一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌及其用途的制作方法

本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌及其用途。

背景技术：

近年来，随着畜禽规模化养殖程度的提高，养殖污染问题日益突出，成为限制畜牧业发展的重要瓶颈。沼液是畜禽污水经过厌氧沼气工程处理后的产物，由于其含有较多的有机物及氮、磷等污染物，无法直接排放，仍需进一步处理才能避免对环境的影响。目前较为常见的沼液处理工艺包括物理、化学和生物等多种手段。其中采用微生物处理沼液的技术由于占地面积小、成本较低等优势在沼液净化中发挥了重要作用。但研究表明，经过微生物处理后，虽然沼液中氨氮含量有较大降解，但总氮(tn)去除率仍偏低，特别是生化处理出水中仍含有大量的硝酸盐氮，具有潜在的环境风险。

传统硝酸盐氮的去除需要严格厌氧环境，且较易受到氧气或亚硝酸盐的抑制。随着好氧反硝化途径的发现，为硝酸盐氮在好氧条件下的去除提供了新的思路。近年来，国内外研究陆续从生活污水处理厂活性污泥、海湾沉积物、农用肥土壤等多种来源筛选获得好氧反硝化菌株，均对去除硝酸盐氮和tn有良好效果。虽然目前在好氧反硝化菌的筛选方面开展了一定研究，但从猪场沼液污泥中有针对性的筛选适合其脱氮处理菌株的研究仍较少，特别是在沼液实际应用时合适菌剂添加量方面的报道。现有的好氧反硝化菌很容易受到高浓度有机物或氨氮的影响，对水中的od600、tn、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮或氨氮的去除情况不理想。传统的生物脱氮工艺通常包括自养硝化和异养反硝化两个阶段，第一阶段其在有氧条件下通过氨氧化细菌将氨态氮氧化为亚硝酸盐，硝化细菌将亚硝酸铵氧化成硝酸盐；第二阶段通过在厌氧条件下反硝化细菌将亚硝酸盐和硝酸盐转化为n2气体。整个过程中参与反应的酶包括氨单加氧酶(amo)，羟胺氧化酶(hao)，周质硝酸还原酶(nap)，亚硝酸盐还原酶(nir)，一氧化氮还原酶(nor)和一氧化二氮还原酶(nos)等。在这整个反应过程中不仅耗时，而且有低硝化率和分离好氧和缺氧区的污水处理系统的复杂性。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一株从猪场沼液中筛选出的，可高效降解氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和cod，并具有对高有机负荷有高耐受性同时具有好氧反硝化功能和异养硝化功能的施氏假单胞菌。

本发明的目的之二在于提供一种将筛选得到的好氧反硝化菌应用到猪场沼液处理，在氨氮降解过程中，并未检测到亚硝酸盐氮和硝酸盐氮有明显的积累，实现cod和氨氮的同步去除，克服了传统生化处理在氧化氨氮时对高有机负荷不耐受的缺点。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌zh-14(pseudomonasstutzerizh-14)，其保藏号为cctccno:m2018730，保藏时间为2018年10月31日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。施氏假单胞菌zh-14(pseudomonasstutzerizh-14)的16srdna如下所示：

aaaatgcgcagctaacacatgcaagtcgagcggatgagtggagcttgctccatgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagtgggggatcttcggacctcacgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccaacagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaagcccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcgagctagagtatggcagagggtggtggaaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagataataggaaggaacaccagtggccgaaaggcgaccaccctggcctaatactgaccactgaaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagatacctggtagtcacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggatccttgagatctttagtggcgcagctaacgcattaagtcgaccgcctgggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacggggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttaaggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagctagtctaaccttcggggggacggtaccacgagatctgg。

一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌在降解含氮污水中的氨氮或硝酸盐氮或亚硝酸盐氮或cod中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、施氏假单胞菌zh-14同时具有好氧反硝化功能和异养硝化功能，且降解过程中包含了极低含量的亚硝酸盐氮积累；

2、施氏假单胞菌zh-14对氨氮的去除主要为同化作用，少量则通过异养硝化-好氧反硝化作用实现tn的去除；

3、施氏假单胞菌zh-14可直接利用亚硝酸盐进行生长代谢；

4、施氏假单胞菌zh-14中细胞色素c和细胞色素aa3之间的电子传输链中的“瓶颈”现象被克服，电子流可同时传输给反硝化酶和氧气。在低碳氮比(<1)的环境下，施氏假单胞菌zh-14中周质硝酸盐还原酶的活性依然较强，好氧表达受所使用的碳源种类影响较小，解决了利用好氧反硝化菌处理含氮污水过程中的碳源问题；

5、施氏假单胞菌zh-14中氧化氢酶、过氧化物酶和三种磷酸酶的活性较强，新陈代谢快，生长挂膜时间短；

6、施氏假单胞菌zh-14具有较强的亚硝酸盐氮耐受能力，具有实际应用潜力；

7、接种施氏假单胞菌zh-14后可实现cod和氨氮的同步去除，克服了传统生化处理在氧化氨氮时对高有机负荷不耐受的缺点，有利于沼液污染物的去除。

附图说明

图1为施氏假单胞菌zh-14在btb鉴定平板上的菌落形态图；

图2为施氏假单胞菌zh-14在不同氮培养基中的生长曲线及对tn、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和氨氮含量的影响图；

图3为投加不同终浓度的施氏假单胞菌zh-14处理沼液后对其污染物指标的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明：

实施例1：菌种的筛选方法

培养基

反硝化富集培养基：na3c6h5o7·2h2o1g/l、kno31g/l、kh2po41.5g/l、na2hpo40.42g/l、mgso4·7h2o1.0g/l、cuso4·5h2o4.0mg/l、feso4·7h2o0.7mg/l、fecl3·6h2o7.0mg/l、cocl3·6h2o0.2mg/l、na2mo4·2h2o3.4mg/l、cacl2·2h2o2.0g/l，ph7.2。

溴百里酚蓝(btb)鉴定培养基：na3c6h5o7·2h2o1g/l、kno31.0g/l、feso4·7h2o0.05g/l、cacl2·2h2o0.2g/l、mgso4·7h2o1.0g/l、1％btb1.0ml/l，ph6.8。

反硝化性能测定培养基：na3c6h5o7·2h2o1.0g/l、kno31.0g/l、kh2po40.75g/l、mgso4·7h2o0.4g/l，ph7.2。

氨氮降解性能测定培养基：nh4cl0.382g/l、ch3coona0.7g/l、mgso4·7h2o0.05g/l、k2hpo40.2g/l、nacl0.12g/l、mnso4·4h2o0.01g/l、feso40.01g/l，ph7.2。

亚硝酸盐氮降解性能测定培养基：nano20.15g/l、ch3coona0.3g/l、mgso4·7h2o0.05g/l、k2hpo40.2g/l、nacl0.12g/l、mnso4·4h2o0.01g/l、feso40.01g/l，ph7.2。

上述平板培养基配制时需加入1.5％～2.0％琼脂粉。

水质指标检测方法

水质检测均采用国标方法，其中氨氮检测方法采用《水质氨氮的测定-水杨酸分光光度法》(gb7481-87)；硝酸盐氮含量检测采用《水质硝酸盐氮的测定-紫外分光光度法》(hz-hj-sz-0138)；tn检测方法采用《水质总氮的测定-碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》(gb-11894-89)；亚硝酸盐氮的测定采用《水质亚硝酸盐氮的测定-分光光度法》(gb7493-87)；cod检测方法采用《水质化学需氧量的测定-重铬酸盐法》(gb11914-89)。

1、菌株来源

污泥来自运行稳定良好的浙江安吉吉成牧业养殖场缺氧-好氧污水处理系统的曝气池。沼液取自浙江金帆生态养殖有限公司黑膜厌氧发酵池尾端，化学需氧量(cod)、氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、tn和ph等水质指标见表1。

表1猪场沼液污染物指标

2、好氧反硝化菌的初筛

取新鲜活性污泥1g采用5ml无菌0.9％生理盐水离心重悬2次后，取1ml重悬液接种至100ml反硝化富集培养基中(300ml三角瓶)，在30℃、160r/min下恒温振荡培养。每隔1d按1％(v/v)接种量转接至新的反硝化富集培养基中，连续富集4次后，采用10倍梯度稀释在btb鉴定平板上涂布。挑取平板上具有蓝色晕圈的单菌落进行连续划线纯化，将纯化后的单菌落在lb斜面4℃保存。

3、好氧反硝化菌的复筛

活化初筛菌株，接种到反硝化性能测定培养基上，在30℃、160r/min恒温振荡培养箱中培养2d，进行tn、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮等指标的检测。根据tn和硝酸盐氮去除率筛选出最优菌株。

4、诱导培养：经过富集培养后，从btb鉴定平板中共挑取到16株菌落形态有明显差异且周围有蓝色晕圈的菌株，分别命名为zh-1至zh-16。对上述筛选得到的菌株进行磁化处理，在250～300mt场强下磁化培养24～36h所筛选得到的菌株，反硝化性能鉴定培养基的摇瓶复筛结果见表2。由表2可知，相较于其余菌株，菌株zh-14的tn和硝酸盐氮的去除效果均最好，分别达到50.73％和99.99％，并在培养后仅有0.031mg/l的亚硝酸盐氮积累。因而选取菌株zh-14进行后续鉴定和脱氮能力检测。

表2好氧反硝化菌的初筛

实施例2：菌种形态观察

如图1所示，将纯化后的优选菌株在btb固体培养基上涂布，观察菌株的菌落形态。btb平板鉴定结果显示，zh-14能够在以硝酸钾为唯一氮源的固体平板上进行反硝化产碱作用，提高培养基中的ph值，使btb由绿变蓝。菌株zh-14在btb平板上单菌落形态前期呈圆形、淡黄色、表面光滑、不透明、有凸起、易挑起；生长后期表面生成淡黄色褶皱，菌落表面积变大。

实施例3：脱氮性能测试

1、好氧反硝化菌的脱氮性能测试

挑取单菌落分别接种于反硝化性能测定培养基、亚硝酸盐降解性能测定培养基和氨氮降解性能测定培养基，30℃、160r/min条件下恒温振荡培养1d，制得相应种子液。

分别取上述菌液按照1％(v/v)接种至装有100ml反硝化性能测定培养基、亚硝酸盐降解性能测定培养基和氨氮降解性能测定培养基的250ml三角瓶中，每个处理设3个重复，于30℃、160r/min条件下恒温振荡培养。其中反硝化性能测定培养基、亚硝酸盐降解性能测定培养基每隔6h取样，氨氮降解性能测定培养基每隔4h取样，分别检测od600、tn、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮或氨氮等含量，直至各指标趋于稳定。记录反硝化性能测定培养基、亚硝酸盐降解性能测定培养基和氨氮降解性能测定培养基中各时间段d600、tn、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和氨氮的含量并记录，统计结果如图2a、2b、2c所示。

由图2a可知，当施氏假单胞菌zh-14以硝酸钾为唯一氮源生长时，在24h进入对数生长期，48h时菌体浓度od600为0.39。培养36h后硝酸盐氮基本降解完毕，48h时硝酸盐氮与tn的降解率分别为100％和41.76％，理论降解速率分别达到2.85mg硝酸盐氮/(l·h)和0.95mgtn/(l·h)。亚硝酸盐氮方面，在培养30h时有微弱积累，达到12.47mg/l，随后完全降解；氨氮方面，则全过程含量均低于1.0mg/l，无明显的积累。

由图2b可知，当施氏假单胞菌zh-14以亚硝酸钠为唯一氮源培养时，菌株生长12h进入对数生长期，最高od600达到0.23。亚硝酸盐氮在24h内基本降解完毕，仅为0.21mg/l，降解率为99.24％。tn含量先降后升，最终达21.61mg/l，降解率为19.0％；同时氨氮在培养过程中有少量积累，培养30h时浓度最高为1.63mg/l。

本发明以氯化铵为唯一氮源，测定不同培养时间内施氏假单胞菌zh-14的生长情况及对不同氮素的降解情况。由图2c可知，施氏假单胞菌zh-14在以氨氮为唯一氮源培养时，8h进入对数生长期，20h时达到最大吸光度(od600)0.881，随后进入稳定期。在菌株生长过程中，氨氮的降解在培养24h后趋于稳定，剩余6.64mg/l，降解率达94.1％；tn含量从初始102.4mg/l下降到97.2mg/l，降解率为5.08％；同时硝酸盐氮和亚硝酸盐氮含量在全过程均低于0.2mg/l，无明显积累。

本发明表明，施氏假单胞菌zh-14在以硝酸盐为唯一氮源时，硝酸盐氮和tn均随菌体生长而显著降低。由于本试验测定的tn包含菌体细胞内氮含量，因此可推测该菌株主要通过好氧反硝化作用实现脱氮。并且施氏假单胞菌zh-14反硝化过程包含了极低含量的亚硝酸盐氮积累，符合传统反硝化过程中硝酸盐先还原成亚硝酸盐，随后亚硝酸盐浓度再降低的过程。本发明以氨氮为唯一氮源来探讨施氏假单胞菌zh-14是否具有异养硝化作用。研究发现氨氮去除率最高可达94.1％，并且本发明在氨氮降解过程中，并未检测到亚硝酸盐氮和硝酸盐氮有明显的积累。施氏假单胞菌zh-14对氨氮的去除主要为同化作用，少量则通过异养硝化-好氧反硝化作用实现tn的去除。本发明结果表明施氏假单胞菌zh-14可直接利用亚硝酸盐进行生长代谢，研究中tn的降解率为19％且呈先升后降的趋势，这可能与菌株在生长后期所进行的内源性呼吸作用将菌体内源氮分解为氨氮有关。同样培养后期氨氮含量的积累也可受到亚硝酸盐代谢中的同化性还原作用影响。水中的亚硝酸盐积累将影响微生物的生长和代谢活动并对水生动物产生危害，施氏假单胞菌zh-14在利用氨氮、亚硝酸盐氮或硝酸盐氮为唯一氮源时，均未发现有亚硝酸盐的大量积累，且在以亚硝酸盐为唯一氮源的体系中生长良好，表明其具有亚硝酸盐氮耐受能力及实际应用潜力。

由图2可知，以硝酸钾为唯一氮源或以亚硝酸钠为唯一氮源或以氯化铵为唯一氮源，cod/tn为1:1的情况下，施氏假单胞菌zh-14经48h的培养，溶液中亚硝酸盐氮基本无积累。研究表明，碳源是菌种反硝化功能正常运行的限制性因素。当碳源不足时，无法为反硝化作用提供足够能量，可能导致中间产物，如亚硝酸盐的积累。现有技术中的假单胞菌属细菌对碳源的需求高，当碳氮比低于12时，菌的生长和反硝化能力均会受到影响。本研究中沼液的cod/tn为1:1，属于低碳氮比的水平，但从图2可看出，沼液中并没有亚硝酸盐氮的积累。施氏假单胞菌zh-14中细胞色素c和细胞色素aa3之间的电子传输链中的“瓶颈”现象被克服，电子流可同时传输给反硝化酶和氧气。在低碳氮比(<1)的环境下，施氏假单胞菌zh-14中周质硝酸盐还原酶的活性依然较强，好氧表达受所使用的碳源种类影响较小，解决了利用好氧反硝化菌处理含氮污水过程中的碳源问题。

2、好氧反硝化菌对沼液的脱氮效果评价

接种菌株至含有200ml灭菌沼液的500ml三角瓶中至菌终浓度分别为10⁵、10⁶、10⁷和10⁸cfu/ml，以不接菌的灭菌沼液为对照组，在30℃、160r/min下恒温振荡培养，每隔12h取样10ml沼液，检测硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮和cod的变化情况。每组试验包含3个重复。记录接种量分别为10⁵、10⁶、10⁷和10⁸cfu/ml的4组实验中每个时间段中硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮和cod的值，统计的数据如图3所示。

由图3a可知，在氨氮去除方面，与不投菌对照组相比，10⁵cfu/ml投菌组的氨氮降解速率最慢，10⁶cfu/ml投菌组的氨氮降解速率在24h前与10⁷cfu/ml和10⁸cfu/ml投菌组相一致，但随着培养时间延长而放缓。在培养48h后，10⁷cfu/ml和10⁸cfu/ml投菌组的氨氮降解率分别为55.4％和54.48％。在硝酸盐氮去除方面(图3b)，投加高浓度的施氏假单胞菌zh-14对沼液硝酸盐氮含量的去除最快，在24h后达到降解的稳定期，最终投加10⁷cfu/ml终浓度的投菌组的硝酸盐氮去除率最高为97.7％。在cod去除方面(图3c)，低浓度投菌组(10⁵cfu/ml)在培养早期对cod的降解效率低于其它投菌组，但随着培养时间延长，在48h时，4个投菌组对cod降解差异不明显，最高降解率为10⁷cfu/ml终浓度组，达到77.9％。在亚硝酸盐氮方面(图3d)，对照组亚硝酸盐氮含量在培养过程中无显著变化。但与对照组相比，4个试验组在前24h均有不同程度的亚硝酸盐氮积累，其中10⁶cfu/ml投菌组的积累情况最为明显，最高达到9.95mg/l。随着培养时间延长，亚硝酸盐氮的含量逐渐下降，其中以投加10⁷cfu/ml终浓度的试验组最低，为1.49mg/l。

由图3可知，经过2d的培养，投菌组氨氮、硝酸盐氮和cod的去除率分别最高达到54.48％、97.7％和77.9％。接种施氏假单胞菌zh-14后可实现cod和氨氮的同步去除，克服了传统生化处理在氧化氨氮时对高有机负荷不耐受的缺点，有利于沼液污染物的去除。

一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌应用于降解含氮污水中的氨氮或硝酸盐氮或亚硝酸盐氮或cod。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌及其用途

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1445

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

aaaatgcgcagctaacacatgcaagtcgagcggatgagtggagcttgctccatgattcag60

cggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaa120

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