白介素-15活性的拮抗剂肽的制作方法

本发明涉及分子药理学和人类医学的领域，特别地涉及获得具有比以前所鉴定的肽拮抗剂更大的效应的白介素-15(il-15)活性的拮抗剂肽，其衍生自所述细胞因子。由于其生物学活性，本发明的拮抗剂肽可用于治疗与il-15和/或il-15受体的α亚基(il-15rα)的非调控表达相关的疾病。

现有技术

il-15最初被鉴定为t细胞的激活因子(grabstein,k.h.等人,science1994,264,965-968；burton,j.d.等人,proc.natl.acad.sci.usa1994,91,4935-4939)。尽管il-15的信使核糖核酸(mrna)的分布广泛，但是蛋白质的表达在转录后水平上强烈地受到调控(bamfordrn等人,j.immunol1998,160:4418-4426；kurysg等人,jbiolchem2000,275:30653-30659)。该细胞因子可以作为膜内在蛋白质(musso等人,blood1999,93:3531-3539)或以可溶形式进行表达，分别充当受体或配体。作为膜内在蛋白质进行表达的il-15通过与可溶性il-15rα相互作用而触发反向信号传导的机制。这包括促炎细胞因子(肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素-6(il-6)、白介素-8(il-8))的分泌和细胞迁移(budagianv.等人,j.biolchem2004,40:42192-42201)。

il-15作为配体的生物学效应是通过与由α、β和γc亚基构成的细胞膜三聚体受体的结合来介导的。这些亚基可以在同一个细胞中共表达，或者可以发生与α亚基相结合的il-15被呈递给只表达β和γc亚基的邻近细胞，已知为反式信号传导的机制(burkettp.r.等人,jexp.med2004,200:825-834)。尽管β和γc亚基是与其他细胞因子共享的，但是il-15rα对于il-15是特异性的(girijg等人,emboj1995,14:3654-63)。

已经将il-15的非调控表达与自身免疫疾病和炎性疾病例如克罗恩病(kirmani.,am.j.gastroenterol.1996,91:1789-1794)、银屑病(rückertr.j.immunol2000,165:2240-2250)、某些类型的白血病(yamaday.leukemiaandlymphoma1999,35:37-45)和类风湿性关节炎(ra)(mclnnesi.b.,immunologytoday1998,19:75-79)的发病机理和发展相联系。

在mclnnes和ziolkowska的工作中所显示的实验证据支持il-15作为有吸引力的治疗靶标，特别是在ra中。这些证据包括：在滑膜液中升高的il-15浓度，在滑膜细胞中增加的表达，tnf–α、il-6和il-17分泌的刺激，和t细胞迁移至ra患者的滑膜液(mclnnesi.b.等人,natmed1997,3:189-195；ziolkowskam.等人,jimmunology2000,164:2832-2838)。在该疾病的动物模型中，yoshihara等人证明，il-15在对于该细胞因子来说转基因的小鼠中加重由胶原所诱导的关节炎(yoshiharak.等人,eurj.immunol.2007,37:2744-2752)。所有这些要素暗示，il-15的拮抗剂在治疗ra和其他与该细胞因子的过表达相关的自身免疫疾病和炎性疾病中可能是有用的。

在这个意义上，开发了在asp⁵⁶和gln¹⁵⁶处具有置换的il-15的突变蛋白质(经突变的蛋白质)，和针对受体亚基的抗体，其作为拮抗剂分子起作用(专利号us6,177,079、us6,168,783、us6,013,480、us6,001,973、us9,706,931和国际专利申请号wo9741232)。由bernard等人所描述的其他突变蛋白质可以作为il-15的激动剂或拮抗剂起作用(bernardj.等人,jbiolchem2004,279:24313-24322)。然而，这些实体未能有助于用于治疗引起il-15过表达的疾病的商购可得的药品。

在2006年，鉴定出了阻断该细胞因子与il-15rα相互作用的il-15的拮抗剂肽(国际专利申请号wo2006/029578)。由该肽所取得的半抑制浓度(ic50)为130μm。在古巴专利申请号2008-0184中所反映的所述拮抗剂的优化研究使得能够鉴定出更有活性(ic5024μm)但比起始肽化合物更难溶解的肽。该低的溶解度使得将其开发为药品变得困难。

考虑到il-15对il-15rα的高亲和力，需要鉴定出具有比已经描述的拮抗剂更高的抑制活性的分子实体，其使得能够获得在ra和其他与il-15的过表达相关的自身免疫疾病和炎性疾病的治疗中更有效的药品。

发明详述

本发明对解决上面提及的问题做出了贡献，通过提供其特征在于包含标识为seqidno.5或seqidno.12的氨基酸序列的il-15活性的拮抗剂肽，或者这些肽的同二聚体。

这些肽拮抗剂比在专利申请号wo2006/029578中所描述的更有活性，因为其具有比起始拮抗剂更小的ic50。该优化通过在原始拮抗剂中将一个或两个l构象残基置换为其相应的d构象残基来取得。在本发明中鉴定出的其他拮抗剂是在最有活性的单体之间形成同二聚体的结果，所述单体通过存在于它们中的游离半胱氨酸而以化学方式相连接。为了本发明，il-15活性的拮抗剂为阻断该细胞因子与其受体的相互作用(从而抑制该细胞因子的生物学效应)的那种实体。

在本发明的背景下，具有标识为seqidno.5或seqidno.12的氨基酸序列的肽的同二聚体为其中所述肽的两个相同单体以化学方式相连接的那种肽。由于已知将d氨基酸(d-aa)引入到肽中增加其稳定性，因而令人惊讶的是，在本发明中，一些该类型的置换取消了起始肽(在本发明中命名为肽1)所具有的作为il-15活性的拮抗剂的能力。在本发明中，产生了10种具有l氨基酸(l-aa)被d-aa改变的肽变体，其在用依赖于il-15的ctll-2细胞系的生物学活性测定法中进行了评价。还获得了标识为seqidno.5的肽的同二聚体。另外，设计了两种每个具有两个d-aa的肽(肽13和肽15)，并且通过化学合成获得了相应的二聚体(肽14和肽16)。

通常，将小尺寸的肽应用作为il-15的拮抗剂具有选择性地阻断il-15与il-15rα的结合的优点；其中由于与所述受体亚基的相互作用而抑制该细胞因子的效应。

通过elisa类型的免疫测定法来评价所述肽与il-15rα结合的能力，并且在ctll-2细胞系上的细胞增殖测定法中测定其对于抑制il-15的生物学活性的效应(rodríguez-等人,biotecnaplic2014,31:291-6)。另外，通过用分离自ra患者的滑膜液的细胞的离体测定法来测定这些肽对于抑制两种炎性细胞因子(tnf-α和il-6)的分泌的效应。

在这些实验中证明了，只有四种变体(命名为肽5、肽12、肽13和肽14)在抑制由il-15所诱导的ctll-2细胞增殖方面和在il-6和tnf-α的分泌方面比肽1更有活性。这些肽是完全可溶的，这相对于古巴专利申请号2008-0184的肽而言具有优点。肽12显示了最大的效应，具有8μm的ic50。在ra患者的滑膜细胞中抑制由il-15rα所诱导的tnf-α和il-6的分泌方面，该肽也比原始拮抗剂(肽1)更有活性。

这些拮抗剂肽(肽5、肽12、肽13和肽14)可以抑制通过膜il-15的反向信号传导的效应(由budagian等人在2004年所述及的)，因为其与il-15rα相结合，如在本发明中所描述的。以该方式，它们可用于抑制可溶性il-15rα与在肿瘤细胞膜上表达的il-15的结合。在本发明的一个实施方案中，所述肽通过遗传操作或通过化学合成来获得。

在另一个方面，本发明披露了编码包含标识为seqidno.5或seqidno.12的氨基酸序列的肽的核酸，因为其表达产物能够与il-15rα或其可溶性级分相结合，并且抑制该细胞因子的生物学活性。可以使用包含所述核酸序列的载体作为备选方案来表达本发明的拮抗剂肽序列。

本发明的另一个方面为药用组合物，其包含具有标识为seqidno.5或seqidno.12的氨基酸序列的il-15的拮抗剂肽，或者这些肽之一的同二聚体，和在药学上可接受的赋形剂。在本发明中，所述组合物将可以是局部施加的，以用于治疗在皮肤中表现出的且在其损伤中检测到il-15过表达的疾病，例如银屑病和皮肤t细胞淋巴瘤。

在本发明的一个实施方案中，所述药用组合物的特征在于，其包含编码包含标识为seqidno.5或seqidno.12的氨基酸序列的肽的核酸，和在药学上可接受的赋形剂。

本发明的另一个方面是包含标识为seqidno.5或seqidno.12的氨基酸序列的肽或者这些肽的同二聚体在制备药物中的用途。在本发明的一个实施方案中，所述药物用于治疗与il-15的过表达相关的疾病。在一个特别的实施方案中，所述与il-15的过表达相关的疾病为从由下列各项组成的组中选择的自身免疫疾病：ra、克罗恩病、溃疡性结肠炎和银屑病。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗前列腺癌或肾癌。

本发明还考虑了用于治疗与il-15的过表达相关的疾病的方法，其包括向有此需要的个体施用治疗有效量的包含具有标识为seqidno.5或seqidno.12的氨基酸序列的肽或者这些肽的同二聚体的药用组合物。在另一个方面，所述方法可以牵涉施用包含编码具有序列seqidno.5或seqidno.12的肽的核酸的药用组合物。在一个特别的实施方案中，用本发明的方法进行治疗的与il-15的过表达相关的疾病为从由下列各项组成的组中选择的自身免疫疾病：ra、克罗恩病、溃疡性结肠炎和银屑病。

在本发明的治疗ra的方法中，单独地或者与某一其他药品例如甾类抗炎药物(例如皮质类固醇)和改变疾病进程的药物(例如，氨甲蝶呤)相组合地施用所选择的拮抗剂肽。

在另一个方面，本发明披露了用于治疗前列腺癌或肾癌的方法，其包括向有此需要的个体施用治疗有效量的包含seqidno.5或seqidno.12的肽、这些肽的同二聚体或者编码具有序列seqidno.5或seqidno.12的肽的核酸的药用组合物。

附图简述

图1.通过elisa类型的系统检测的所鉴定的肽与il-15rα的结合。

图2.所鉴定的肽对于由il-15所诱导的ctll-2细胞系增殖的效应。a.肽3、4、6、7、10、11和15的评价。b.肽2、5、8、9、12、13、14和16的评价。在所有试验中都评价肽1。

图3.在用为了该测定法而选择的肽进行治疗的患者的滑膜细胞上清液中检测到的tnf-α和il-6水平。对于tnf-α，评价了三名患者的样品(p1-p3，图版a-c)。对于il-6，评价了一名患者的样品(图版d)。

实施方案详述/实施例

实施例1.包含d-氨基酸的肽的合成

设计

从在本发明的序列表中标识为seqidno.1的肽(也称为肽1)开始，设计了一组肽，其中进行了每个l构象的氨基酸残基被具有d构象的相同残基的点置换。在本发明中，从肽2至肽11相应于以相同编号(seqidno.2-seqidno.11)进行标识的氨基酸序列。还设计了seqidno.5的肽的化学同二聚体，其被命名为肽12。

另外，设计了具有两个d-aa的肽，以组合导致相对于肽1而言最大拮抗剂效应的氨基酸残基。因此，设计了肽13(其序列相应于seqidno.12)和肽15(其序列相应于seqidno.13)。此外，还设计了肽14(作为seqidno.12的肽的同二聚体)和肽16(作为seqidno.13的肽的同二聚体)。

肽的合成

在注射器中通过fmoc/tbu策略来合成单体肽。使用0.54mmol/g的fmoc-am-mbha树脂，接着是具有机械搅动的合成实验方案(fieldgb和noblerl.int.j.peptideproteinres.1990,35(3):161-214)。在所希望的变体中，肽的二聚体化通过用20％的二甲亚砜氧化半胱氨酸来进行(andreud.等人,peptidesynthesisprotocols.humanapressinc.:totowa,newjersey,1994,91-116)。所有肽都通过反向色谱法(rp-hplc)进行纯化，并且通过质谱法(esi-ms)证实其序列。所有肽都以大于95％的纯度获得，并且在所获得的质量和根据相应的氨基酸序列预期的质量之间具有一致性，如在表1中所看出的。

表1.所获得的肽变体的表征

实施例2.所述肽与il-15rα结合的能力的评价

一旦获得并表征了合成肽，就测定其与il-15rα结合的能力。该评价通过elisa类型的测定法来进行。此外，还计算了每种肽所具有的对于il-15/il-15rα复合物形成的抑制的％。关于elisa类型的测定法的程序和用于计算il-15/il-15rα复合物形成的抑制的％的公式均详细描述在santos等人于2012年发表的文章(santosa.等人,j.pept.sci.2012,18:25-29)中。

如在图1中所观察到的，所评价的所有肽都识别固定化在elisa平板上的il-15rα。无论是在起始拮抗剂肽中l-aa被d-aa置换还是所设计的新肽中的一些的化学二聚化都不影响这些肽实体与il-15rα结合的能力。

对于肽5、肽12、肽13和肽14获得了最大的il-15/il-15rα复合物形成的抑制的％，分别为92％、96％、89％和92％。这些抑制的％比由santos等人于2012年对于肽1所报道的更大，后者为70％。

实施例3.所述肽对于ctll-2细胞系增殖的效应

ctll-2细胞系增殖依赖于il-15。与il-15或与其受体亚基相结合的分子实体抑制该细胞系的增殖。为了评价在本发明中设计和获得的肽的拮抗剂能力，遵循由santos等人于2012年所描述的程序。在图2a和2b中概括了所鉴定的肽对于由il-15所诱导的ctll-2细胞系增殖的效应。在所有试验中都包括肽1。图2a收集了在该生物学活性测定法中显示出与肽1相似的行为的那些合成肽的结果。另一方面，图2b显示了在具有比肽1更大的il-15拮抗剂效应的肽存在下所述细胞系增殖的行为。

此外，该比色测定法的施行还使得能够计算每种肽的ic50，对于300pg/ml的固定的il-15浓度。在表2中显示了对于每种肽的ic50的值。对于l构象的残基被d构象的残基置换的产物，我们发现了显示出与原始肽相等或更小的拮抗剂效应的肽，例如肽3、肽4、肽6、肽7、肽10、肽11和肽15，如在所述表中看出的。这些肽具有与由肽1所展示的相等或更大的ic50。而肽2、肽5、肽8、肽9、肽12、肽13、肽14和肽16显示出比肽1更大的拮抗剂效应(更小的ic50)。

表2.在ctll-2细胞系的细胞增殖测定法中所评价的所述肽的ic50值

在该测定法中，肽12(seqidno.5的肽的化学同二聚体)显示了对于由il-15所诱导的增殖的最大拮抗剂效应，其具有l-ala被d-ala的点置换。在该肽中，cys残基参与在两个单体之间的二硫键的形成。该肽的活性是其单体形式(肽5)的三倍，和是原始肽(肽1)的16倍。在其序列中包含两个d-aa的肽13的活性与肽5一样，即比肽1更有活性。然而，具有两个d-aa的另一个变体(肽15)的活性比肽1低。

与在ctll-2细胞上获得的结果相一致，具有更大拮抗剂效应的肽(肽5、肽12、肽13和肽14)显示出比对于肽1所描述的更高的il-15/il-15rα复合物形成的抑制的百分比。

总体而言，所获得的结果表明，并非显而易见的是，从肽1开始用d-aa置换l-aa有助于更大的il-15的拮抗剂效应，虽然已知将d-aa引入到肽中改善其稳定性。在所有可能的残基中，仅丙氨酸的置换保证了该效应。也不能预期双重的l-aa被d-aa改变将会改善作为拮抗剂的能力，因为在其序列中包含两个d-aa的肽13和肽15显示出相反的行为。

实施例4.所选择的肽对于在ra患者的滑膜细胞中tnf-α和il-6的分泌的效应的评价

已知il-15可以是用于治疗ra的有吸引力的靶标。该细胞因子诱导其他归类为炎性的细胞因子例如tnf-α和il-6的表达。针对这两种蛋白质已经开发出了许多药品，其目前是由美国食品与药品管理局批准的用于治疗ra的生物学疗法。

考虑到这些前例，重要的是通过用ra患者的滑膜细胞的离体测定法来评价il-15的拮抗剂对于tnf-α和il-6的分泌的效应。为了测定所选择的肽对于tnf-α的分泌的效应，进行先前所描述的程序(santosa.等人,j.pept.sci.2012,18:25-29)。tnf-α的水平通过商购可得的elisa类型的免疫测定法(r&d,usa)来测定。该测量在三名ra患者(p1、p2、p3)的滑膜细胞培养物的上清液中进行。

此外，还评价了相同的肽对于由可溶性il-15rα与存在于ra患者(p1)的滑膜细胞膜上的il-15的结合所介导的il-6的分泌的效应，依照在先前的报道中所描述的(machadoa.c.等人,arthritis.2012,articleid943156)。所述测定法在96-孔平板上进行，其中温育2×10⁵个细胞/孔，用或不用il-15rα(100ng/ml)进行刺激，并且用100μg/ml的所选择的肽(肽1、5、12、13和14)进行处理。在48小时的温育后，收集培养物的上清液，并且通过商业elisa系统(r&d,usa)来测定il-6的水平。

如在图3中所显示的，在抑制tnf-α的分泌(图3a、3b和3c)和il-6的分泌(图3d)方面，为了该测定法所选择的肽5、肽12、肽13和肽14比原始拮抗剂(肽1)更有活性。

序列表

<110>centerofgeneticengineeringandbiotechnology

<120>白介素-15活性的拮抗剂肽

<130>il15antagonistd-aa

<140>cu2017-0177

<141>29.12.2017

<160>13

<170>patentinver.2.1

<210>1

<211>10

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>1

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>2

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽2-lys1为d-氨基酸

<400>2

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>3

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽3-val为d-氨基酸

<400>3

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>4

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽4-thr为d-氨基酸

<400>4

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>5

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽5-ala为d-氨基酸

<400>5

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>6

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽6-met为d-氨基酸

<400>6

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>7

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽7-lys6为d-氨基酸

<400>7

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>8

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽8-cys为d-氨基酸

<400>8

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>9

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽9-phe为d-氨基酸

<400>9

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>10

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽10-leu9为d-氨基酸

<400>10

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>11

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽11-leu10为d-氨基酸

<400>11

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>12

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽13-lys1和ala为d-氨基酸

<400>12

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510

<210>13

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:肽15-ala和cys为d-氨基酸

<400>13

lysvalthralametlyscyspheleuleu

1510