灌注培养基的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年10月13日提交的美国临时申请序列号62/571,915的优先权利益，所述美国临时申请整体引入本文作为参考。

本发明涉及改善的细胞培养基和方法，相对于现有技术方法，所述细胞培养基和方法实现更大的细胞比生产率以及更好的持续和/或维持的活力。本发明进一步涉及使用新的和改善的细胞培养基的基于脂质的添加剂，所述添加剂部分通过有效地抑制在细胞培养期间，例如在灌注细胞培养的生产阶段期间的细胞生长，来更有效地维持细胞培养活力并且增加细胞比生产率。更特别地，本发明涉及在灌注细胞培养方法期间(例如，在生产阶段期间)使用有效量的一种或多种脂质或脂质代谢产物添加剂，包括亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，其导致在生产期间的生长抑制，伴随同时减少的细胞流出(cellbleed)，维持的高细胞活力和/或增加的细胞特异性产物滴度。更特别地，本发明涉及细胞培养基，其包含有效量的亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体中的一种或多种，用于在灌注细胞培养方法期间，且特别是在生产阶段期间使用，其导致改善和/或维持的细胞活力和/或增加的细胞比生产率。本发明还涉及通过经由遗传和/或生化手段增加亚油酸、花生四烯酸和/或前列腺素e2的合成，用于抑制处于灌注状态的细胞生长的方法。

背景技术：

三种方法通常在商业过程中用于通过哺乳动物细胞培养的重组蛋白质生产：分批培养、补料分批培养和灌注培养。

基于灌注的方法提供了超过分批和补料分批方法的潜在改善，包括改善的产品质量和稳定性、改善的可扩展性以及增加的细胞比生产率。与分批和补料分批生物反应器不同，灌注系统涉及用过的培养基的不断去除。通过不断去除用过的培养基并且用新培养基替换其，营养素水平得到更好地维持，其同时优化生长条件并去除细胞废物。减少的废产物减少了对细胞和表达产物的毒性。因此，灌注生物反应器通常导致显著更少的蛋白质降解以及因此更高质量的产物。还可以更快速且连续地收获且纯化产物，其在生产不稳定的产物时特别有效。

灌注生物反应器也更容易扩展。与传统的分批或补料分批系统相比，灌注生物反应器提供了关于可扩展性和/或需求增加的几个优点。作为其中一个，灌注生物反应器尺寸较小，并且可以以较小的体积产生相同的生产率(即产物产率)。公认的是，与补料分批生物反应器相比，灌注生物反应器可以以5至20倍的浓度起作用。例如，100升的灌注生物反应器可以产生与1,000升的补料分批生物反应器相同的产物产率。因此，可以设想使用1,000升的灌注生物反应器替换典型的10,000升的传统分批补料生物反应器，而不负面影响总体生产率。当扩大生产时，这个显著优点转变成较小的空间需求。这也可以转变成一系列优点，所述优点涉及更低的操作效用、更少的基础设施、更少的劳力、减少的设备复杂性、连续的收获和增加的产物产率。

实现高细胞培养密度负责灌注系统的更大生产率。在典型的大规模补料分批商业细胞培养过程中，可以达到10-50x10⁶个细胞/ml的细胞密度。然而，对于基于灌注的生物反应器，已实现了>1x10⁸个细胞/ml的极高细胞密度。另外，在灌注模式下，通过用过的培养基的不断补给，高细胞数目持续长得多的时间段。关于灌注生物反应器中的增加时间段的较高细胞密度部分解释了其更有效的性能。

典型的灌注培养从分批培养开始，持续一天或更多天，以允许快速的初始细胞生长和生物量积累，随后为在培养的生长和生产阶段自始至终，向培养物中连续、分步和/或间歇地添加新鲜的灌注培养基，以及同时去除用过的培养基，伴随细胞的保留。各种方法例如沉降、离心或过滤可以用于去除用过的培养基，同时维持细胞。已利用了一小部分的工作体积/天直到许多个工作体积/天的灌注流速。

尽管连续灌注系统具有超过传统的分批补料和分批系统的众多优点，但在灌注生物反应器在生物制品制造行业中变得更广泛地接受并利用之前，仍然存在许多挑战。例如，由于去除和补给培养基的连续循环，灌注生物反应器消耗比传统的分批补料系统显著更大体积的培养基。另外，一般缺乏足够的传感器技术用于实时直接评估产物质量，例如蛋白质折叠、聚集、糖基化、氧化和污染—其目前只能通过采样和分析来确定。具有此类技术能力将极大地支持长期稳态灌注的操作。另一个限制是一般缺乏可用的灌注生物处理建模软件，其在很大程度上是由于缺乏有关基于灌注的系统的强数据源。参见e.langer和r.rader，“continuousbioprocessingandperfusion:wideradoptioncomingasbioprocessingmatures,”bioprocessj，2014；13(1):43-49，其引入本文作为参考。

需要改善的一个至关重要的领域是开发更好的灌注生物反应器培养基。与在分批培养中生长的细胞的公认知识相比，关于在灌注中生长的细胞的营养需求可用的科学数据相对较少。参见bsargent，“areperfusioncellculturesystemsthefutureforcell-culturebasedbiomanufacturing,”thecellculturedish，2012年2月3日，可在线获得。在一定程度上，培养基中的近期改善已实现了更高的活细胞密度，并且依次又实现了在灌注过程中的更高滴度。然而，较高的活细胞密度可以造成其它问题。特别地，这些升高的活细胞密度可能变得不可持续，导致减少的培养物活力、缩短的灌注培养运行以及伴随的生产率减少。因此，在执行灌注细胞培养的同时，细胞培养基的设计在实现更大的细胞健康、活力和生产率中具有关键的重要性。需要对灌注细胞培养培养基的设计和培养方法的改善，以克服本领域的不足和挑战。

连续灌注细胞培养系统面临的另一个问题是维持恒定的活细胞密度的挑战，并且因而，维持更健康且更有生产力的细胞培养。这通常已通过允许“细胞流出”来解决。在细胞流出期间，以足以允许稳态灌注细胞培养的速率，将细胞取出并作为废物丢弃。依次地，这使活细胞密度保持恒定。然而，细胞流出是浪费的，因为即使去除的细胞含有目的产物，它们也被丢弃。因此，任何量的细胞流出都负面影响过程效率、产物回收以及最重要的产物损失。细胞流出率由细胞生长速率决定。更快的倍增时间也需要更高的细胞流出，以维持恒定的细胞密度，并且因而更多的浪费。

作为细胞流出的替代方法，其它人已尝试化学添加剂来减慢细胞生长速率。例如，du等人(biotechnologyandbioengineering，第112卷，no.1，2015年1月)报告了小分子细胞周期抑制剂的使用，以控制生长且改善细胞培养生产力。在wo2014/109858中发现了类似的公开内容，其公开了cdk4抑制剂在细胞培养例如分批、补料分批和灌注培养中的使用。du等人进一步教导了cdk4/6抑制剂特异性地抑制细胞周期，而不影响其它细胞靶。其它细胞生长抑制剂并未得到公开。

因此，有效地抑制处于灌注状态的细胞生长并避免细胞流出的需要的另外方法和试剂将显著帮助推进本领域。

灌注生物反应器面临的另外一个问题是关于营养补充剂的知识的总体缺乏。分批细胞培养基长期以来已涉及营养补充剂或添加剂的使用，以帮助改善细胞培养的各个方面，包括细胞活力、生长和生产力。参见gorfien等人，“optimizednutrientadditivesforfed-batchcultures,”biopharminternational，2003年4月，第34-40页。然而，如上所述，用于连续灌注培养系统的培养基设计的开发还远远不够。

关于基于脂质的补充剂，先前已描述了用于在细胞培养中使用的脂质组分和脂质体，但具有有限的成功。例如，hams等人(procnatlacadsciusa78:5588-92，1981)公开了在包含不同脂质组分的培养基中培养人成纤维细胞，所述脂质组分例如包含胆固醇、卵磷脂或纯化的磷脂酰胆碱、鞘磷脂和维生素e的脂质体。然而，hams等人描述了该脂质体是不稳定的，因为它们需要在使用的24小时内制备，并且显示仅在完全培养基中使用脂质体并不促进细胞生长。此外，培养系统不是基于灌注的。

spens等人(biotechnolprog21:87-95，2005)中也描述了基于脂质的补充剂。spens等人描述了ns0骨髓瘤细胞在无蛋白培养基中的培养，所述无蛋白培养基进一步尤其包含胆固醇、环糊精、磷脂酰胆碱、维生素e、柠檬酸铁、普朗尼克和氨基酸。然而，spens等人描述了在高水平下，脂质从溶液中沉淀出来。此外，培养系统不是基于灌注的。

wo94/23572a2(“cellculturingmethodandmedium”)涉及用于产生肝细胞以及其它类型的动物细胞的细胞培养的方法。该参考文献涉及通过切碎组织样品并使细胞在组织培养物中的培养基中生长而制备细胞，所述培养基可以包括亚油酸。然而，该参考文献中的细胞培养的目的是使细胞增殖，而不是抑制细胞增殖。细胞培养也不是灌注培养。因此，该参考文献没有教导或提示使用亚油酸作为用于在灌注培养中使用的营养补充剂，它也没有教导或提示使用亚油酸来抑制处于灌注状态的细胞生长。

wo98/04681a2(“chondrocytemediaformulationsandcultureprocedures”)涉及用于制备增殖从动物中分离的软骨细胞培养的培养基和程序。该参考文献公开了可以包括亚油酸的各种无血清的成分确定的细胞培养基。然而，该参考文献中的细胞培养的目的是使细胞增殖，而不是抑制细胞增殖。细胞培养也不是灌注培养。因此，该参考文献没有教导或提示使用亚油酸作为用于在灌注培养中使用的营养补充剂，它也没有教导或提示使用亚油酸来抑制处于灌注状态的细胞生长。

wo2000/027996(“serumfreemediumforchondrocyte-likecells”)涉及用于生长和增殖培养中的软骨细胞和间充质干细胞的无血清培养基。该参考文献公开了可以包括亚油酸的各种无血清的成分确定的细胞培养基。然而，该参考文献中的细胞培养的目的是使细胞增殖，而不是抑制细胞增殖。细胞培养也不是灌注培养。因此，该参考文献没有教导或提示使用亚油酸作为用于在灌注培养中使用的营养补充剂，它也没有教导或提示使用亚油酸来抑制处于灌注状态的细胞生长。

wo2003/064598(“serum-freemediaforchondrocytesandmethodsofuse”)涉及用于生长和增殖培养中的软骨细胞的无血清培养基。该参考文献公开了可以包括亚油酸和花生四烯酸的各种无血清的成分确定的细胞培养基。然而，该参考文献中的细胞培养的目的是繁殖细胞，而不是抑制细胞增殖。细胞培养也不是灌注培养。因此，该参考文献没有教导或提示使用亚油酸或花生四烯酸作为用于在灌注培养中使用的营养补充剂，它也没有教导或提示使用亚油酸来抑制处于灌注状态的细胞生长。

鉴于本领域中注意到的关于灌注细胞培养的挑战，有效抑制处于灌注状态的细胞生长并避免细胞流出的需要的另外培养基补充剂或添加剂将显著帮助推进本领域。

技术实现要素：

本发明部分涉及以下发现：当单独或组合包括在细胞培养基中时，某些脂质和脂质代谢产物和/或其衍生物和/或前体，例如亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，有效地引起细胞比生产率中的增加和/或有效维持或持续高细胞活力和/或抑制细胞培养的细胞生长。这些试剂可以与任何类型的细胞培养系统，包括分批、补料分批和连续灌注细胞培养系统结合使用。在一个特定实施方案中，细胞培养系统是连续灌注细胞培养系统。

发现本文所述的脂质和脂质代谢产物，例如亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，有效抑制细胞生长，并且这种生长抑制导致细胞比生产率中的增加，并且帮助维持细胞培养中的高活力。

关于灌注细胞培养，通过本文所述的脂质和/或脂质代谢产物(例如亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体)的细胞生长抑制，不仅导致灌注细胞培养中的细胞比生产率中的增加和持续的高细胞活力，同时减少或消除了在灌注状态期间采用细胞流出技术以在其它方面维持细胞处于稳态生长的需要。换言之，通过本发明的脂质和脂质代谢产物抑制处于灌注状态的细胞生长增加了总体细胞比生产率，并且帮助维持高细胞活力，同时最小化或消除了浪费和不期望的细胞流出技术。

如上文指出的，浪费的细胞流出可以用于维持可持续的活细胞密度，并且保存与连续细胞培养过程结合的活力。在连续过程中，由于细胞流出技术可以损失大比例的培养基和因此的产物，所述细胞流出技术虹吸出增殖细胞和培养基，以便维持生物反应器内的恒定、可持续的活细胞密度。由于细胞流出技术，可以损失高达三分之一的可收获材料。使用细胞流出因此降低了每次运行的产物产率，因为未收获通过细胞流出去除的部分内的产物。为了降低通过细胞流出去除的培养物体积，并且因此保留更多的上清液用于收获，一旦在生产阶段中达到了所需的活细胞密度，就抑制细胞增殖是有利的。一旦已获得了最佳的活细胞密度，就需要控制细胞生长，而不利用浪费的细胞流出技术，从而增加了回收的产物/每次灌注运行，并且生成了用于操作灌注过程的更有效方法。

如本文实施例的具体实施方案中证实的，本发明提供了包含亚油酸、花生四烯酸或前列腺素e2中的一种或多种的灌注培养基。本发明进一步提供了使用提供的所述培养基培养哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞的方法。在某些实施方案中，细胞培养方法可以是补料分批或分批方法。在其它实施方案中，细胞培养方法可以是连续灌注培养方法。实施例证实单独或组合的亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2对细胞培养例如灌注细胞培养中的哺乳动物细胞具有相同的作用，其中所述作用是生长抑制，具有产物生产中的伴随增加，而无需浪费的细胞流出。

因此，本文提供了本公开内容的下述方面。

在本公开内容的第一个方面，提供了在细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述培养基包含有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。在某些实施方案中，脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和/或增加的细胞比生产率。在与灌注细胞培养有关的某些其它实施方案中，生长抑制和/或增加的细胞比生产率可以减少或消除关于维持或达到稳态所需的细胞流出。

在本公开内容的第二个方面，提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在灌注培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述灌注培养基包含一种或多种有效量的选自以下的脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。

在本公开内容的第三个方面，提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在灌注培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述灌注培养基包含有效量的亚油酸。

在本公开内容的第四个方面，提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在灌注培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述灌注培养基包含有效量的花生四烯酸。

在本公开内容的第五个方面，提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在灌注培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述灌注培养基包含有效量的前列腺素e2。

在本公开内容的第六个方面，提供了增强灌注细胞培养的比生产率的方法，其包括(a)在灌注生长培养基中培养编码目的蛋白质的重组哺乳动物细胞，直到达到所需细胞密度，并且(b)将有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物引入生长培养基内：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。在某些实施方案中，脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和/或增加的细胞比生产率。在与灌注细胞培养有关的某些其它实施方案中，生长抑制和/或增加的细胞比生产率可以减少或消除维持或达到稳态所需的细胞流出。

在本公开内容的第七个方面，提供了用于培养哺乳动物细胞，并且以改善的生产率产生治疗性蛋白质的细胞培养基。细胞培养基包含一种或多种有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。在某些实施方案中，脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和/或增加的细胞比生产率。在与灌注细胞培养有关的某些其它实施方案中，生长抑制和/或增加的细胞比生产率可以减少或消除维持或达到稳态所需的细胞流出。细胞培养基可以用于任何细胞培养平台，包括分批培养、补料分批培养和连续培养，包括连续灌注培养。

在上述方面的各种实施方案中，细胞培养并无特别限制，并且可以涵盖细胞培养的所有形式和技术，包括但不限于补料分批、分批、灌注、连续、有限、悬浮、贴壁或单层、锚固依赖性和3d培养。本文考虑了细胞培养的任何配置。在一个优选实施方案中，细胞培养是连续灌注细胞培养。

在各种实施方案中，在细胞培养中生长的哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在各种其它实施方案中，哺乳动物细胞并无特别限制。它们可以包括来自仓鼠(例如cho或cho-s细胞)、人(例如jurkat细胞、293细胞、hela细胞)、猴(例如cv-1细胞)、或小鼠(例如3t3细胞)的任何目前可用细胞系。这些细胞可以来自任何组织，例如卵巢细胞(例如cho-s的cho)或肾细胞(例如293细胞)。在本文的任何方法中使用的细胞还可以涵盖可以从商业来源例如thermofisher获得的任何细胞。

在各种实施方案中，亚油酸的有效量为约1800-2000μm。在其它实施方案中，亚油酸的有效量为约1-5000μm、或约1-2500μm、或约1-1250μm、或约1-1000μm、或约1-800μm、或约1-600μm、或约1-400μm、或约1-200μm、或约1-100μm、或约1-50μm、或约1-25μm。在一个实施方案中，亚油酸为500-2000μm的浓度。

在其它实施方案中，花生四烯酸的有效量为约150-500μm。在另外其它实施方案中，花生四烯酸的有效量为约1-5000μm、或约1-2500μm、或约1-1250μm、或约1-1000μm、或约1-800μm、或约1-600μm、或约1-400μm、或约1-200μm、或约1-100μm、或约1-50μm、或约1-25μm。在一个实施方案中，花生四烯酸为100-600μm的浓度。

在其它实施方案中，前列腺素e2的有效量为约0.001μm至60μm。在另外其它实施方案中，前列腺素e2的有效量为0.000001μm或更多、0.00001μm或更多、0.0001μm或更多、0.001μm或更多、0.01μm或更多、0.1μm或更多、1μm或更多、10μm或更多、20μm或更多、30μm或更多、40μm或更多、50μm或更多、60μm或更多、70μm或更多、80μm或更多、90μm或更多、100μm或更多、150μm或更多、200μm或更多，其中每个范围的上限可以为1000μm或更少。在再其它实施方案中，前列腺素e2的有效量为约1-5000μm、或约1-2500μm、或约1-1250μm、或约1-1000μm、或约1-800μm、或约1-600μm、或约1-400μm、或约1-200μm、或约1-100μm、或约1-50μm、或约1-25μm、或约0.0001-0.001μm，至约0.0005-0.01μm、约0.005-0.1μm、约0.05-1.0μm、约0.5-100μm、约50-1000μm或更多。在一个实施方案中，前列腺素e2为0.0001-100μm的浓度。

在一些实施方案中，培养基包含脂质或脂质代谢产物中的至少两种。在一个实施方案中，培养基包含浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为500-1800μm的亚油酸。在另一个实施方案中，培养基包含与浓度为500-1800μm的亚油酸或浓度为100-150μm的花生四烯酸组合的、浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

在另外一个实施方案中，培养基包含所有三种脂质或脂质代谢产物。在一个实施方案中，培养基包含浓度为500-2000μm的亚油酸、浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

在各种实施方案中，异源蛋白质并无特别限制，并且可以是例如治疗性蛋白，例如但不限于抗体、融合蛋白、细胞因子或生长因子、或其片段。抗体可以是单克隆抗体，并且可以是任何替代的分子形式，包括(a)抗原结合构件块(例如，单个可变结构域结合位点；两个可变结构域结合位点；双抗体)，(b)双特异性抗体片段(例如，串联scfv、串联scfv-fc、scfv-fc旋钮进洞(knobs-into-holes)、scfv-fc-scfv、f(ab')2、fab-scfv、(fab'scfv)2、双抗体、scdiabody、scdiabody-fc、scdiabody-ch3)，(c)基于igg的双特异性抗体(例如，杂交杂交瘤、具有共同轻链的旋钮进洞、二合一igg、双重v结构域igg、igg-scfv、scfv-igg、igg-v和v-igg)。参见引入本文作为参考的chan等人，naturereviewsimmunology，第10卷，第301-316页(2010年5月)。

在各种实施方案中，仅当细胞培养中的细胞达到一定密度时，才添加或启动一种或多种脂质或脂质代谢产物。在某些实施方案中，细胞密度为10x10⁶个细胞/ml至约120x10⁶个细胞/ml或甚至更高。用于脂质启动的细胞密度也可以是至少10x10⁶个细胞/ml、至少20x10⁶个细胞/ml、至少30x10⁶个细胞/ml、至少40x10⁶个细胞/ml或至少50x10⁶个细胞。

在某些实施方案中，提供了通过以下在生长阶段期间培养哺乳动物细胞的方法：用无血清灌注培养基灌注直到细胞达到所需活细胞密度；然后在生产阶段期间使细胞在无血清灌注培养基中生长，所述培养基包含选自亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其有效衍生物和/或其前体的脂质或脂质代谢产物中的一种或多种。在某些实施方案中，花生四烯酸(如果存在的话)为100-300μm的浓度，亚油酸(如果存在的话)为500-1800μm的浓度，并且前列腺素e2(如果存在的话)为0.0001-0.0009μm的浓度。在某些其它实施方案中，生长阶段持续直到所需活细胞密度(vcd)达到10x10⁶个细胞/ml至约120x10⁶个细胞/ml或甚至更高，或达到约10x10⁶个细胞/ml或约20x10⁶个细胞/ml、或约30x10⁶个细胞/ml、或约40x10⁶个细胞/ml或约50x10⁶个细胞。

在关于灌注细胞培养的某些实施方案中，细胞培养的方法可以包括细胞流出的进一步步骤。然而，与使用相同的灌注培养基但不包括本文所述的脂质或脂质代谢产物的灌注细胞培养相比，用本文所述方法的含有脂质的培养基可以减少或消除细胞流出的使用。

灌注培养基的渗透压可以在300至1400mosmol/kg之间，优选在300至500mosmol/kg之间，更优选在330至450mosmol/kg之间，且甚至更优选在360至390mosmol/kg之间的范围内。

灌注培养基可以是无血清的，并且它可以进一步是化学成分确定的和/或无水解产物的。优选地，灌注培养基可以是无蛋白质的、或者无除了重组胰岛素和/或胰岛素样生长因子之外的蛋白质，更优选地，无血清灌注培养基是化学成分确定的，并且是无蛋白质的、或者无除了重组胰岛素和/或胰岛素样生长因子之外的蛋白质。

在一个进一步方面，提供了使用本发明的方法产生治疗性蛋白质的方法，其任选地包括将治疗性蛋白质纯化且配制成药学上可接受的制剂的进一步步骤。

在特定的进一步实施方案中，本公开内容提供了下述实施方案，其绝不预期限制随同公开内容的范围。

在一个实施方案中，本公开内容提供了在细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述培养基包含有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。在某些实施方案中，脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和/或增加的细胞比生产率。在与灌注细胞培养有关的某些其它实施方案中，生长抑制和/或增加的细胞比生产率可以减少或消除关于维持或达到稳态所需的细胞流出。

在另一个实施方案中，本发明提供了从细胞培养中产生治疗性蛋白质的方法，其包括：

(a)在培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述培养基含有有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，

(b)从细胞培养中收获异源蛋白质。

在某些实施方案中，脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和/或增加的细胞比生产率。在与灌注细胞培养有关的某些其它实施方案中，生长抑制和/或增加的细胞比生产率可以减少或消除关于维持或达到稳态所需的细胞流出。

在各种实施方案中，灌注细胞培养基包含选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、以及其功能等价衍生物和/或前体。

在各种实施方案中，亚油酸或其衍生物为500-2000μm的浓度。

在各种实施方案中，花生四烯酸或其衍生物为100-600μm的浓度。

在各种实施方案中，前列腺素e2或其衍生物为0.0001-100μm的浓度。

在各种实施方案中，培养基包含脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体中的两种。

在各种实施方案中，培养基包含浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为500-1800μm的亚油酸。

在各种实施方案中，培养基包含与浓度为500-1800μm的亚油酸或浓度为100-150μm的花生四烯酸组合的、浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

在各种实施方案中，培养基包含所有三种脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体。

在各种实施方案中，亚油酸为500-2000μm的浓度，花生四烯酸为100-300μm的浓度，并且前列腺素e2为0.0001-0.0009μm的浓度。

在各种实施方案中，细胞培养是分批、补料分批或连续灌注细胞培养。

在各种实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞、jurkat细胞、293细胞、hela细胞、cv-1细胞或3t3细胞、或这些细胞中任一种的衍生物，其中所述cho细胞可以进一步选自cho-dg44细胞、cho-k1细胞、chodxb11细胞、cho-s细胞和chogs缺陷细胞或这些细胞中任一种的衍生物。

在各种实施方案中，异源蛋白质是治疗性蛋白质、抗体或其治疗有效片段。

在各种实施方案中，抗体是单克隆抗体或其片段。

在各种实施方案中，抗体是双特异性抗体。

在各种实施方案中，培养基是无血清灌注培养基。

在各种实施方案中，培养基任选地是(a)化学成分确定的，(b)无水解产物的，或(c)无蛋白质的，但任选地包括胰岛素和/或胰岛素样生长因子。

在各种实施方案中，当相对于不包括脂质或脂质代谢产物的对照细胞培养中的总生产水平，由细胞培养产生的异源蛋白质的总生产增加至少5％、或至少6％、或至少7％、或至少8％、或至少9％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少200％时，实现了增加的生产率。

在各种实施方案中，当相对于不包括脂质或脂质代谢产物的对照细胞培养中的细胞比生产率，细胞培养的细胞比生产率(pg/细胞/天)增加至少5％、或至少6％、或至少7％、或至少8％、或至少9％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少200％、或至少5-10％、或至少7.5-20％、或至少10-30％、或至少12.5-40％、或至少15-50％、或至少5-50％时，实现了增加的生产率。

在各种实施方案中，生长抑制足以使细胞维持稳态，其具有的活细胞密度相对于不包括脂质或脂质代谢产物的对照细胞培养低至少50％、低至少40％、低至少30％、低至少20％、低至少15％、或低至少10％、或低至少5％、或低至少2.5％、或者1％或更低。

在各种实施方案中，将在第2天时的细胞培养改变为灌注细胞培养。

在各种实施方案中，在灌注已起始之后，灌注速率增加。

在各种实施方案中，灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到5个容器体积/天。

在各种实施方案中，灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到2个容器体积/天。

在各种实施方案中，进一步包括以连续方式从细胞培养中收获异源蛋白质。

在各种实施方案中，一旦达到10x10⁶个细胞/ml至约120x10⁶个细胞/ml的细胞密度，就将一种或多种脂质或脂质代谢产物或其衍生物加入细胞培养基中。在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含500μm的亚油酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含亚油酸的细胞培养，其使vcd降低6-10％。

在另一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含900μm的亚油酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含亚油酸的细胞培养，其使vcd降低11-14％。

在另外一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含1350μm的亚油酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含亚油酸的细胞培养，其使vcd降低11-25％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含1800μm的亚油酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含亚油酸的细胞培养，其使vcd降低23-39.8％。

在另一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含500μm的花生四烯酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含花生四烯酸的细胞培养，其使vcd降低15-36％。

在另一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含0.001μm的前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，相对于在其生长培养基中不包含花生四烯酸的细胞培养，其使vcd降低17％。

在另一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含10μm的前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，相对于在其生长培养基中不包含花生四烯酸的细胞培养，其使vcd降低28％。

在另一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含20μm的前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，相对于在其生长培养基中不包含花生四烯酸的细胞培养，其使vcd降低39％。

在另一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含60μm的前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，相对于在其生长培养基中不包含花生四烯酸的细胞培养，其使vcd降低30％。

在另一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含10μm的前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，相对于在其生长培养基中不包含花生四烯酸的细胞培养，其使vcd降低28％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含500μm的亚油酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含亚油酸的细胞培养，其使细胞比生产率增加至多10％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含900μm的亚油酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含亚油酸的细胞培养，其使细胞比生产率增加至多14％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含1350μm的亚油酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含亚油酸的细胞培养，其使细胞比生产率增加至多14％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含1800μm的亚油酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含亚油酸的细胞培养，其使细胞比生产率增加至多30％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含500μm的花生四烯酸或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含花生四烯酸的细胞培养，其使细胞比生产率增加至多52％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含0.001μm的前列腺素e2或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含前列腺素e2的细胞培养，其使细胞比生产率增加至多13.5％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含10μm的前列腺素e2或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含前列腺素e2的细胞培养，其使细胞比生产率增加至多34.4％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含20μm的前列腺素e2或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含前列腺素e2的细胞培养，其使细胞比生产率增加至多31％。

在一个实施方案中，本文公开的方法和/或生长培养基包含60μm的前列腺素e2或其衍生物，相对于在其生长培养基中不包含前列腺素e2的细胞培养，其使细胞比生产率增加至多31％。

附图说明

图1.温度变换对在灌注细胞培养中表达异源蛋白质的cho细胞系的(a)％活力百分比，(b)活细胞密度(e⁵个细胞/ml)和(c)比生产率(pg/细胞/天)的作用。灌注在细胞培养的第2天时开始，并且逐渐增加至2个容器体积/天(2vvd)的更换。箭头指示当温度从37℃转变为图例中指示值(29℃–正方形或28℃–三角形)的天数。进一步的细节可以在实施例1中找到。

图2.描绘了亚油酸代谢的代谢途径。高浓度的外源性游离亚油酸显示扩散通过细胞膜，其然后转换为花生四烯酸。花生四烯酸然后通过多步反应代谢为pge2，以及其它下游代谢产物。

图3.证实了当加入灌注培养基中时，亚油酸抑制细胞生长，并且增加cho灌注细胞培养中的细胞比生产率(qp)。亚油酸以各种浓度500μm、900μm、1350μm和1800μm加入细胞培养基中，并且确定了对(a)活细胞密度(e⁵个细胞/ml)、(b)细胞活力百分比(％)和(c)比生产率(qp)的作用。进一步的细节可以在实施例2中找到。

图4.证实了当加入灌注培养基中时，花生四烯酸抑制细胞生长，并且增加细胞比生产率(qp)。确定了花生四烯酸对细胞培养的(a)活细胞密度(e⁵个细胞/ml)、(b)细胞活力百分比(％)和(c)比生产率(qp)的作用。在正常的灌注培养基中以500μm加入的花生四烯酸浓度，使细胞生长抑制高达31％，并且使细胞比生产率增加46％或更高。进一步的细节可以在实施例3中找到。

图5.证实了当加入灌注“k-pop”培养基中时，花生四烯酸抑制细胞生长，并且增加细胞比生产率(qp)。在这种情况下，k-pop培养基具有约34mm的钠浓度和大约94mm的升高的钾浓度，即，0.4molna⁺/molk⁺的减少的钠/钾比。确定了k-pop基线中以150μm、300μm和500μm的花生四烯酸浓度关于(a)活细胞密度(e⁵个细胞/ml)、(b)细胞活力百分比(％)和(c)比生产率(qp)的影响。进一步的细节可以在实施例4中找到。

图6.证实了当加入灌注培养基中时，前列腺素e2抑制细胞生长，并且增加细胞比生产率(qp)。图6证实了以500μm、pge20.001μm、10μm、20μm和60μm加入灌注培养基中的花生四烯酸浓度对(a)活细胞密度(vcd)(e⁵个细胞/ml)、(b)细胞活力百分比(％)和(c)比生产率(qp)的作用。进一步的细节可以在实施例5中找到。

图7.证实了在具有500μm花生四烯酸的灌注培养基中，乙酰水杨酸(asa)对(a)活细胞密度、(b)活力百分比和(c)比生产率的作用。进一步的细节可以在实施例6中找到。

具体实施方式

本发明部分涉及以下发现：当单独或组合包括在细胞培养基中时，某些脂质和脂质代谢产物，例如亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，有效地引起增加细胞培养的活细胞密度和细胞比生产率中的增加。这些试剂可以与任何类型的细胞培养系统，包括分批、补料分批和连续灌注细胞培养系统结合使用。在灌注细胞培养的情况下，脂质和/或脂质代谢产物的使用可以减少或消除细胞流出作为用于维持细胞培养稳态的手段的需要，即，单独的脂质和/或脂质代谢产物能够通过降低活细胞密度并抑制细胞生长来维持或持续细胞培养稳态。

不受理论的束缚，并且如实施例中证实的，前列腺素e2是触发细胞生长抑制和细胞比生产率增加的关键因素。亚油酸和花生四烯酸是前列腺素e2合成的前体，并且是同一代谢途径的部分(参见图2)。因此，在另一个方面，本公开内容考虑了通过直接或间接手段有效地增加前列腺素e2的细胞内浓度的广泛方法，包括但不限于将外源性前列腺素e2加入细胞培养基中，以及将外源性前列腺素e2的代谢前体，包括亚油酸和/或花生四烯酸加入细胞培养基中。

定义

下文提供了某些术语的定义。一般而言，除非另有说明或定义，否则本公开内容中呈现的任何术语都应该给予其在本领域中的普通含义。

一般实施方案“包含(comprising)”或“包含(comprised)”涵盖更具体的实施方案“由……组成”。此外，单数和复数形式不以限制方式使用。如本文使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”指定单数和复数两者，除非明确陈述仅指定单数。

如本文使用的，术语“灌注”指维持细胞培养生物反应器，其中将等体积的培养基同时加入反应器中并且从反应器中去除，同时将细胞保留在反应器中。灌注培养也可以称为连续培养。这提供了新鲜营养素的稳定来源以及细胞废产物的不断去除。与常规生物反应器分批或补料分批条件相比，灌注通常用于获得高得多的细胞密度和因此更高的体积生产率。可以连续收获分泌的蛋白质产物，同时将细胞保留在反应器中，例如通过过滤、交替切向流(atf)、细胞沉降、超声分离、水力旋流器、或者本领域技术人员已知或如kompala和ozturk(cellculturetechnologyforpharmaceuticalandcell-basedtherapies,(2006)，taylor&francisgroup，llc，第387-416页)中描述的任何其它方法。哺乳动物细胞可以在悬浮培养中生长(均质培养)，或附着至表面或诱陷在不同的装置中(异质培养)。为了使生物反应器中的工作体积保持恒定，收获率和细胞流出(流体去除)应该等于预定的灌注速率。培养通常通过分批培养开始，并且在接种后第2-3天时，当细胞仍处于指数生长阶段时并且在营养素限制发生之前起始灌注。

通过添加新鲜培养基并同时去除用过的培养基，基于灌注的方法提供了超过分批和补料分批方法的潜在改善。大规模的商业细胞培养策略可以达到60-90x10⁶个细胞/ml的高细胞密度，在此时反应器体积的约三分之一至超过一半可以是生物量。对于基于灌注的培养，已实现了>1x10⁸个细胞/ml的极高细胞密度。典型的灌注培养从分批培养开始，持续一天或更多天，以允许快速的初始细胞生长和生物量积累，随后为在培养的生长和生产阶段自始至终，向培养物中连续、分步和/或间歇地添加新鲜的进料培养基，以及同时去除用过的培养基，伴随细胞的保留。各种方法例如沉降、离心或过滤可以用于去除用过的培养基，同时维持细胞。已利用了一小部分的工作体积/每天直到许多个工作体积/每天的灌注流速。

如本文使用的，术语“灌注速率”是添加和去除的体积，并且通常每天进行测量。它取决于细胞密度和培养基。它应该降到最低，以减少目的产物的稀释，即收获滴度，同时确保营养素添加和副产物去除的适当速率。灌注通常在接种后第2-3天时起始，此时细胞仍处于指数生长阶段，并且因此灌注速率在培养过程中可以增加。灌注速率中的增加可以是增量的或连续的，即基于细胞密度或营养素消耗。它通常从0.5或1个容器体积/天(vvd)起始，并且可以上升到约5vvd。优选地，灌注速率在0.5至2vvd之间。增加可以是0.5至1vvd。对于灌注中的连续增加，可以将生物量探针与收获泵相接，使得基于所需的细胞特异性灌注速率(cspr)，灌注速率作为由生物量探针确定的细胞密度的线性函数而增加。cspr等于灌注速率/细胞密度，并且理想的cspr取决于细胞系和细胞培养基。理想的cspr应该导致最佳的生长速率和生产率。50至100pl/细胞/天的cspr可以是合理的起始范围，其可以进行调整以找到用于特定细胞系的最佳速率。

如本文使用的，术语“稳态”指其中细胞密度和生物反应器环境保持相对恒定的条件。这可以通过细胞流出、营养素限制和/或温度减少来实现。在大多数灌注培养中，营养素供应和废物去除允许恒定的细胞生长和生产率，并且需要细胞流出来维持恒定的活细胞密度或使细胞维持在稳态下。在稳态下的典型活细胞密度为10至50e6个细胞/ml。活细胞密度可以根据灌注速率而变。通过增加灌注速率或优化用于与灌注一起使用的培养基，可以达到更高的细胞密度。在非常高的活细胞密度下，灌注培养变得难以在生物反应器内加以控制。

术语“细胞流出(cellbleed)”和“细胞流出(cellbleeding)”在本文中可互换使用，并且指从生物反应器中去除细胞和培养基，以便在生物反应器内维持恒定、可持续的活细胞密度。恒定、可持续的活细胞密度也可以称为靶细胞密度。这种细胞流出可以使用汲取管和蠕动泵以限定的流速来完成。管道应该具有合适的尺寸，其中太窄的管倾向于细胞聚集和堵塞，同时如果太大，则细胞可能沉降。细胞流出可以基于生长速率进行确定，因此活细胞密度可以以连续的方式限制于所需的体积。可替代地，细胞可以以一定频率例如每天一次进行去除，并且替换为培养基以将细胞密度维持在可预测的范围内。理想地，细胞流出速率等于生长速率，以维持稳定的细胞密度。

通常，随着细胞流出而去除的目的产物被丢弃，并且因此对于收获丧失。与渗透物相反，细胞流出含有细胞，这使得纯化前的产物贮存更困难，并且可以对产物质量具有有害作用。因此，细胞必须在贮存和产物纯化之前连续去除，这将是费力和成本低效的。对于缓慢生长的细胞，细胞流出可以是去除液体的约10％，并且对于快速生长的细胞，细胞流出可以是去除液体的约30％。因此，通过细胞流出的产物损失可以是整个生产产物的约30％。如本文使用的，“渗透物”指细胞已从其中分离以保留在培养容器中的收获物。

术语“培养物”或“细胞培养”可互换使用，并且指在适于允许细胞群体存活和/或生长的条件下，维持在培养基中的细胞群体。本发明仅涉及哺乳动物细胞培养。哺乳动物细胞可以在悬浮中培养或附着至固体支持物。如技术人员将清楚的，细胞培养指包含细胞群体和该群体悬浮于其中的培养基的组合。细胞培养的具体类型并无特别限制，并且可以涵盖细胞培养的所有形式和技术，包括但不限于补料分批、分批、灌注、连续、有限、悬浮、贴壁或单层、锚固依赖性和3d培养。

如本文使用的，术语“培养”指哺乳动物细胞通过其在受控条件下、以及在支持细胞的生长和/或存活的条件下生长或维持的过程。如本文使用的，术语“维持细胞”与“培养细胞”可互换使用。培养也可以指在培养基中接种细胞的步骤。

如本文使用的，术语“分批培养”是不连续的方法，其中细胞在固定体积的培养基中生长短时间段，随后为完全收获。使用分批方法生长的培养物经历细胞密度中的增加，直到达到最大细胞密度，随后为随着培养基组分消耗和代谢副产物(如乳酸盐和氨)的水平积累，活细胞密度中的下降。收获通常在达到最大细胞密度(通常为5-10x10⁶个细胞/ml，取决于培养基制剂、细胞系等)的点时或之后不久发生，通常为3至7天左右。

如本文使用的，通过提供大剂量或连续培养基进料以补给已消耗的那些培养基组分，术语“补料分批培养”改善了分批工艺。由于补料分批培养在培养过程自始至终接受另外的营养素，因此，当与分批方法比较时，它们具有实现更高的细胞密度(>10至30x10⁶个细胞/ml，取决于培养基配方、细胞系等)和增加的产物滴度的潜力。与分批工艺不同，双相培养可以通过操纵进料策略和培养基制剂来产生且持续，以区分实现所需细胞密度的细胞增殖时期(生长阶段)与悬浮或缓慢细胞生长时期(生产阶段)。像这样，与分批培养相比，补料分批培养具有实现更高产物滴度的潜力。与分批方法一样，代谢副产物的积累导致在一段时间内下降的细胞活力，因为它们在细胞培养基内逐渐地积累，其将生产阶段的持续时间限制于约1.5至3周。补料分批培养是不连续的，并且收获通常在代谢副产物水平或培养物活力达到预定水平时发生。

术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可与“氨基酸残基序列”互换使用，并且指氨基酸的聚合物。这些术语还包括通过反应进行翻译后修饰的蛋白质，所述反应包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化或蛋白质加工。可以在多肽的结构中制备修饰和改变，例如与其它蛋白质的融合，氨基酸序列取代、缺失或插入，同时该分子维持其生物学功能活性。例如，可以在多肽或其基础的核酸编码序列中制备某些氨基酸序列取代，并且可以获得具有相同特性的蛋白质。该术语也适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物。术语“多肽”通常指具有多于10个氨基酸的序列，并且术语“肽”指具有长度最多10个氨基酸的序列。

如本文使用的，术语“异源蛋白质”指衍生自来自宿主细胞的不同生物或不同物种的多肽。异源蛋白质由异源多核苷酸编码，所述异源多核苷酸用实验方法放入并不天然表达该蛋白的宿主细胞内。异源多核苷酸也可以称为转基因。因此，它可能是编码异源蛋白质的基因或开放读码框(orf)。当针对蛋白质使用时，术语“异源的”也可以指示该蛋白质包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在自然界中并未发现处于彼此相同的关系中或具有相同的长度。因此，它也涵盖重组蛋白质。异源的也可以指在它通常在其中不被发现的位置中，插入哺乳动物细胞的基因组内的多核苷酸序列，例如基因或转基因、或其一部分。在本发明中，异源蛋白质优选是治疗性蛋白质。

术语“培养基(medium)”、“细胞培养基”和“培养基(culturemedium)”在本文中可互换使用，并且指滋养细胞特别是哺乳动物细胞的营养素溶液。细胞培养基配方是本领域众所周知的。通常，细胞培养基提供由细胞对于最低限度的生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和微量元素，以及缓冲液和盐。培养基还可以含有增强生长和/或存活超过最小速率的补充组分，包括但不限于激素和/或其它生长因子，特别是离子(例如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低的最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能源；如本文所述的。在某些实施方案中，将培养基有利地配制为对于细胞存活和增殖最佳的ph和盐浓度。根据本发明的培养基是在细胞培养开始后添加的灌注培养基。在某些实施方案中，细胞培养基是起始营养液(基础培养基或接种培养基)、以及在细胞培养开始后添加的任何培养基的混合物。一些细胞培养系统，例如灌注细胞培养，可以具有不同的培养阶段，包括生长阶段和生产阶段。在生长阶段和生产阶段中使用的特定培养基可以特别设计用于在所述特定阶段中的实施。在一些实施方案中，脂质和/或脂质代谢产物可以仅在生产阶段中、或仅在生长阶段中、或在生长阶段和生产阶段两者中添加或包括。

如本文使用的，术语“无血清”指不含有动物或人血清，例如胎牛血清的细胞培养基。优选地，无血清培养基不含从任何动物或人衍生的血清中分离的蛋白质。各种组织培养基，包括成分确定的培养基，是商购可得的，例如，可以使用下述细胞培养基中的任何一种或组合：rpmi-1640培养基、rpmi-1641培养基、达尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)、伊格尔最低必需培养基、f-12k培养基、ham的f12培养基、伊斯科夫改良达尔贝科培养基、mccoy的5a培养基、leibovitz的l-15培养基和无血清培养基，例如ex-cell^tm300series(jrhbiosciences，lenexa，kansas)及其它。此类培养基的无血清版本也是可获得的。细胞培养基可以补充有另外或增加浓度的组分，例如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、微量元素等等，取决于待培养细胞的需求和/或所需的细胞培养参数。

如本文使用的，术语“无蛋白质”指不含有任何蛋白质的细胞培养基。因此，它缺乏从动物或人中分离的、衍生自血清或重组产生的蛋白质的蛋白质，例如在哺乳动物、细菌、昆虫或酵母细胞中产生的重组蛋白质。无蛋白质的培养基可以含有单个重组蛋白质，例如胰岛素或胰岛素样生长因子，但仅在这种添加明确陈述的情况下。

如本文使用的，术语“化学成分确定的”指其为无血清且不含有任何水解产物，例如衍生自酵母、植物或动物的蛋白质水解产物的培养基。优选地，化学成分确定的培养基也是无蛋白质的，或仅含有选择的重组产生的(并非动物衍生的)蛋白质，例如胰岛素或胰岛素样生长因子。化学成分确定的培养基由表征且纯化的物质的混合物组成。化学成分确定的培养基的实例是例如来自invitrogen(carlsbad，ca，us)的cd-cho培养基。

如本文使用的，术语“悬浮细胞”或“非贴壁细胞”指在液体培养基中悬浮培养的细胞。贴壁细胞如cho细胞可以适于在悬浮液中生长，并且从而丧失其附着于容器或组织培养皿的表面的能力。

如本文使用的，术语“生物反应器”意指可用于细胞培养的生长的任何容器。生物反应器可以具有任何大小，只要它可用于细胞的培养；通常，生物反应器的大小适合于在其内部生长的细胞培养的体积。通常，生物反应器为至少1升，并且可以为2、5、10、50、100、200、250、500、1,000、1,500、2,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更多，或两者之间的任何体积。在培养期过程中可以控制生物反应器的内部条件，包括但不限于ph和温度。基于相关考虑，本领域普通技术人员将知道并且将能够选择用于在实践本发明中使用的合适的生物反应器。本发明的方法中使用的细胞培养可以在适合于灌注培养的任何生物反应器中生长。生物反应器的特定类型并无特别限制，并且可以涵盖所有类型的生物反应器，包括但不限于补料分批、分批、灌注、连续、有限、悬浮、贴壁或单层、锚固依赖性和3d培养。

如本文使用的，“细胞密度”指给定体积的培养基中的细胞数目。“活细胞密度”指在给定体积的培养基中的活细胞数目，如通过标准活力测定(例如锥虫蓝染料排除法)确定的。

如本文使用的，术语“细胞活力”意指培养中的细胞在给定的一组培养条件或实验变化下存活的能力。如本文使用的，术语还指与当时培养中的活细胞和死细胞的总数目相比，在特定时间存活的那部分细胞。

如本文使用的，术语“滴度”意指在给定量的培养基体积中，由细胞培养产生的目的多肽或蛋白质(其可以是天然存在的或目的重组蛋白质)的总量。滴度可以以毫克或微克多肽或蛋白质/毫升(或其它体积量度)培养基的单位表示。

如本文使用的，术语“产率”指在一定时间段内在灌注培养中产生的异源蛋白质的量。“总产率”指在整个运行过程中在灌注培养中产生的异源蛋白质的量。

如本文使用的，术语“减少(reduction)”、“减少的”或“减少(reduce)”一般意指与参考水平相比至少10％的降低，例如与对照哺乳动物细胞培养相比，至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、至少约90％的降低、或直至且包括100％的降低、或10-100％之间的任何整数降低，所述对照哺乳动物细胞培养在相同条件下使用相同的无血清灌注培养基进行培养，而无以本发明的灌注培养基中使用的浓度的脂质或脂质代谢产物。

如本文使用的，术语“增强”、“增强的”、“增强的”、“增加”或“增加的”一般意指与对照细胞相比至少10％的增加，例如与哺乳动物细胞培养相比，至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约200％、或至少约300％的增加、或在10-300％之间的任何整数降低，所述哺乳动物细胞培养在相同条件下使用相同的无血清灌注培养基进行培养，而无以本发明的灌注培养基中使用的浓度的脂质或脂质代谢产物。

如本文使用的，“对照细胞培养”或“对照哺乳动物细胞培养”是这样的细胞，其与它与之相比较的细胞培养相同，除了灌注培养基不具有本发明的灌注培养基的fe离子和类视黄醇浓度之外。

如本文使用的，术语“哺乳动物细胞”是适合于产生异源蛋白质，优选治疗性蛋白质，更优选分泌型重组治疗性蛋白质的细胞系。根据本发明的优选的哺乳动物细胞是啮齿类动物细胞，例如仓鼠细胞。哺乳动物细胞是分离的细胞或细胞系。哺乳动物细胞优选是转化的和/或永生化细胞系。它们适于细胞培养中的连续传代，并且不包括原代非转化细胞或其为器官结构的部分的细胞。优选的哺乳动物细胞是bhk21、bhktk^-、cho、cho-k1、cho-s细胞、cho-dxb11(也称为cho-dukx或duxb11)和cho-dg44细胞或任何此类细胞系的衍生物/后代。特别优选的是cho-dg44、cho-k1和bhk21，且甚至更优选的是cho-dg44和cho-k1细胞。最优选的是cho-dg44细胞。还涵盖了哺乳动物细胞，特别是cho-dg44和cho-k1细胞的谷氨酰胺合成酶(gs)缺陷型衍生物。哺乳动物细胞可以进一步包含编码异源蛋白质，优选重组分泌型治疗性蛋白质的一个或多个表达盒。哺乳动物细胞还可以是鼠细胞，例如鼠骨髓瘤细胞，例如ns0和sp2/0细胞，或任何此类细胞系的衍生物/后代。然而，那些细胞的衍生物/后代，其它哺乳动物细胞包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴和啮齿类动物细胞系，也可以用于本发明中，特别是用于生产生物药物蛋白。

如本文使用的，术语“生长阶段”指细胞培养的阶段，其中细胞呈指数增殖，并且生物反应器中的活细胞密度逐渐增加。培养中的细胞通常遵循标准的生长模式增殖。在培养物接种后的第一生长阶段是迟滞阶段，其为当细胞适应培养环境并准备快速生长时的缓慢生长时期。迟滞阶段随后为生长阶段(也称为对数阶段或对数期)，这是细胞呈指数增殖并消耗生长培养基的营养素的时期。在本文的某些实施方案中，亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2或其衍生物和/或前体的一种或多种添加剂可以在生长阶段开始时、或在生长阶段过程中的某个时间加入。在其它实施方案中，初始生长培养基可以在生长阶段的开始时，即在细胞培养的开始时，包含亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2或其衍生物和/或前体的一种或多种添加剂。

术语“生产阶段”指一旦达到靶细胞密度和/或开始收获就开始的细胞培养阶段。典型的靶细胞密度在10x10⁶个细胞/ml至约120x10⁶个细胞/ml的范围内，但可以甚至更高。因此，根据本发明的靶细胞密度是至少10x10⁶个细胞/ml、至少20x10⁶个细胞/ml、至少30x10⁶个细胞/ml、至少40x10⁶个细胞/ml或至少50x10⁶个细胞/ml。最优选地，靶细胞密度为约30至约50x10⁶个细胞/ml。活细胞密度取决于灌注速率，并且可以使用规则或连续的细胞流出维持在恒定水平下。在本文的某些实施方案中，亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2或其衍生物和/或前体的一种或多种添加剂可以在生产阶段开始时、或在生产阶段过程中的某个时间加入。

如本文使用的，术语“生长停滞”指停止数目中的增加，即停止细胞分裂的细胞。细胞周期包括间期和有丝分裂期。间期由三个阶段组成：dna复制被限于s期；g1是m相和s相之间的间隙，而g2是s相和m相之间的间隙。在m期，核然后为细胞质分裂。在不存在增殖的有丝分裂信号的情况下、或在诱导生长停滞的化合物的存在下，细胞周期停滞。细胞可能部分拆散其细胞周期控制系统，并且从周期中退出至称为g0的专门的非分裂状态。

如本文使用的，术语“大剂量添加”指立即将细胞培养中的浓度调节至所需浓度的添加。根据本发明，这意味着将细胞培养中的类视黄醇浓度瞬时调节至本发明的类视黄醇浓度。这是为了避免其中细胞以较低的类视黄醇浓度培养的过渡阶段，其可能导致不需要的增殖活性。

在各个方面，本发明可以提及与本公开内容的方法和细胞培养基结合的“亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2或其衍生物和/或前体中的一种或多种”。短语“其中的一种或多种”考虑了与本公开内容的方法和细胞培养基结合使用的下述中的任一种：单独的亚油酸或其衍生物和/或前体；单独的花生四烯酸或其衍生物和/或前体；单独的前列腺素e2或其衍生物和/或前体；亚油酸和花生四烯酸或其衍生物和/或前体的双重组合；亚油酸和前列腺素e2或其衍生物和/或前体的双重组合；花生四烯酸和前列腺素e2或其衍生物和/或前体的双重组合；亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2或其衍生物和/或前体的三重组合。当组合使用时，添加剂的相对量、浓度和/或比率在本文其它地方描述。

提及化合物，例如提及亚油酸、花生四烯酸或前列腺素e2的“衍生物和/或前体”，指“衍生物”和“前体”。衍生物是这样的化合物，其通过化学反应从起始化合物衍生，并且是结构和/或功能类似物，即具有与起始化合物相同或大致相同的结构和功能。在本发明的情况下，亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2的衍生物是的化合物，其通过化学反应从这三种化合物中的任一种衍生，所述化学反应改变或修饰起始化合物的结构或原子组成(例如，官能团的添加或减去)，并且是结构上相似的(即，结构类似物)并具有相同或相似的功能(即功能类似物)。前体是在代谢途径中的另一个之前(直接或间接地)的化合物。在本发明中，亚油酸是花生四烯酸的前体，所述花生四烯酸是在同一代谢途径上的前列腺素e2(“pge2”)的前体–参见图2。参考图2，前列腺素e2的另外前体包括pgg2(前列腺素g2)和pgh2(前列腺素h2)，其通过细胞中的cox-1和cox-2酶进行转换，以形成pge2。因此，本发明还考虑了亚油酸、花生四烯酸和/或前列腺素h2各自的代谢前体也可以用于本文的方法和培养基中。如本文使用的，术语“约”指围绕所提供的实际值的变化，并且涵盖该值的正和负10％。

细胞培养方法

出于理解的目的，然而非限制性地，熟练从业者将了解，用于蛋白质生产的细胞培养和培养运行可以包括至少三种一般类型；即，灌注培养、分批培养和补料分批培养。当然考虑了其它生物反应器系统，即，本发明当然并不限于灌注、分批和补料分批细胞培养系统。例如，在灌注培养中，在培养期过程中向细胞提供新鲜的培养基补充物，同时每天去除旧培养基并且例如每天或连续地收获产物。在灌注培养中，灌注培养基可以每天添加，并且可以连续添加，即作为滴注或输注。对于灌注培养，只要细胞保持存活并且维持环境和培养条件，只要需要，细胞就可以保持在培养中。由于细胞连续生长，因此通常需要在运行过程中去除细胞，以便维持恒定的活细胞密度，其被称为细胞流出。细胞流出含有伴随细胞一起去除的培养基中的产物，其通常被丢弃并因此浪费。因此，在生产阶段期间维持活细胞密度而不伴随或仅伴随最低限度的细胞流出是有利的，并且增加了总产率/运行。

在分批培养中，细胞最初在培养基中进行培养，并且这种培养基不被去除、替换或补充，即，在培养运行结束过程中或之前，不用新培养基“饲喂”细胞。在培养运行结束时收获所需的产物。

对于补料分批培养，通过在运行过程中用新鲜培养基每天一次或多次(或连续地)补充培养基，来增加培养运行时间，即，在培养期过程中用新培养基(“进料培养基”)“饲喂”细胞。补料分批培养可以包括如上所述的各种进料方案和时间，例如每天、每隔一天、每两天等、每天多于一次、或每天少于一次等等。进一步地，补料分批培养可以用进料培养基连续地饲喂。然后在培养/生产运行结束时收获所需的产物。

根据本发明的某些实施方案，哺乳动物细胞可以在灌注培养中进行培养。在异源蛋白质生产过程中，期望具有受控系统，细胞在其中生长至所需的活细胞密度，然后将细胞转换为生长停滞的高生产率状态，其中细胞使用能量和底物来产生目的异源蛋白质而不是细胞生长和细胞分裂。用于实现这个目标的方法，例如温度变换和氨基酸饥饿，并非总是成功的，并且可能对产物质量具有不期望的作用。如本文所述，通过执行常规的细胞流出，在生产阶段过程中的活细胞密度可以维持在期望水平下。然而，这导致丢弃目的异源蛋白质。在生产阶段的细胞生长停滞导致对于细胞流出的需要减少，并且甚至可以使细胞维持在更有生产力的状态下。

在本公开内容的一个方面，提供了在细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述培养基包含有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，其中所述脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和增加的生产率，而无需细胞流出。

在本公开内容的另一个方面，提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在灌注培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述灌注培养基包含一种或多种有效量的选自以下的脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。

在本公开内容的再一个方面，提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在灌注培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述灌注培养基包含有效量的亚油酸。

在本公开内容的另外一个方面，提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在灌注培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述灌注培养基包含有效量的花生四烯酸。

在本公开内容的另一个方面，提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在灌注培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述灌注培养基包含有效量的前列腺素e2。

根据本公开内容的另一个方面，提供了增强灌注细胞培养的比生产率的方法，其包括(a)在灌注生长培养基中培养编码目的蛋白质的重组哺乳动物细胞，直到达到所需细胞密度，并且(b)将有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物引入生长培养基内：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。在一些实施方案中，添加的脂质和/或脂质代谢产物导致细胞生长的抑制，使得达到稳态，从而实现灌注细胞培养的增加的比生产率。

根据本公开内容的再一个方面，提供了用于培养哺乳动物细胞，并且以改善的生产率产生治疗性蛋白质的细胞培养基。细胞培养基包含一种或多种有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。在一些实施方案中，添加的脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和增加的生产率。在一些实施方案中，生长抑制可以导致减少或消除特别是关于灌注细胞培养的细胞流出的需要。细胞培养基可以用于任何细胞培养平台，包括分批培养、补料分批培养和连续培养，包括连续灌注培养。

在上述方面的各种实施方案中，“细胞培养”并无特别限制，并且可以涵盖细胞培养的所有形式和技术，包括但不限于补料分批、分批、灌注、连续、有限、悬浮、贴壁或单层、锚固依赖性和3d培养。本文考虑了细胞培养的任何配置。在一个优选实施方案中，细胞培养是连续灌注细胞培养。

在各种实施方案中，亚油酸的有效量为约1800-2000μm。在其它实施方案中，亚油酸的有效量为约1-5000μm、或约1-2500μm、或约1-1250μm、或约1-1000μm、或约1-800μm、或约1-600μm、或约1-400μm、或约1-200μm、或约1-100μm、或约1-50μm、或约1-25μm。在一个实施方案中，亚油酸为500-2000μm的浓度。

在其它实施方案中，花生四烯酸的有效量为约150-500μm。在另外其它实施方案中，花生四烯酸的有效量为约1-5000μm、或约1-2500μm、或约1-1250μm、或约1-1000μm、或约1-800μm、或约1-600μm、或约1-400μm、或约1-200μm、或约1-100μm、或约1-50μm、或约1-25μm。在一个实施方案中，花生四烯酸为100-600μm的浓度。

在其它实施方案中，前列腺素e2的有效量为约0.001μm至60μm。在另外其它实施方案中，前列腺素e2的有效量为0.000001μm或更多、0.00001μm或更多、0.0001μm或更多、0.001μm或更多、0.01μm或更多、0.1μm或更多、1μm或更多、10μm或更多、20μm或更多、30μm或更多、40μm或更多、50μm或更多、60μm或更多、70μm或更多、80μm或更多、90μm或更多、100μm或更多、150μm或更多、200μm或更多，其中每个范围的上限可以为1000μm或更少。在再其它实施方案中，前列腺素e2的有效量为约1-5000μm、或约1-2500μm、或约1-1250μm、或约1-1000μm、或约1-800μm、或约1-600μm、或约1-400μm、或约1-200μm、或约1-100μm、或约1-50μm、或约1-25μm、或约0.0001-0.001μm，至约0.0005-0.01μm、约0.005-0.1μm、约0.05-1.0μm、约0.5-100μm、约50-1000μm或更多。在一个实施方案中，前列腺素e2为0.0001-100μm的浓度。

在一些实施方案中，培养基包含脂质或脂质代谢产物中的至少两种。在一个实施方案中，培养基包含浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为500-1800μm的亚油酸。在另一个实施方案中，培养基包含与浓度为500-1800μm的亚油酸或浓度为100-150μm的花生四烯酸组合的、浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

在另外一个实施方案中，培养基包含所有三种脂质或脂质代谢产物。在一个实施方案中，培养基包含浓度为500-2000μm的亚油酸、浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

在本公开内容的另一个方面，提供了在细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述培养基包含有效量的以下中的一种或多种：浓度为500-2000μm的亚油酸、浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2，其中所述脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和增加的生产率，而无需细胞流出。

在其它实施方案中，本发明包括依据摩尔比或重量比表示的下述量的亚油酸、花生四烯酸和/或前列腺素e2。这些比率可以用于在细胞培养基中组合亚油酸、花生四烯酸或前列腺素e2中的至少两种，或所有三种添加剂。本领域普通技术人员可以以确定为所添加的总重量的比率的下述比率、或基于其摩尔比，将这些组分以两种或三种添加剂的组合添加。组分可以在相同时间或在不同时间添加。可以使用亚油酸/花生四烯酸/前列腺素e2(亚油酸：花生四烯酸：前列腺素e2)的下述比率：(1)1:1:1；(2)5-1:1:1；(3)10-1:1:1；(4)100-1:1:1；(5)1000-1:1:1；(6)1:5-1:1；(7)1:10-1:1；(8)1:100-1:1；(9)1:1000-1:1；(10)1:1:0.1-0.01；(11)1:1:0.1-0.001；(12)1:1:0.1-0.0001；(13)1:1:0.1-0.00001；(14)1:1:0.1-0.0000001；(15)1-1000:1-1000:1-0.1；(16)1-1000:1-1000:0.1-0.01；(17)1-1000:1-1000:0.1-0.001；(18)1-1000:1-1000:0.1-0.0001；(19)1-1000:1-1000:0.1-0.00001；(20)1-1000:1-1000:0.1-0.0000001；(16)0.1-1000:1-1000:1-0.1；(17)0.01-1000:1-1000:0.1-0.01；(18)0.001-1000:1-1000:0.1-0.001；(19)1-1000:0.1-1000:0.1-0.0001；(20)1-1000:0.01-1000:0.1-0.00001；(21)1-1000:0.001-1000:0.1-0.0000001；(22)1:1:0.1-0.0000001；(23)5-1:1:0.1-0.0000001；(24)10-1:1:0.1-0.0000001；(25)100-1:1:0.1-0.0000001；(26)1000-1:1:0.1-0.0000001；(27)1:5-1:0.1-0.0000001；(28)1:10-1:0.1-0.0000001；(29)1:100-1:0.1-0.0000001；(30)1:1000-1:0.1-0.0000001。在某些实施方案中，本发明可以利用落入5:1:0.000001直到2:0.6:0.1的比率范围内的特定比，其为对应于使用以500-2000μm的亚油酸浓度、以100-600μm的花生四烯酸浓度、以及以0.0001-100μm的前列腺素e2。考虑了其它比率，并且比率的上文列表并不预期以任何方式限制本发明。

在其它实施方案中，本公开内容提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括：(a)在无血清培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；(b)通过用无血清灌注培养基灌注，在生长阶段过程中培养哺乳动物细胞；并且(c)通过用无血清灌注培养基灌注，在生产阶段过程中维持哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含以下中的一种或多种：浓度为500-2000μm的亚油酸、浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2，其中步骤(b)是任选的。在该方法的一个实施方案中，在步骤(c)之前，通过大剂量添加脂质或脂质代谢产物。

本文还提供的是减少灌注细胞培养中的细胞流出和/或增加表达异源蛋白质的灌注细胞培养中的蛋白质生产的方法，其包括：(a)在无血清培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；(b)通过用无血清灌注培养基灌注，在生长阶段过程中培养哺乳动物细胞；并且(c)通过用无血清灌注培养基灌注，在生产阶段过程中维持哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含以下中的一种或多种：浓度为500-2000μm的亚油酸、浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2，其中步骤(b)是任选的。在该方法的一个实施方案中，在步骤(c)之前，通过大剂量添加脂质或脂质代谢产物。

本发明还涵盖的是用非常高的细胞密度接种灌注培养物，并且在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞后立即或不久起始灌注。进一步地，步骤(b)通过用无血清灌注培养基灌注，在生长阶段过程中培养哺乳动物细胞可以是任选的，使得通过用无血清灌注培养基灌注，在生产阶段过程中根据步骤(c)立即培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含以下中的一种或多种：浓度为500-2000μm的亚油酸、浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。优选地，在步骤(c)之前，优选通过大剂量添加，将哺乳动物细胞培养中的脂质浓度调节至所需浓度。

因此，本文还提供的是培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞、和/或减少在灌注细胞培养中的细胞流出、和/或在表达异源蛋白质的灌注细胞培养中增加蛋白质生产的方法，其包括：(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；(b)任选地通过用无血清灌注培养基灌注，在生长阶段过程中培养哺乳动物细胞；并且(c)通过用无血清灌注培养基灌注，在生产阶段过程中维持哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含以下中的一种或多种：浓度为500-2000μm的亚油酸、浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。优选地，在步骤(c)之前，优选通过大剂量添加，将哺乳动物细胞培养中的脂质浓度调节至所需浓度。增加蛋白质生产涵盖在灌注运行内或在一定时间段内增加的蛋白质产物产率。它还涵盖了增加的比蛋白质生产/细胞。

根据本发明的方法，步骤(a)中培养哺乳动物细胞可以限制于在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，并且因此在灌注起始之前不需要包括实际的培养步骤。进一步根据本发明的方法，通过灌注在生产阶段过程中维持哺乳动物细胞，包括通过以恒定的活细胞密度灌注，在生产阶段过程中培养哺乳动物细胞。

一旦达到靶细胞密度，就起始生产阶段。优选地，一旦达到靶细胞密度，就起始步骤(c)。它可以以10x10⁶个细胞/ml至约120x10⁶个细胞/ml或甚至更高的细胞密度起始。优选地，步骤(c)以至少10x10⁶个细胞/ml、至少20x10⁶个细胞/ml、至少30x10⁶个细胞/ml、至少40x10⁶个细胞/ml或至少50x10⁶个细胞/ml的细胞密度开始。最优选地，步骤(c)以约30至约50x10⁶个细胞/ml的细胞密度开始。

如上文已经解释的，本发明的方法可以进一步包括在步骤(c)中，通过细胞流出来维持细胞密度。在这个上下文中提及的细胞密度是活细胞密度，其可以通过本领域已知的任何方法进行确定。例如，支配细胞流出速率的计算可以基于维持与靶vcd相对应的incyte^tm活细胞密度探针(company)或futura^tm生物量电容探针值(仪器)，或每日细胞和活力计数可以经由任何细胞计数装置离线获取，所述装置例如血细胞计数器、vi-cellxr^tm(beckman)、cedexhi-res^tm()或viacount^tm测定(emd)。与对照灌注细胞培养相比，使用本发明的方法减少了细胞流出，其中对照灌注细胞培养是使用不含根据本发明添加的脂质的相同的无血清灌注培养基，在相同条件下培养的灌注细胞培养。更具体地，与对照灌注细胞培养相比，减少了细胞流出，其中对照灌注细胞培养是使用具有以所需浓度添加的脂质的相同的无血清灌注培养基，在相同条件下培养的灌注细胞培养。

出于相同的原因并且允许在生长阶段过程中的生长，在某些实施方案中，本发明的无血清灌注培养基的脂质浓度应该在接种培养基中以及在生长阶段过程中加以避免。因此，步骤(a)的无血清培养基和步骤(b)的无血清灌注培养基应该不包含脂质(即，不包含亚油酸、花生四烯酸或前列腺素e2)。优选地，步骤(a)的无血清培养基和步骤(b)的无血清灌注培养基不包含脂质(即，不包含亚油酸、花生四烯酸或前列腺素e2)。

本发明的无血清灌注培养基的渗透压应该在300至1400mosmol/kg之间，优选在300至500mosmol/kg之间，更优选在330至450mosmol/kg之间，且甚至更优选在360至390mosmol/kg之间的范围内，其中所述渗透压作为mosmol/kg水提供。

灌注培养通常从作为分批培养的接种培养起始。灌注可以立即起始，或者在一天或几天后起始。通常，灌注在细胞培养的第2天时或之后起始。在一个实施方案中，步骤(b)中的灌注在细胞培养的第2天时或之后开始。一旦达到靶细胞密度，就通过将细胞培养基中的亚油酸、花生四烯酸或前列腺素e2中的一种或多种的浓度增加至所需浓度，来诱导生长停滞。优选地，脂质/脂质代谢产物浓度至所需浓度的这种增加是瞬时的，例如通过大剂量添加。在一个实施方案中，一旦达到一定的所需细胞浓度，即在生长阶段结束时，就可以发生在细胞培养中的亚油酸、花生四烯酸和/或前列腺素e2浓度中的这种调节。在下一阶段，即生产阶段过程中，可以通过用无血清灌注培养基灌注来培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含以所需浓度的外源添加的亚油酸、花生四烯酸或前列腺素e2中的一种或多种。还可以从一开始就将脂质/脂质代谢产物加入培养物中，并且因此可以加入用于接种的无血清培养基中，或者在如上所述通过大剂量添加来诱导生长停滞之前，并且因此在达到靶细胞密度之前，加入无血清灌注培养基中。最迟，一旦达到靶细胞密度，就必须将脂质/脂质代谢产物加入无血清灌注培养基中。在另一个实施方案中，在达到靶细胞密度之前，并且在通过增加哺乳动物细胞培养中的脂质/脂质代谢产物来诱导生长停滞之前，达到哺乳动物细胞培养中所需的脂质/脂质代谢产物浓度。

通常，根据本发明的哺乳动物细胞培养包括细胞培养的连续灌注。在灌注已起始后，灌注速率可以增加。通常，较高的灌注速率支持较高的活细胞密度，并且因此允许较高的靶细胞密度。灌注速率可以从小于或等于0.5个容器体积/天增加到5个容器体积/天。优选地，灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到2个容器体积/天。

生物反应器

根据本发明的方法，可以利用任何细胞培养系统、类型或形式，包括但不限于分批、补料分批和连续灌注。

任何细胞灌注生物反应器和细胞保留装置都可以用于灌注培养。用于灌注的生物反应器与用于分批/补料分批培养的生物反应器并无显著不同，除了它们在尺寸方面更紧凑并且连接到细胞保留装置之外。用于将细胞保留在生物反应器内部的方法主要由细胞是附着至表面生长、还是在单细胞悬浮液或细胞聚集物中生长来决定。虽然历史上大多数哺乳动物细胞是附着至表面或基质生长的(异质培养)，但已付出努力使许多工业哺乳动物细胞系适应在悬浮液中生长(均质培养)，这主要是因为悬浮培养更易于扩大规模。因此，在本发明的方法中使用的细胞优选在悬浮液中生长。不限于此，用于在悬浮液中生长的细胞的示例性保留系统是旋转过滤器、外部过滤例如切向流过滤(tff)、交替切向流(atf)系统、细胞沉降(垂直沉降和倾斜沉降)、离心、超声分离和水力旋流器。灌注系统可以分类成两类：基于过滤的系统(例如旋转过滤器、外部过滤和atf)和开放式灌注系统(例如重力沉降器、离心机、超声分离装置和水力旋流器)。基于过滤的系统显示高度的细胞保留能力，并且它并不随着流速而改变。然而，过滤器可能堵塞，并且因此培养运行在长度中受限，或者需要更换过滤器。关于atf系统的实例是来自repligen^tm的xcell^tmatf系统，并且关于tff系统的实例是使用离心泵的来自的tff系统。交叉流过滤器例如中空纤维(hf)或平板过滤器，可以与atf和tff系统一起使用。具体地，由改性聚醚砜(mpes)、聚醚砜(pes)或聚砜(pe)制备的中空纤维可以与atf和tff系统一起使用。hf的孔径的范围可以为几百kda至15μm。开放式灌注系统并不阻塞，并且因此至少在理论上可以无限期地运转。然而，细胞保留的程度在较高的灌注速率下减少。当前，存在可以在工业规模上使用的三种系统：交替切向过滤器(atf)、重力(特别是倾斜沉降器)和离心机。通过kompala和ozturk(cellculturetechnologyforpharmaceuticalandcell-basedtherapies,(2006)，taylor&francisgroup，llc，第387-416页)更详细地描述了适合于异质或均质培养的细胞保留装置，其引入本文作为参考。灌注培养不是真正的稳态过程，只有当细胞流出流从生物反应器中去除时，总细胞和活细胞浓度才能达到稳态。

应该在线监测并实时控制灌注生物反应器中的物理参数，例如ph、溶解氧和温度。细胞密度、活力、代谢产物和产物浓度的测定可以使用离线或在线采样执行。当灌注操作从连续收获和进料开始时，灌注速率通常指收获流速，其可以手动设置为所需值。例如，用于生物反应器的重量控制可以激活进料泵，使得可以维持生物反应器中的恒定体积。可替代地，可以通过将培养物体积泵出高于预定水平来实现水平控制。必须调节生物反应器中的灌注速率，以向细胞递送足够的营养素。随着生物反应器中的细胞密度增加，必须增加灌注速率。

可以例如使用细胞密度测量、ph测量、氧消耗或代谢产物测量来控制灌注速率。细胞密度是用于灌注速率调节的最重要度量。取决于如何进行细胞密度测量，可以每天或实时调节灌注速率。几种在线探针已开发用于估计细胞密度，并且是本领域技术人员已知的，例如电容探针，例如incyte^tm活细胞密度探针(company)或futura^tm生物量电容探头值(仪器)。这些细胞密度探针还可以用于通过从生物反应器中去除过量的细胞，即细胞流出，来将细胞密度控制在所需设定点。因此，细胞流出通过培养中的哺乳动物细胞的特定生长速率来决定。细胞流出通常不被收获，且因此被视为废物。

本发明的方法进一步包括从灌注细胞培养中收获异源蛋白质。本发明涵盖了用于收获且纯化目的蛋白质的任何合适的方法。收获也可以在细胞培养生命周期自始至终或在细胞培养结束时间歇地发生。收获优选从渗透物连续完成，所述渗透物是已通过细胞保留装置回收细胞后产生的上清液。由于与补料分批相比，产物蛋白在灌注生物反应器内部的细胞培养中的更低产物停留时间，因此对蛋白酶、唾液酸酶和其它降解蛋白的暴露降到最低，其可以导致在灌注培养中生产的异源蛋白质的更佳产物质量。

细胞培养基

本发明考虑使用任何合适的细胞培养基，包括商购可得的培养基等等。本文考虑的任何培养基都应该能够通过添加本发明的脂质和/或脂质代谢产物(例如以本文定义的所需和有效浓度的亚油酸、花生四烯酸和前列腺素e2、或其衍生物和/或前体)进行修饰。所使用的基础细胞培养基的类型可以取决于所使用的细胞培养的类型或形式，例如分批、补料分批或灌注。技术人员将能够选择合适的基础培养基。

在一个实施方案中，可以使用无血清灌注培养基。在本发明的方法中使用的无血清灌注培养基可以是化学成分确定的和/或不含水解产物的。不含水解产物意指培养基不含有来自动物、植物(大豆、马铃薯、大米)、酵母或其它来源的蛋白质水解产物。通常，化学成分确定的培养基是不含水解产物的。在任何情况下，无血清灌注培养基都应该不含衍生自动物来源的化合物，特别是从动物衍生且分离的蛋白质或肽(这不包括通过细胞培养产生的重组蛋白质)。优选地，无血清灌注培养基是无蛋白质的、或者无除了重组胰岛素和/或胰岛素样生长因子之外的蛋白质。更优选地，无血清灌注培养基是化学成分确定的，并且是无蛋白质的、或者无除了重组胰岛素和/或胰岛素样生长因子之外的蛋白质。这也适用于步骤(a)的无血清培养基和步骤(b)的无血清灌注培养基。

在再一个方面，本公开内容提供了本发明的无血清灌注培养基用于在生产阶段过程中的灌注培养中培养哺乳动物细胞、或用于减少灌注培养中的总细胞流出体积的用途。可替代地，本公开内容提供了本发明的无血清灌注培养基用于增加灌注细胞培养中的蛋白质产生的用途。

在各种实施方案中，当添加时，培养基中的亚油酸的有效量为约1800-2000μm(根据培养基中的最终浓度)。在其它实施方案中，当加入培养基中时，亚油酸的有效量为约1-5000μm(根据培养基中的最终浓度)、或约1-2500μm、或约1-1250μm、或约1-1000μm、或约1-800μm、或约1-600μm、或约1-400μm、或约1-200μm、或约1-100μm、或约1-50μm、或约1-25μm。在一个实施方案中，亚油酸为500-2000μm的浓度。

在其它实施方案中，花生四烯酸的有效量为约150-500μm。在另外其它实施方案中，花生四烯酸的有效量为约1-5000μm、或约1-2500μm、或约1-1250μm、或约1-1000μm、或约1-800μm、或约1-600μm、或约1-400μm、或约1-200μm、或约1-100μm、或约1-50μm、或约1-25μm。在一个实施方案中，花生四烯酸为100-600μm的浓度。

在其它实施方案中，前列腺素e2的有效量为约0.001μm至60μm。在另外其它实施方案中，前列腺素e2的有效量为0.001μm、10μm、20μm或60μm。在再其它实施方案中，前列腺素e2的有效量为约1-5000μm、或约1-2500μm、或约1-1250μm、或约1-1000μm、或约1-800μm、或约1-600μm、或约1-400μm、或约1-200μm、或约1-100μm、或约1-50μm、或约1-25μm、或约0.0001-0.001μm，至约0.0005-0.01μm、约0.005-0.1μm、约0.05-1.0μm、约0.5-100μm、约50-1000μm或更多。在一个实施方案中，前列腺素e2为0.0001-100μm的浓度或更多。在一个实施方案中，前列腺素e2为0.0001-100μm的浓度。

在一些实施方案中，培养基包含以上述浓度或浓度范围中任一种的组合的脂质或脂质代谢产物中的至少两种。在一个实施方案中，培养基包含浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为500-1800μm的亚油酸。在另一个实施方案中，培养基包含与浓度为500-1800μm的亚油酸或浓度为100-150μm的花生四烯酸组合的、浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

在另外一个实施方案中，培养基包含以上述浓度或浓度范围中任一种的组合的所有三种脂质或脂质代谢产物。在一个实施方案中，培养基包含浓度为500-2000μm的亚油酸、浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养基或方法可以利用这样的细胞培养基，其包括钠/钾比中的降低，以降低细胞生长并改善细胞比生产率(即，增加的钾浓度；又名如图5中叙述的“k-pop”培养基)。例如，于2017年3月31日提交的美国临时申请号62/479,422中描述的培养基可以通过掺入本文所述的脂质和/或脂质代谢产物来利用，并且引入本文作为参考。本文所述的方法和脂质添加剂可以用于进一步减少活细胞密度，细胞生长并改善细胞比生产率。

在其它实施方案中，根据本发明的细胞培养基或方法可以利用维生素添加剂(例如维生素a或乙酸视黄酯)，以减慢灌注细胞培养中的细胞生长。本文所述的方法和脂质添加剂可以用于进一步减少活细胞密度，细胞生长并改善细胞比生产率。此类培养基的实例可以在2017年3月31日提交的美国临时申请号62/479,414中找到，所述美国临时申请整体引入本文作为参考。

本文所述的细胞培养方法考虑了通过其添加，混合，组合或以其它方式获得包含本发明的脂质和/或脂质代谢产物(例如亚油酸、花生四烯酸和/或前列腺素e2、或其衍生物和/或前体)的特定细胞培养基的任何合适方式和时机。例如，本发明的脂质和/或脂质代谢产物可以在细胞培养开始之前或起始时，以其所需和/或有效浓度混合到初始培养基内。在另一个实施方案中，本发明的脂质和/或脂质代谢产物可以在细胞培养接种的下游某个点被添加或以其它方式混合或组合到活跃生长的细胞培养内。在另外一个实施方案中，设想一旦添加，就可以通过继续向细胞培养基中继续增加脂质和/或脂质代谢产物的另外增量，将本发明的脂质和/或脂质代谢产物的最佳有效浓度保持在有效的所需浓度下。在各种实施方案中，脂质和/或脂质代谢产物可以在液体培养基(其可以与细胞培养基相同或不同，和/或可以含有适当有效量的脂质溶剂，例如乙醇、丙酮、苯或其它脂溶性溶剂)中以更高的第一浓度制备，所述浓度被称为“储备浓度”或“储备材料”。为了将细胞培养基调节至脂质和/或脂质代谢产物的所需“工作”浓度，本领域普通技术人员然后将适当体积或数量的储备材料转移至细胞培养基中，以达到所需的工作浓度。在一些情况下，可能期望以避免引入过高局部浓度的脂质和/或脂质代谢产物(或培养基中使用的脂质溶解溶剂)的速率添加储备材料，所述过高局部浓度可能对细胞有害，所述细胞可能与待加入细胞培养中的暂时局部高浓度的储备材料接触。在其它实施方案中，本发明考虑了简单地向细胞培养中添加储备材料的大剂量添加。

另外，关于例如作为储备浓度材料添加本发明的脂质和/或脂质代谢产物的关于细胞培养生物反应器的配置，可以通过与细胞培养基相同的阀或入口点添加脂质和/或脂质代谢产物。在其它实施方案中，可以通过独立的阀或进入点添加脂质和/或脂质代谢产物。细胞培养生物反应器可以被配置为容纳在细胞培养周期的任何时间，包括在细胞培养起始时、在细胞培养的生长阶段过程中以及在细胞培养的生产阶段过程中，添加脂质和/或脂质代谢产物的步骤。生物反应器还可以被配置用于通过共享的阀或端口，或通过分开或独立的阀或端口的脂质和/或脂质代谢产物的单次大剂量添加。生物反应器还可以被配置为容纳通过共享阀或端口，或者通过分开或独立的端口阀向细胞培养基中一系列间歇性添加或连续流添加的脂类和/或脂质代谢产物。本发明的脂质和/或脂质代谢产物的储备浓度的输入可以被配置为通过任何已知手段手动，自动或半自动添加。

表达产物

通过本发明的方法和用途产生的异源蛋白质可以是任何分泌型蛋白质，优选地它是治疗性蛋白质。由于大多数治疗性蛋白质是重组治疗性蛋白质，因此它最优选是重组治疗性蛋白质。关于治疗性蛋白质的实例不限于抗体，融合蛋白，细胞因子和生长因子。

根据本发明的方法在哺乳动物细胞中产生的治疗性蛋白质包括但不限于抗体或融合蛋白，例如fc融合蛋白。其它分泌型重组治疗性蛋白质可以是例如酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段、以及可以充当激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其它多肽和支架。

其它目的重组蛋白质是例如但不限于：胰岛素，胰岛素样生长因子，hgh，tpa，细胞因子例如白介素(il)例如il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18，干扰素(ifn)α、ifnβ、ifnγ、ifnω或ifnτ，肿瘤坏死因子(tnf)例如tnfα和tnfβ、tnfγ，trail；g-csf、gm-csf、m-csf、mcp-1和vegf。还包括的是可以充当激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的促红细胞生成素或任何其它激素生长因子和任何其它多肽的产生。

优选的治疗性蛋白质是抗体或其片段或衍生物，更优选igg1抗体。因此，本发明可以有利地用于产生抗体，例如单克隆抗体、多特异性抗体或其片段，优选单克隆抗体、双特异性抗体或其片段。在本发明的范围内的示例性抗体包括但不限于抗cd2、抗cd3、抗cd20、抗cd22、抗cd30、抗cd33、抗cd37、抗cd40、抗cd44、抗cd44v6、抗cd49d、抗cd52、抗egfr1(her1)、抗egfr2(her2)、抗gd3、抗igf、抗vegf、抗tnfα、抗il2、抗il-5r或抗ige抗体，并且优选地选自抗cd20、抗cd33、抗cd37、抗cd40、抗cd44、抗cd52、抗her2/neu(erbb2)、抗egfr、抗igf、抗vegf、抗tnfα、抗il2和抗ige抗体。

抗体片段包括例如“fab片段”(抗原结合片段＝fab)。fab片段由两条链的可变区组成，所述可变区通过相邻的恒定区保持在一起。这些可以通过例如用木瓜蛋白酶的蛋白酶消化从常规抗体形成，但是类似地，fab片段也可以通过基因工程产生。进一步的抗体片段包括f(ab′)2片段，其可以通过用胃蛋白酶的蛋白酶解切割来制备。

使用基因工程方法，能够产生缩短的抗体片段，其仅由重链(vh)和轻链(vl)的可变区组成。这些称为fv片段(可变片段＝可变部分的片段)。由于这些fv片段缺少两条链通过恒定链的半胱氨酸的共价键合，因此fv片段经常是稳定的。通过例如具有10至30个氨基酸，优选15个氨基酸的短肽片段，来连接重链和轻链的可变区是有利的。以这种方式，获得由肽接头连接的由vh和vl组成的单条肽链。这种抗体蛋白称为单链fv(scfv)。scfv抗体蛋白的实例是本领域技术人员已知的。

根据本发明的优选的治疗性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体通常在一个分子中组合对于靶细胞(例如，恶性b细胞)和效应细胞(例如，t细胞、nk细胞或巨噬细胞)特异性的抗原结合。不限于此，示例性的双特异性抗体为双抗体、bite(双特异性t细胞衔接物)形式和dart(双重亲和力重新靶向)形式。双抗体形式在两条分开的多肽链上分开具有两种抗原结合特异性的重链和轻链的同源可变结构域，其中两条多肽链是非共价结合的。dart形式基于双抗体形式，但它通过c端二硫桥提供了另外的稳定性。

另一种优选的治疗性蛋白质是融合蛋白，例如fc融合蛋白。因此，本发明可以有利地用于产生融合蛋白，例如fc-融合蛋白。此外，根据本发明的增加蛋白质生产的方法可以有利地用于产生融合蛋白，例如fc-融合蛋白。

融合蛋白的效应子部分可以是天然或修饰的异源蛋白质的完整序列或序列的任何部分，或者天然或修饰的异源蛋白质的完整序列或序列的任何部分的组合物。免疫球蛋白恒定结构域序列可以得自任何免疫球蛋白亚型，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1或iga2亚型或类别，例如iga、ige、igd或igm。优选地，它们衍生自人免疫球蛋白，更优选衍生自人igg，且甚至更优选地衍生自人igg1和igg2。fc融合蛋白的非限制性实例是与包含n联糖基化位点的重链免疫球蛋白恒定区的ch2结构域偶联的mcp1-fc、icam-fc、epo-fc和scfv片段等等。可以通过基因工程方法，通过将包含n联糖基化位点的重链免疫球蛋白恒定区的ch2结构域引入包含例如其它免疫球蛋白结构域、酶促活性蛋白部分或效应子结构域的另一个表达构建体内，来构建fc融合蛋白。因此，根据本发明的fc融合蛋白还包含与包含例如n联糖基化位点的重链免疫球蛋白恒定区的ch2结构域连接的单链fv片段。

表达产物的回收和配制

在一个进一步方面，使用本发明的方法提供了产生治疗性蛋白质的方法，并且任选地进一步包括将治疗性蛋白质纯化且配制成药学上可接受的制剂的步骤。

治疗性蛋白质，尤其是抗体、抗体片段或fc-融合蛋白优选作为分泌型多肽从培养基中回收/分离。必须从其它重组蛋白质和宿主细胞蛋白中纯化治疗性蛋白质，以获得治疗性蛋白质的基本上同质的制剂。作为第一步，从培养基中去除细胞和/或微粒细胞碎片。进一步地，例如，通过在免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相hplc、sephadex色谱、以及在二氧化硅或阳离子交换树脂例如deae上的色谱，从污染性可溶性蛋白、多肽和核酸中纯化治疗性蛋白质。用于纯化由哺乳动物细胞表达的异源蛋白质的方法是本领域已知的。

表达载体

在一个实施方案中，使用本发明的方法表达的异源蛋白质由包含编码异源蛋白质的异源多核苷酸的一个或多个表达盒编码。可以将异源蛋白质置于可扩增的遗传选择标记物例如二氢叶酸还原酶(dhfr)、谷氨酰胺合成酶(gs)的控制下。可扩增的选择标记物基因可以在与异源蛋白质表达盒相同的表达载体上。可替代地，可扩增的选择标记物基因和异源蛋白质表达盒可以在不同的表达载体上，但紧密整合到宿主细胞的基因组内。例如，同时共转染的两个或多个载体经常紧密整合到宿主细胞的基因组内。然后通过将扩增剂(例如，对于dhfr的mtx或对于gs的msx)加入培养基内，来介导含有分泌型治疗性蛋白表达盒的遗传区域的扩增。

还可以例如通过将编码异源蛋白质的多核苷酸的多重拷贝克隆到表达载体内，来实现由哺乳动物细胞表达的足够高的稳定水平的异源蛋白质。可以进一步组合如上所述将编码异源蛋白质的多核苷酸的多重拷贝克隆到表达载体内，并且扩增异源蛋白质表达盒。

哺乳动物细胞系

如本文使用的，哺乳动物细胞是适合于产生分泌型重组治疗性蛋白质的哺乳动物细胞系，并且因此也可以称为“宿主细胞”。根据本发明的优选的哺乳动物细胞是啮齿类动物细胞，例如仓鼠细胞。哺乳动物细胞是分离的细胞或细胞系。哺乳动物细胞优选是转化的和/或永生化细胞系。它们适于细胞培养中的连续传代，并且不包括原代非转化细胞或其为器官结构的部分的细胞。优选的哺乳动物细胞是bhk21、bhktk^-、cho、cho-k1、cho-dxb11(也称为cho-dukx或duxb11)、cho-s细胞和cho-dg44细胞或任何此类细胞系的衍生物/后代。特别优选的是cho细胞，例如cho-dg44、cho-k1和bhk21，且甚至更优选的是cho-dg44和cho-k1细胞。最优选的是cho-dg44细胞。还涵盖了哺乳动物细胞，特别是cho-dg44和cho-k1细胞的谷氨酰胺合成酶(gs)缺陷型衍生物。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞，优选cho-dg44细胞、cho-k1细胞、chodxb11细胞、cho-s细胞、chogs缺陷细胞或其衍生物。

哺乳动物细胞可以进一步包含编码异源蛋白质，例如治疗性蛋白质，优选重组分泌型治疗性蛋白质的一个或多个表达盒。宿主细胞还可以是鼠细胞，例如鼠骨髓瘤细胞，例如ns0和sp2/0细胞，或任何此类细胞系的衍生物/后代。表1中也概括了可以用于本发明的含义中的哺乳动物细胞的非限制性实例。然而，那些细胞的衍生物/后代，其它哺乳动物细胞包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴和啮齿类动物细胞系，也可以用于本发明中，特别是用于生产生物药物蛋白。

表1：哺乳动物生产细胞系

¹cap(cevec的羊水细胞生产)细胞是基于原代人羊水细胞的永生化细胞系。它们通过用含有腺病毒5的功能e1和pix的载体转染这些原代细胞而生成。由于真正的人翻译后修饰，cap细胞允许具有极佳生物学活性和治疗功效的重组蛋白质的竞争性稳定生产。

当在无血清条件下，并且任选地在不含动物来源的任何蛋白质/肽的培养基中建立、适应且完全培养时，哺乳动物细胞是最优选的。商购可得的培养基，例如ham的f12(sigma，deisenhofen，德国)、rpmi-1640(sigma)、达尔贝科改良伊格尔培养基(dmem；sigma)、最小必需培养基(mem；sigma)、伊斯科夫改良达尔贝科培养基(imdm；sigma)、cd-cho(invitrogen，carlsbad，ca)、cho-s-invitrogen)、无血清cho培养基(sigma)和无蛋白cho培养基(sigma)是示例性的适当的营养液。培养基中的任一种可以根据需要用各种化合物进行补充，其非限制性实例是重组激素和/或其它重组生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲液(例如hepes)、核苷(例如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其它等价能源、抗生素和微量元素。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必须的补充剂。为了表达可选择基因的遗传修饰细胞的生长和选择，将合适的选择剂加入培养基中。

实施例

方法与材料

除非另有说明，否则下述实施例使用用于灌注细胞培养的下述一般方案和仪器进行。两种不同形式的灌注培养过程用于实施例中描述的实验。一个在生物反应器模型中执行，并且另一个在深孔板模型中执行。

使用具有2l工作体积的3-l玻璃搅拌罐生物反应器设置生物反应器模型。关于生物反应器的保留装置是通过以tff模式运行的磁悬浮离心泵进行再循环的0.2μm中空纤维。起始细胞密度在0.5–1.0e⁶个细胞/ml之间。在峰值下的灌注速率为2vvd。通过lin等人描述了该设置的进一步细节。(biotechnol.prog.，2017，第33卷，no.4，其引入本文作为参考)。

使用24深孔板以8天的运行持续时间进行深孔板模型。靶向20e⁶个细胞/ml的起始细胞密度用于深孔板模型工作。每孔的工作体积为3ml，并且细胞在33℃伴随5％co2、80％湿度和200rpm下在具有5.0cm轨道直径的培养箱中生长。通过将板以1800rpm离心5分钟，去除上清液，并且将细胞以70％体积/天(vvd)的交换速率重悬浮于新鲜培养基中，每天执行培养基交换。设置的进一步细节由lin等人(biotechnol.prog.，2017，第33卷，no4)进行描述。

实施例1.温度变换对活力、活细胞密度和比生产率的作用。

在本实施例中，使用生物反应器模型。较低的温度变换通常用于细胞培养中，以限制或抑制细胞生长。

因此，本实施例调查了温度变换对(a)％活力百分比，(b)活细胞密度(e⁵个细胞/ml)和(c)比生产率(pg/细胞/天)的作用。参见图1。灌注在细胞培养的第2天时开始，并且逐渐增加至2个容器体积/天(2vvd)的更换。箭头指示当温度从37℃转变(至低)为图例中指示值(29℃–正方形或28℃–三角形)的天数(第7天)。

在本实施例中，已发现这种方法减慢了生长，但发现不影响细胞比生产率。在一种细胞系中(数据未显示)，温度变换负面影响产物质量，增加了轻链和碱性种类。如图1(c)中所示，尽管在第7天后(黑色箭头)的温度变换(分别至28℃和29℃)减少了vcd，但低温变换并未显示对细胞比生产率的积极作用(图1(b))。相比之下，本发明的脂质添加剂的使用降低了vcd，同时伴随地增加细胞比生产率。

实施例2.通过外源性亚油酸的细胞生长抑制和细胞生产率增加。

在本实施例中，使用深孔板模型。本实施例证实了当加入灌注培养基中时，亚油酸抑制细胞生长，并且增加cho灌注细胞培养中的细胞比生产率(qp)。参见图3。

亚油酸以各种浓度500μm、900μm、1350μm和1800μm加入细胞培养基中，并且确定了对(a)活细胞密度(e⁵个细胞/ml)、(b)细胞活力百分比(％)和(c)比生产率(qp)的作用。较高浓度的亚油酸显示对抑制细胞生长和增加比生产率的显著影响。例如，在第7天时，以500、900和1350μm的亚油酸证实的细胞比生产率大约相同，并且相对于正常灌注培养基显著增加。以1800μm的亚油酸在活细胞密度、活力和比生产率方面与以500μm的花生四烯酸相似，并且它具有相对于正常的灌注培养基的最显著差异。

该图还指示浓度为500μm的花生四烯酸可以影响灌注细胞培养中的细胞生长和qp。

实施例3.通过外源性花生四烯酸的细胞生长抑制和细胞生产率增加。

在本实施例中，使用深孔板模型。本实施例分析了当加入灌注培养基中时，花生四烯酸的效应。参见图4。

确定了花生四烯酸对细胞培养的(a)活细胞密度(e⁵个细胞/ml)、(b)细胞活力百分比(％)和(c)比生产率(qp)的作用。

可以看出，在正常的灌注培养基中以500μm加入的花生四烯酸浓度，使细胞生长抑制高达31％，并且使细胞比生产率增加46％或更高。因此，花生四烯酸在灌注细胞培养中抑制细胞生长并增加细胞比生产率(qp)。

实施例4.通过外源性花生四烯酸加上升高的钾浓度的细胞生长抑制和细胞生产率增加。

在本实施例中，使用深孔板模型。本实验分析了除了已经很高的钾浓度(即“k-pop”培养基)外，当加入灌注培养基中时，花生四烯酸的效应。参见图5。

确定了以150μm、300μm和500μm加入细胞培养基中的花生四烯酸浓度关于(a)活细胞密度(e⁵个细胞/ml)、(b)细胞活力百分比(％)和(c)比生产率(qp)的效应，所述细胞培养基具有大约34mm的钠浓度和大约94mm的预先存在的高钾浓度，即约0.4的低钠/钾比。

除了高钾浓度外，还具有以150μm至500μm的花生四烯酸浓度的细胞培养基，降低细胞生长并改善细胞比生产率，甚至超出单独的高钾浓度的效应。

本实验证实当加入灌注培养基中时，花生四烯酸抑制细胞的生长并增加细胞比生产率(qp)，甚至加上例如通过升高的钾浓度的可比较效应。

例如，在美国临时申请号62/479,422中描述了低钠/钾培养基(即，或增加的钾浓度)，所述美国临时申请引入本文作为参考。

实施例5.通过外源性前列腺素e2(pge2)的细胞生长抑制和细胞生产率增加。

在本实施例中，使用深孔板模型。本实验分析了当加入灌注培养基中时，前列腺素e2的效应。参见图6。

图6证实了以500μm、pge20.001μm、10μm、20μm和60μm加入灌注培养基中的花生四烯酸浓度对(a)活细胞密度(vcd)(e⁵个细胞/ml)、(b)细胞活力百分比(％)和(c)比生产率(qp)的作用。在每种浓度、vcd和比生产率(即，特定滴度)下，生长是抑制的细胞生长，并且相对于正常灌注培养基中的细胞培养，比生产率在第6天之前增加。

数据似乎也证实了浓度大于0.001μm的前列腺素e2在一定程度上对细胞是毒性的，因为活力在第6天开始降低。尽管高于0.001μm浓度可以观察到一些毒性，但这确实本身并不排除以高于这个阈值的浓度使用前列腺素e2。

本实施例证实了当加入灌注培养基中时，前列腺素e2抑制细胞生长并增加细胞比生产率(qp)。

实施例6.前列腺素e2是生长抑制和增加的细胞生产率的调节剂。

在本实施例中，使用深孔板模型。asa是cox-1和cox-2的抑制剂，其是将花生四烯酸转换以合成前列腺素e2的代谢酶(参见图2)。因此，本实验分析了当加入灌注培养基中时，乙酰水杨酸(asa)的效应。参见图7。

具有抑制剂的培养基显示比正常灌注培养基更高的活细胞密度(a)，具有与正常灌注培养基相同的对比生产率(c)的作用。前列腺素e2通过环氧合酶1和2(cox-1和cox-2)由花生四烯酸合成，因此用乙酰水杨酸(asa)抑制cox-1和cox-2可能阻止来自花生四烯酸的前列腺素e2合成。

不希望受这个理论的束缚，数据提示花生四烯酸(其否则在不存在asa抑制剂的情况下抑制细胞生长并增加生产率)通过首先经由cox-1和cox-2(参见图2)代谢以形成前列腺素e2，而对细胞培养施加其作用，所述前列腺素e2为活性剂。当通过asa抑制cox-1和cox-2时，不产生前列腺素e2，并且花生四烯酸对抑制细胞生长和增加生产率没有作用。

本实验证实了在具有500μm花生四烯酸的灌注培养基中，乙酰水杨酸(asa)对(a)活细胞密度、(b)活力百分比和(c)比生产率的作用。数据提供了前列腺素e2在触发细胞生长抑制和增加细胞比生产率方面有效的证据。

项目

鉴于上文，应了解本发明还涉及下述项目：

1.一种在细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括：在包含有效量的一种或多种脂质或脂质代谢产物的培养基中培养所述哺乳动物细胞，其中所述一种或多种脂质或脂质代谢产物包含500-2000μm亚油酸、100-600μm花生四烯酸、0.0001-100μm前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。

2.项目1的方法，其中所述培养基包含脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体中的至少两种。

3.项目1-2中一项或多项的方法，其中所述培养基包含浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为500-1800μm的亚油酸。

4.项目1-3中一项或多项的方法，其中所述培养基包含与浓度为500-1800μm的亚油酸或浓度为100-150μm的花生四烯酸组合的、浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

5.项目1-4中一项或多项的方法，其中所述培养基包含脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体中的三种。

6.项目1-5中一项或多项的方法，其中所述细胞培养是分批、补料分批或灌注细胞培养。

7.项目1-6中一项或多项的方法，其中所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞、jurkat细胞、293细胞、hela细胞、cv-1细胞或3t3细胞、或这些细胞中任一种的衍生物，其中所述cho细胞可以进一步选自cho-dg44细胞、cho-k1细胞、chodxb11细胞、cho-s细胞和chogs缺陷细胞或其突变体。

8.项目1-7中一项或多项的方法，其中所述异源蛋白质是治疗性蛋白质、抗体或其治疗有效片段。

9.项目8的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段或双特异性抗体。

10.项目1-9中一项或多项的方法，其中所述脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和增加的生产率。

11.项目1-10中一项或多项的方法，其中所述培养基是无血清灌注培养基。

12.项目11的方法，其中所述培养基任选地是(a)化学成分确定的、(b)不含水解产物的、或(c)无蛋白质的，但任选地包括胰岛素和/或胰岛素样生长因子。

13.项目1-12中一项或多项的方法，其中相对于不包括脂质或脂质代谢产物的对照细胞培养中的总生产水平，由细胞培养产生的异源蛋白质的总生产增加至少5-50％。

14.项目1-13中一项或多项的方法，其中相对于不包括脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体的对照细胞培养中的细胞比生产率，所述细胞培养的细胞比生产率(pg/细胞/天)增加至少5-50％。

15.项目1-14中一项或多项的方法，其中将细胞生长抑制在足以使细胞维持稳态的水平下，其具有的活细胞密度相对于不包括脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体的对照细胞培养低至少5-50％。

16.项目1-15中一项或多项的方法，其中将在第2天时的细胞培养改变为灌注细胞培养。

17.项目6和16中一项或多项的方法，其中在灌注已起始之后，灌注速率增加。

18.项目17所述的方法，其中所述灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到5个容器体积/天，或者从小于或等于0.5个容器体积/天增加到2个容器体积/天。

19.项目1-18中一项或多项的方法，其进一步包括从细胞培养中收获异源蛋白质。

20.项目1-19中一项或多项的方法，其中一旦达到10x10⁶个细胞/ml至约120x10⁶个细胞/ml的细胞密度，就将一种或多种脂质或脂质代谢产物或其衍生物加入细胞培养基中。

21.一种使用项目1-20中任一项的方法生产治疗性蛋白质的方法。

22.一种从细胞培养中产生治疗性蛋白质的方法，其包括：

(a)在包含有效量的一种或多种脂质或脂质代谢产物的培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述一种或多种脂质或脂质代谢产物包含500-2000μm的亚油酸、100-600μm的花生四烯酸、0.0001-100μm前列腺素e2、或其衍生物和/或前体，

(b)从细胞培养中收获异源蛋白质。

23.项目22的方法，其中所述培养基包含脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体中的至少两种。

24.项目22-23中一项或多项的方法，其中所述培养基包含浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为500-1800μm的亚油酸。

25.项目22-24中一项或多项的方法，其中所述培养基包含与浓度为500-1800μm的亚油酸或浓度为100-150μm的花生四烯酸组合的、浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

26.项目22-25中一项或多项的方法，其中所述培养基包含脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体中的至少三种。

27.项目22-26中一项或多项的方法，其中所述细胞培养是分批、补料分批或灌注细胞培养。

28.项目22-27中一项或多项的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞、jurkat细胞、293细胞、hela细胞、cv-1细胞或3t3细胞、或这些细胞中任一种的衍生物，其中所述cho细胞可以进一步选自cho-dg44细胞、cho-k1细胞、chodxb11细胞、cho-s细胞和chogs缺陷细胞或这些细胞中任一种的衍生物。

29.项目22-28中一项或多项的方法，其中所述异源蛋白质是治疗性蛋白质、抗体或其治疗有效片段。

30.项目29项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段或双特异性抗体。

31.项目22-30中一项或多项的方法，其中所述一种或多种脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体的有效量在细胞培养期间保持恒定。

32.项目22-31中一项或多项的方法，其中所述培养基是无血清灌注培养基。

33.项目32的方法，其中所述培养基任选地是(a)化学成分确定的、(b)不含水解产物的、或(c)无蛋白质的，但任选地包括胰岛素和/或胰岛素样生长因子。

34.项目22-33中一项或多项的方法，其中相对于不包括脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体的对照细胞培养中的总生产水平，由细胞培养产生的异源蛋白质的总生产增加至少5-50％。

35.项目22-34中一项或多项的方法，其中相对于不包括脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体的对照细胞培养中的细胞比生产率，所述细胞培养的细胞比生产率(pg/细胞/天)增加至少5-50％。

36.项目22-35中一项或多项的方法，其中相对于不包括脂质或脂质代谢产物或衍生物和/或前体的对照细胞培养，所述活细胞密度减少至低至少5-50％。

37.项目22-36中一项或多项的方法，其中将在第2天时的细胞培养改变为灌注细胞培养。

38.项目27和37中的一项或多项的方法，其中在灌注已起始之后，灌注速率增加。

39.项目38所述的方法，其中所述灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到5个容器体积/天。

40.项目38项所述的方法，其中所述灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到2个容器体积/天。

41.项目22-40中一项或多项的方法，其进一步包括以连续方式从细胞培养中收获异源蛋白质。

42.项目22-41中一项或多项的方法，其中一旦达到10x10⁶个细胞/ml至约120x10⁶个细胞/ml的细胞密度，就将一种或多种脂质或脂质代谢产物或其衍生物加入细胞培养基中。

43.一种包含一种或多种脂质或脂质代谢产物的灌注细胞培养基，所述脂质或脂质代谢产物包含500-2000μm的亚油酸、100-600μm的花生四烯酸、0.0001-100μm的前列腺素e2、或其衍生物和/或前体。

44.项目43的灌注细胞培养基，其包含浓度为100-300μm的花生四烯酸和浓度为500-1800μm的亚油酸。

45.项目43-44中一项或多项的灌注细胞培养基，其包含与浓度为500-1800μm的亚油酸或其衍生物、或浓度为100-150μm的花生四烯酸或其衍生物组合的、浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2。

46.项目43-45中一项或多项的灌注细胞培养基，其包含浓度为500-2000μm的亚油酸或其衍生物、浓度为100-300μm的花生四烯酸或其衍生物、浓度为0.0001-0.0009μm的前列腺素e2或其衍生物。

47.项目43-46中一项或多项的灌注细胞培养基，其中所述培养基是无血清灌注培养基。

48.项目43-47中一项或多项的灌注细胞培养基，其中所述培养基任选地是(a)化学成分确定的、(b)不含水解产物的、或(c)无蛋白质的，但任选地包括胰岛素和/或胰岛素样生长因子。

49.项目43-48中一项或多项的灌注细胞培养基用于在灌注培养中培养哺乳动物细胞的用途。

50.项目43-48中一项或多项的灌注细胞培养基用于抑制培养物生长和增加生产率的用途。

51.项目50的用途，其中相对于不包括脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体的对照细胞培养中的总生产水平，由细胞培养产生的异源蛋白质的总生产增加至少5-50％。

52.项目50-51中一项或多项的用途，其中相对于不包括脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体的对照细胞培养中的细胞比生产率，所述细胞培养的细胞比生产率(pg/细胞/天)增加至少5-50％。

53.项目50-52中一项或多项的用途，其中相对于不包括脂质或脂质代谢产物或衍生物和/或其前体的对照细胞培养，所述生长抑制足以具有低至少5-50％的活细胞密度。