一种基因组DNA提取试剂盒和方法与流程

本发明属于分子生物学实验技术领域，具体涉及一种基因组dna提取试剂盒和方法，更具体地，涉及一种植物、真菌、细菌等基因组dna提取试剂盒和方法。

背景技术：

随着分子生物学的快速发展，基因组dna的提取以及pcr技术在生物学相关的研究领域中应用越来越广泛，例如分子标记鉴定、突变体鉴定、遗传多样性分析、基因克隆等，而且基因组dna的提取效率直接影响实验进程。传统的基因组dna提取方法主要有sds法和ctab法，首先通过液氮研磨将样品进行破壁处理，利用苯酚、氯仿等有机溶剂将蛋白质与dna进行分离，最后用无水乙醇或者异丙醇沉淀dna。传统方法在基因组dna提取过程中需要购买液氮，没有研磨仪的实验室需要用研钵进行研磨，样品dna易交叉污染，而且苯酚、氯仿有机溶剂对人体健康都是有危害的。传统的提取方法实验时间久，成本高，效率低，易污染，具有一定的危险性。目前很多生物公司针对不同的实验样品都有相应的试剂盒，但是大都价格昂贵，且一般只适用于植物、真菌或细菌中的某一类，通用性不强。在一些分子鉴定实验中，需要对大量样品的基因组dna进行快速提取。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明一方面提供一种基因组dna提取试剂盒，包括溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和吸附柱，其中：

溶液a：50mmtris-hcl，50mmedta，10％sds，2mnacl，n-月桂酰肌氨酸钠3g/100ml；

溶液b：3mnaac，ph5.2；

溶液c：异丙醇；

溶液d：75％的乙醇；

溶液e：含有50μg/mlrna酶的ddh2o。

本发明的另一方面提供一种基因组dna提取方法，其利用本发明第一方面所述的试剂盒进行提取，具体包含以下步骤：

(1)将20～50mg植物、真菌或细菌菌体样品加入到1.5ml的离心管中；

(2)加入400～600μl的溶液a振荡混匀；

(3)在90-95℃下水浴加热10min，冷却至室温；

(4)12000rpm离心1min，取350μl上清液至新的离心管中；

(5)加入35μl的溶液b，颠倒混匀，加入350μl的溶液c，颠倒混匀，室温静置2min；

(6)将750μl混合液转移至吸附柱中，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

(7)在吸附柱中加入650μl溶液d，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，9000rpm再次离心30s，将吸附柱转移至新的离心管中，打开吸附柱盖子，放置2min；

(8)向吸附柱中加入30μl50℃预热的溶液e，静止3min后，12000rpm离心1min，获得基因组dna。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤(2)中加入400μl的溶液a。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤(3)中水浴温度为94℃。

在本发明的一些具体实施方案中，所述样本为植物叶片组织。

在本发明的一个具体实施方案中，所述植物为水稻。

在本发明的一个具体实施方案中，所述植物为小麦。

在本发明的一个具体实施方案中，所述植物为玉米。

在本发明的一个具体实施方案中，所述植物为棉花。

在本发明的一个具体实施方案中，所述植物为番茄。

在本发明的一些具体实施方案中，所述样本为真菌菌丝。

在本发明的一个具体实施方案中，所述真菌为禾谷镰刀菌。

在本发明的一个具体实施方案中，所述真菌为草酸青霉菌。

在本发明的一个具体实施方案中，所述真菌为葡萄球座菌。

在本发明的一个具体实施方案中，所述真菌为橘青霉菌。

在本发明的一些具体实施方案中，所述样本为离心后收集的细菌菌体。

在本发明的一个具体实施方案中，所述细菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

在本发明的一个具体实施方案中，所述细菌为枯草芽孢杆菌。

本发明的有益效果

本发明提供的快速提取基因组dna的试剂盒和方法，将其用于植物、真菌、细菌基因组dna的提取，利用其良好的生物降解性特点，直接破碎细胞壁，避免了传统真菌dna提取方法中繁琐的物理破除细胞壁的过程，极大简化了dna的提取。

本发明的基因组dna提取方法，与传统方法相比还具有以下优点：

①研磨无需研磨仪等仪器设备，无需购买液氮，实验成本低，安全可靠，有效避免了传统基因组dna提取过程中因实验材料研磨造成的污染。

②无需氯仿、苯酚等有毒试剂，减小了对人体的伤害。实验过程中，操作温和，避免了基因组dna的损伤。

③提取基因组dna方便快捷，整个提取过程只需25min左右，提高了实验效率。

用该发明提取的植物、真菌和细菌基因组dna总量在3μg-90μg之间，浓度和纯度都满足后续pcr反应的要求，可用于各种分子生物学实验。

附图说明

图1示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的禾谷镰刀菌基因组dna琼脂糖凝胶电泳图。

图2示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的水稻基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图3示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的小麦基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图4示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的玉米基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图5示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的棉花基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图6示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的辣椒基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图7示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的番茄基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图8示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的禾谷镰刀菌基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图9示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的草酸青霉菌基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图10示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的葡萄球座菌基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图11示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的菌青霉基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图12示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的大肠杆菌基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图13示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的枯草芽孢杆菌基因组dna浓度、od260/280比值及峰图。

图14示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的植物基因组dna为模板进行pcr产物琼脂糖凝胶电泳图。

图15示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的真菌基因组dna为模板进行pcr产物琼脂糖凝胶电泳图。

图16示出了利用本发明的试剂盒和方法提取的细菌基因组dna为模板进行pcr产物琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实验材料有植物叶片、真菌菌丝和细菌菌液，植物包括水稻、小麦、玉米、棉花、辣椒和番茄，真菌包括禾谷镰刀菌、草酸青霉菌、葡萄球座菌和橘青霉，细菌包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，实验材料均由上海市农业科学院提供。实验仪器主要有水浴锅、高速离心机、nanodrop2000、pcr仪、琼脂糖凝胶电泳仪、紫外凝胶成像仪。

实施例1试剂盒制备

本实施例提供一种试剂盒，包括溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和吸附柱，其中：

溶液a：50mmtris-hcl，50mmedta，10％sds，2mnacl，n-月桂酰肌氨酸钠3g/100ml；

溶液b：3mnaac，ph5.2；

溶液c：异丙醇；

溶液d：75％的乙醇；

溶液e：含有50μg/mlrna酶的ddh2o。

按常规溶液配制方法配制即可。

实施例2植物基因组dna的提取

(1)分别取约20～50mg水稻、小麦、玉米、棉花、辣椒和番茄六种植物的叶片，剪碎后，加入至1.5ml离心管中；

(2)加入400μl的溶液a；

(3)在94℃下水浴加热10min，每隔3min颠倒混匀一次；

(4)冷却至室温后，12000rpm离心1min，取上清液350μl至新的离心管中；

(5)加入35μl的溶液b，颠倒混匀，加入350μl溶液c，颠倒混匀，室温放置2min；

(6)将750μl混合液全部转移至吸附柱中，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

(7)在吸附柱中加入650μl溶液d，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，9000rpm再次离心30s，将吸附柱转移至新的离心管中，打开吸附柱盖子，室温放置2min；

(8)向吸附柱中加入30μl50℃预热的溶液e，静置3min后，12000rpm离心1min，获得植物基因组dna，-20℃保存。

实施例3真菌基因组dna的提取

(1)分取20～50mg禾谷镰刀菌、草酸青霉菌、葡萄球座菌和菊青霉四种真菌的菌丝，加入至1.5ml离心管中，

(2)加入400μl的溶液a；

(3)在94℃下水浴加热10min，每隔3min颠倒混匀一次；

(4)冷却至室温后，12000rpm离心30s，取上清液350μl至新的离心管中；

(5)加入35μl的溶液b，颠倒混匀，加入350μl溶液c，颠倒混匀，室温放置2min；

(6)将750μl混合液全部转移至吸附柱中，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

(7)在吸附柱中加入650μl溶液d，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，9000rpm再次离心30s，将吸附柱转移至新的离心管中，打开吸附柱盖子，室温放置2min；

(8)向吸附柱中加入30μl50℃预热的溶液e，静置3min后，12000rpm离心1min，获得真菌基因组dna，-20℃保存。

实施例4细菌基因组dna的提取

(1)分别取1.5ml大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌液于2ml离心管中，10000rpm离心2min，去上清；

(2)加入400μl的溶液a；

(3)在94℃下水浴加热10min，每隔3min颠倒混匀一次；

(4)冷却至室温后，12000rpm离心1min，取上清液350ul至新的离心管中；

(5)加入35μl的溶液b，颠倒混匀，加入350μl溶液c，颠倒混匀，室温放置2min；

(6)将750μl混合液全部转移至吸附柱中，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

(7)在吸附柱中加入650μl溶液d，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，9000rpm再次离心30s，将吸附柱转移至新的离心管中，打开吸附柱盖子，室温放置2min；

(8)向吸附柱中加入30μl50℃预热的溶液e，静置3min后，12000rpm离心1min，获得细菌基因组dna，-20℃保存。

实施例5dna样品的电泳分析和含量测定

当实施例2、3、4所述方法提取的植物、真菌和细菌基因组dna完全溶解后，用紫外分光光度计nanodrop2000对所提基因组dna样品的浓度进行检测，检测结果如图1～13所示。

由图1～13可知，用本发明方法提取的植物、真菌和细菌基因组dna在浓度和纯度上均满足实验要求，可用于后续的pcr扩增实验。

实施例6pcr扩增实验

反应体系：总体积20μl，10×buffer(含mg²⁺)2μl，dntps(10mmol/l)0.5μl，正向引物(10umol/l)1μl，反向引物(10umol/l)1μl，taq酶(2u/l)1μl，dna模板(20ng/μl)1μl，ddh2o13.5μl。

反应程序如下：在thermalcyclert100pcr仪中，94℃预变性3min，(94℃变性30s，各引物退火温度下复性40s，72℃延伸90s)共34个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。

利用psba3f(5'-gttatgcatgaacgtaatgctc-3'，seqidno.1)和trnhf(5'-cgcgcatggtggattcacaatcc-3'，seqidno.2)(kresswj,wurdackkj,zimmerea,weigtla,janzendh.useofdnabarcodestoidentifyfloweringplants.pnas,2005,102(23):8369-8374)引物分别对用本发明方法提取的水稻、小麦、玉米、棉花、辣椒和番茄六种植物基因组dna进行扩增，分别取2μlpcr产物，用1.5％的琼脂糖凝胶中电泳检测，在紫外凝胶成像仪中观察。电泳结果如图14所示，在300bp～750bp之间，分别有一条单一、明亮的条带，结果表明用本发明提取的植物基因组dna可用于pcr反应，效果很好。

利用its1(5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'，seqidno.3)和its4(5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，seqidno.4)(tojuh,tanabeas,yamamotos,satoh.high-coverageitsprimersforthedna-basedidentificationofascomycetesandbasidiomycetesinenvironmentalsamples.plosone,2012,7(7):e40863.doi:10.1371/journal.pone.0040863)引物分别对用本发明方法提取的禾谷镰刀菌、草酸青霉菌、葡萄球座菌和菊青霉四种真菌基因组dna进行扩增，分别取2μlpcr产物，用1.5％的琼脂糖凝胶中电泳检测，在紫外凝胶成像仪中观察。电泳结果如图15所示，在500bp～600bp处，分别有一条单一、明亮的条带，结果表明用本发明提取的真菌基因组dna可用于pcr反应，效果很好。

利用16sf(5'-agagtttgatcctggctcag-3'，seqidno.5)和16sr(5'-acggctaccttgttacgact-3'，seqidno.6)(何亮,宋新华,王智文,吴凡,刘训理.1株植物病原真菌拮抗细菌的鉴定.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2007，35(2):120-124)引物分别对用本发明方法提取的大肠杆菌和菌两种细菌基因组dna进行扩增，分别取2μlpcr产物，用1.5％的琼脂糖凝胶中电泳检测，在紫外凝胶成像仪中观察。电泳结果如图16所示，在1800bp处，分别有一条单一、明亮的条带，结果表明用本发明提取的细菌基因组dna可用于pcr反应，效果很好。因此，本发明方法提取的植物、真菌和细菌的基因组dna用于分子鉴定，突变体检测，分子标记实验以及其他的分子生物学研究。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。