景的示意图。结果是通过pcp20介导的frt切除除去了卡那霉素抗性。由于suca和sucd在6kb以内，因此在纯化过程中分离了整个sucabcd操纵子的缺失(seqidno：3)。在图3a中，提供了根据当前发明的质粒pdvk-sucad的谱图。它被用于测试如δsucad细胞为宿主的质粒在非选择性培养基中的保留。在这种情况下，质粒保留了卡那霉素抗性标记用于以后测试。尽管此处具体列举了启动子、rbs和终止子，但实验已表明了改变这些启动子后，其表达实际上没有差异(seqidno：4)。在图3b中，我们提供了质粒pdvk-sucabcd的图谱，该质粒用于测试如δsucabcd细胞为宿主的质粒在非选择性培养基中的保留。根据当前发明，质粒保留了卡那霉素抗性标记用于以后测试。尽管此处具体列举了启动子、rbs和终止子，但实验已表明了改变这些启动子后，其表达实际上没有差异(seqidno：5)。在图3c中，我们看到了本发明的pdvs-kan的质粒图谱，其中，卡那霉素抗性标记容易被目标基因除去，而基因sucad可以替代地用作选择标记。尽管此处具体列举了启动子、rbs和终止子，但实验已表明了改变这些启动子后，其表达实际上没有差异(seqidno：6)。在图3e中，提供了根据当前发明的质粒pdvk-sucbc的谱图。它被用于测试如δsucabcd细胞为宿主的质粒结合pdvk-sucad在非选择性培养基中的保留。在这种情况下，质粒保留了卡那霉素抗性标记用于以后测试。尽管此处具体列举了启动子、rbs和终止子，但实验已表明了改变这些序列后，其表达实际上没有差异(seqidno：10)。在图4a中，申请人表明了琥珀酸途径敲除突变体bw25113δsucad不能在丰富的发酵培养基luria肉汤上生长。然而，用二氨基庚二酸(dap)代替培养基可以使得生长速率增加，这与所提供的dap浓度相关。根据当前发明，在图3d中提供了pdvq-kan的质粒图谱，其中卡那霉素抗性标记容易被目标基因除去，而基因sucabcd可以替代地用作选择标记。尽管此处具体列举了启动子、rbs和终止子，但实验已表明改变这些启动子后，其表达实际上没差异(seqidno：7)。在图4b中，申请人证明了琥珀酸途径敲除突变体bw25113δsucabcd不能在丰富的发酵培养基luria肉汤上生长。然而，用二氨基庚二酸(dap)代替培养基可以使得生长速率增加，这与所提供的dap浓度相关。在图5中，我们提供了人工操纵子中带有质粒的suca(bc)d对生长表型的拯救。来自大肠杆菌bw25113sucad和sucabcd缺失在丰富的发酵培养基luria肉汤上根本不生长。然而，分别将质粒pdvk-sucad和pdvk-sucabcd提供给细胞，可使细胞达到接近野生型bw25113的密度。在图6a中，pdvs-gfp的质粒图谱含有编码克隆到pdvs载体中的绿色荧光蛋白的序列，其中卡那霉素抗性标记容易被目标基因除去。提供了(seqidno：8)。在图6b中，提供了含有编码克隆到pdvq载体中的绿色荧光蛋白的序列的pdvq-gfp的质粒图谱(seqidno：9)。在图7中，我们看到了根据本发明的转化细胞系统，绿色荧光蛋白(gfp)的生产水平通过细胞密度归一化。含有缺失和相应补体的细胞(空心符号，实线)比具有野生型背景的细胞(实心符号，虚线)或没有质粒的细胞(空心符号，虚线)每单位细胞密度表现出更多的gfp。在表1中，我们看到了随着时间，在没有选择卡那霉素的情况下，缺少缺失的细胞会在几天之内失去卡那霉素抗性(携带在质粒上)，而缺失突变体在整个研究过程中仍保留其抗性和质粒。另外，在表1中，申请人证明了菌落形成单位(cfu)的级分在几天内保留了kanr质粒。用三个kan抗性质粒(pdvk-sucad、pdvk-sucabcd和pdvk，a-d行)转化大肠杆菌bw25113。也用补体质粒(pdvk-sucad、pdvk-sucabcd，分别在e-f行)转化sucad和sucabcd中的大肠杆菌bw25113缺失。将50ml培养物在无卡那霉素的lb中作为选择压力培养。将细胞的等分试样平铺在卡那霉素和非选择性平板上，并每天计算cfu。报道了kanrcfu占总cfu的分数。随着时间，在没有选择卡那霉素的情况下，缺少缺失的细胞会在几天之内失去卡那霉素抗性(携带在质粒上)，而缺失突变体在整个研究过程中仍保留其抗性和质粒。表1.单种质粒在系统中保留的生长特征表。随着时间的保留卡那霉素敏感性的cfu分数(并因此维持表达琥珀酸途径和卡那霉素抗性基因的质粒)。系统中多种质粒的维持进行了类似的实验以测试系统中多种质粒的维持。除非在质粒上表达sucab和succd基因中的至少两个，否则bw25113δsucabcd的细胞应在不补充dap的情况下不能在lb中生长。构建了质粒pdvk-sucad和pdvk-sucbc。这两种质粒都没有足够的基因集来允许bw25113δsucabcd在不添加dap的情况下生长，但它们可以结合使用。在不补充dap的情况下，细胞保留了卡那霉素抗性，并因此保留了维持这两种质粒的能力(表2、表3)。表2.保留两种质粒。随着时间的保留卡那霉素敏感性的cfu分数(并因此维持表达琥珀酸途径和卡那霉素抗性基因的质粒)。菌株质粒第1天bw25113pdvk0.49±0.27bw25113δsucabcdpdvk-sucbc和pdvp-sucad0.69±0.37在斑块板上显示了根据当前发明利用的两种质粒的保留，其中，每种菌株/质粒组合的菌落被敲打在不同培养基条件的lb琼脂平板上(表3，图8)。只有具有互补和/或完整的sucabsuccd基因集，大肠杆菌bw25113δsucabcd才能在不补充dap的情况下生长。卡那霉素抗性显示出质粒的维持，这里是两个，因为kanr与琥珀酸操纵子基因连接。表3.保留两种质粒。质粒在不同培养基上的斑块生长。每个菌株/质粒的培养物在lb+dap中生长过夜，并稀释至od600＝1.0。将10μl的这种稀释液(和连续的50倍稀释液)平铺接种到每个色谱柱的培养基条件上。-＝无生长。+＝用od600＝1.0细胞观察到的生长斑。++＝从50倍连续稀释液中观察到的生长斑(od600＝0.02)。+++＝从2500倍连续稀释液中观察到的生长斑(od600＝0.0004)。++++＝从125000倍系列稀释液中观察到的生长斑(od600＝0.000008)。质粒成瘾菌株的培养带有质粒的大肠杆菌菌株在lb中生长，而无需在24孔板和biolector花板中额外添加(funke等人，2009)。为了实现对毒性基因表达的严格调控，优选使用严格调控的启动子，如阿拉伯糖诱导的pbad启动子(guzman等人，1995)，特别是在标记蛋白本身对细胞有毒性的情况下。控制标记基因表达的另一种方式是通过将组成型启动子与无毒的基因(例如报告基因)或在定义条件下仅有毒的基因结合使用，例如枯草芽孢杆菌sacb基因，其仅当存在蔗糖时才对大肠杆菌有毒。选择启动子是与标记基因产物的作用以及所需的下调或沉默作用的效率相协调。例如，对于含有无毒或毒性较小的标记基因的构建体，更强的启动子是理想的。附加实施方式从前面的描述中显而易见的是，本公开的某些方面不受本文所示示例的特定细节的限制，因此可以预期，本领域技术人员将想到其它修改和应用或其等同形式。因此，意图是权利要求将覆盖不脱离本公开的精神和范围的所有这样的修改和应用。此外，除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。虽然与本文所述的任何方法和材料或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试，但是描述优选的方法和材料。尽管为了理解的目的，已经通过说明和示例的方式对上述发明进行了详细描述，对于本领域技术人员显而易见的是，可以进行某些改变和修改。因此，说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，应理解的是，本文提供特定分子产生的本发明的实施方式仅是本发明原理的应用的说明。从前面的描述中显而易见的是，在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下，可以对所公开的生产方法的要素的形式、使用方法和应用以及所选的微生物菌株进行改变。工业实用性声明/
技术领域：
：本公开可用于食品成分、香料、药物和药品的商业生产。本公开一般涉及一种用于经由选定的微生物菌株增强和更精确地控制所需终产物的生物合成生产的方法。通过参考引用和并入的文献：baba,t.,等人,constructionofescherichiacolik-12in-frame,single-geneknockoutmutants:thekeiocollection,mol.syst.biol.2,2006.balbas,p.,等人；understandingtheartofproducingproteinandnonproteinmoleculesinescherichiacoli；molecularbiotechnology(2001)vol.19,(3)pp.251-67.balbas,p.等人；plasmidvectorpbr322anditsspecialpurposederivatives–areview；gene(1986)vol.50pp.3-40.beck,c.f.等人；amultifunctionalgene(tetr)controlstn10-encodedtetracyclineresistance；journalofbacteriology(1982)vol.150no.2pp.633-42.brantl,s.,antisensernasinplasmids:controlofreplicationandmaintenance,academicpress,plasmid48(2002)pp.165-173.brosius,j.,等人；constructionandfinemappingofrecombinantplasmidscontainingtherrnbribosomalrnaoperonofe.coli；plasmid(1981)vol.6no.1pp.112-18.chang,a.c.y.,等人,constructionandcharacterizationofamplifiablemulticopydnacloningvehiclesderivedforthep15acrypticminiplasmid；j.bacteriology(1978)vol.134no.3pp.1141-56.choiy.j.,等人；novel,versatile,andtightlyregulatedexpressionsystemforescherichiacolistrains.appliedandenvironmentalmicrobiology(2010)vol76,no.15,pp.5058-66.cranenburgh,r.m.等人,escherichiacolistrainsthatallowantibiotic-freeplasmidselectionandmaintenancebyrepressortitration,nucleicacidsresearch,2001vol.29,no.5,1-6.datsenko,k.a.,andwanner,b.l.,one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts,proc.natl.acad.sci.u.s.a.97,6640–5.(2000)deboy,r.t.,等人；targetsiteselectionbytn7:atttn7transcriptionandtargetactivity；journalofbacteriology(2000)vol.182no.11pp.3310-3313.delsolar,gloria等人,replicationandcontrolofcircularbacterialplasmids,microbiolologyandmolecularbiologyreviews(1998)vol.62,no.2,pp.434-64.eguchi,yutaka.,等人,complexesformedbycomplementaryrnastem-loops.theirformation,structureandinteractionwithcole1romprotein,journalmolecularbiology(1991)vol.220pp.831-842.fux.,等人,developmentofachromosome-plasmidbalancedlethalsystemoflactobacillusacidophiluswiththyageneasselectivemarker,microbiol.immunol.,44(7)p551-56(2000).funke,m.等人,thebaffledmicrotiterplate:increasedoxygentransferandimprovedonlinemonitoringinsmallscalefermentations,biotechnol.bioeng.(2009)103,1118–28.furste,j.p.,等人,molecularcloningoftheplasmidrp4primaseregioninamulti-host-rangetacpexpressionvector,gene(1986)vol.48pp.119-131.gerdesk.,等人,mechanismofpost-segregationalkillingbythehok/soksystemofplasmidr1:sokantisensernaregulatesformationofahokmrnaspeciescorrelatedwithkillingofplasmid-freecells,mol.microbiol.(1990)4(11):1807–18.gerdes,s.y.,等人,experimentaldeterminationandsystemlevelanalysisofessentialgenesinescherichiacolimg1655,journalofbacteriology(2003)vol.185no.19pp.5673-5684.haegg,p.,等人,ahost/plasmidsystemthatisnotdependentonantibioticsandantibioticgenesforstableplasmidmaintenanceineschericiacoli.,journalofbiotechnology(2004)vol.111pp.17-30.helinski,d.r.,等人；replicationcontrolandotherstablemaintenancemechanismsofplasmids(1996)americansocietyformicrobiologypress,washington,dc,pp.2295-2324.hiszczynska-sawicka,elzbieta.,等人,effectofintegrationhostfactoronrnaiisynthesisinreplicationofplasmidcontainingorip15a,plasmid(1998)vol.40pp.150-157.herring,christopherd.,等人,conditionallethalambermutationsinessentialescherichiacoligenes,journalofbacteriology(2004)vol.186,no.9pp.2673-2681.jensen,l.bogo.,等人,asubstrate-dependentbiologicalcontainmentsystemforpseudonomasputidabasedontheescherichiacoligefgene,appliedandenvironmentalmicrobiology(1993)vol.59,no.11pp.3713-3717.knudsen,steen.,等人,developmentandtestingofimprovedsuicidefunctionsforbiologicalcontainmentofbacteria,appliedandenvironmentalmicrobiology(1995)vol.61,no.3pp.985-991.kroll,j.,等人,plasmidaddictionsystems:perspectivesandapplicationsinbiotechnology,microb.biotechnol.,3(6)pp634-57(2010).kues,u.,等人,replicationofplasmidsingram-negativebacteria,microbiologicalreviews(1989)vol.53,no.4pp.491-516.mairhofer,jurgen等人；anovelantiboticfreeplasmidselectionsystem:advancesinsafeandefficientdnatherapy,biotechnologyjournal(2008)3,pp.83-89.mattozzi,m.d.等人,expressionofthesub-pathwaysofthechloroflexusaurantiacus3-hydroxypropionatecarbonfixationbicycleine.coli:towardhorizontaltransferofautotrophicgrowth,metab.eng.16,130–139.(2013).merlin,s.,等人,assessmentofquantitativemodelsforplasmidcole1copynumbercontrol,j.mol.biol.(1995)vol.248pp.211-19.michel,gerhardanddietmarschomberg；metabolicpathways.(2012)johnwileyandsons,newyorko'kennedy,r.d.,等人,effectsoffermentationstrategyonthecharacteristicsofplasmiddnaproduction,biotechnologyappl.biochem.(2003)vol.37pp.83-90.o'kennedy,r.d.,等人,effectsofgrowthmediumselectiononplasmiddnaproductionandinitialprocessingsteps,journalofbiotechnology(2000)vol.76pp.175-183.postle,k.,等人；nucleotidesequenceoftherepressorgeneofthetn10tetracyclineresistancedeterminant；nucleicacidsresearch(1984)vol.12,no.12pp.4849-4863.pfaffenzeller,i.,usingcole1-derivedrnaiforsuppressionofabacteriallyencodedgene:implicationforanovelplasmidaddictionsystem,biotech.j.(2006),pp.1-7.rawlings,d.e.；proteintoxin-antitoxin,bacterialplasmidaddictionsystemsandtheirevolutionwit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