本发明属于家禽品种分子精确改良育种
技术领域：
，尤其涉及一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法。
背景技术：
：溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种从禽蛋蛋白中分离提取的能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。它能够通过破坏细菌细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解发挥灭菌效果。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与dna、rna、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活抑制病毒扩增繁殖。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。因其广泛的抗菌和抗病毒的作用，又被称后抗生素时代的新型免疫因子，目前该新型免疫因子已经在医学领域、食品生产领域得到广泛应用及效果的验证。由于它主要来之动物体液是一种天然酶，安全绿色的添加剂，无抗药性，而且对没有细胞壁的人体细胞不会产生不利影响，特别适合于各种食品的防腐。另外，该酶还能杀死肠道腐败球菌，增加肠道抗感染力，同时还能促进婴儿肠道双歧乳酸杆菌增殖，促进乳酪蛋白凝乳利于消化，所以又是婴儿食品、饮料的良好添加剂。正因为溶菌酶对人体完全无毒、无副作用，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，是一种安全的天然防腐剂，因此有着广阔的应用前景，但由于利用生物工程技术生产的溶菌酶在生物活性等各方面与天然的溶菌酶活性存在较大差异，因此目前溶菌酶的主要来源还是家禽的蛋清、动物血液等体液提取为主，其中以家禽蛋清的含量最为丰富，活性最佳。目前一个鸡蛋可以提取的溶菌酶含量仅为3mg左右，按照目前的市场需求量这样提取量远远不能满足不断扩大的溶菌酶市场需求，这也造成了溶菌酶价格居高不下(每克4～5元左右)，虽然蛋清中的溶菌酶含量与其它动物体液相比较含量已经很丰富，但是相对于蛋清中的含量高达数十克的卵清蛋白而言还存在很大差异。因此如何利用生物技术提高禽蛋中的溶菌酶含量和提取量是目前限制溶菌酶产业发展的关键瓶颈，这也是家禽产业转型升级中一个极具发展前景的方向，对于家禽产业、食品、医疗行业的发展都将有巨大的影响和贡献。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法，更具体为提供一种能够将禽蛋中高效表达的卵清蛋白的调控元件插入到禽类溶菌酶基因表达的调控区域来提高禽蛋溶菌酶在禽蛋中高效表达的方法，该旨在从基因组水平提高禽蛋溶菌酶含量，从而获得具有生产溶菌酶的产蛋家禽个体。本发明是这样实现的，一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法，该方法包括以下步骤：(1)将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgrna克隆到包含dna双链剪切的cas9基因的v2质粒中，得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒；(2)构建基因编辑模板ssdna，该模板ssdna为包含靶点互补链左侧同源序列、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssdna；(3)将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssdna混合制成质粒载体组混合液，并将混合液与脂质体混合抚育；(4)在体外孵化禽胚蛋的胚盘附近加入脂质体抚育后，把步骤(3)中抚育后的混合液注射到开始发育的囊胚附近，将整个胚蛋移至体外容器，加入双抗后用密封、孵化，在形成个体后对插入的片段进行验证筛选，获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。优选地，所述禽蛋为鸡蛋。优选地，在步骤(1)中，鸡基因组的靶向sgrna如seqidno:1所示；在步骤(2)中，鸡基因组的靶点互补链左侧同源序列如seqidno:2所示，鸡基因组的2000bp卵清蛋白转录启动互补序列如seqidno:3所示，鸡基因组的靶点互补链右侧同源序列如seqidno:4所示。优选地，所述禽蛋为鸭蛋。优选地，在步骤(1)中，鸭基因组的靶向sgrna如seqidno:5所示；在步骤(2)中，鸭基因组的靶点互补链左侧同源序列如seqidno:6所示，鸭基因组的2000bp卵清蛋白转录启动互补序列如seqidno:7所示，鸭基因组的靶点互补链右侧同源序列如seqidno:8所示。优选地，在步骤(3)中，所述混合液中基因编辑质粒、基因编辑模板ssdna的分子量之比为1：9；所述脂质体为脂质体2000或脂质体3000；所述混合液与脂质体的体积比为1：1.5；所述抚育的温度为37℃、时间为10min。优选地，在步骤(4)中，所述脂质体为脂质体2000或脂质体3000；所述脂质体在胚盘附近加入的量为15微升；所述抚育的温度为37℃、时间为10min。优选地，在步骤(4)中，所述双抗为氨苄青霉素和链霉素。本发明克服现有技术的不足，提供一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法，本发明利用基因编辑技术的准确靶点编辑插入作用，准确将禽类的卵清蛋白高效表达调控元件序列准确插入到禽类的溶菌酶基因表达调控区，产生具有卵清蛋白高效表达调控元件和溶菌酶基因翻译区组合的新的产蛋家禽个体，进而提高蛋清中溶菌酶的含量。相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：(1)本发明方法具有技术可靠，永久及安全高效表达的特点；(2)本发明通过基因编辑的方法将高效的卵清蛋白基因表达调控元件，准确的插入到溶菌酶基因的调控区，有效的提高了溶菌酶基因的表达量，进而提高溶菌酶的翻译量近百倍；(3)本发明由于采用的是基因编辑的方法，从遗传表达基础上改变了禽类的溶菌酶表达效率，因此该改变能够稳定的遗传，形成一个高效生产翻译的群体，极有利于溶菌酶产品的工厂化产业化提取和应用；(4)本发明利用基因编辑手段插入了禽类个体体内现有的基因片段，因此不会造成外来基因导入引起的不确定的生物危害性；(5)本发明插入的片段仅针对的是溶菌酶基因的表达效率，对于原有禽蛋蛋白的表达调控未做改变，因此该改变产生的种蛋还能够孵化形成新的个体，保证了个体改变的稳定遗传性。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1(1)将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgrna(如seqidno:1所示)克隆到包含dna双链剪切的cas9基因的v2质粒(v2质粒为市场购买得到，v2质粒的酶切操作、酶切位点依照产品说明书记载进行)中，得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒；(2)构建基因编辑模板dna，该模板dna为包含靶点互补链左侧同源序列(如seqidno:2所示)、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列(如seqidno:3所示)以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssdna(如seqidno:4所示)；(3)将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssdna按照分子量之比为1：9；混合；之后再与脂质体的按照体积比为1：1.5进行混合，混合后37℃抚育；(4)在体外孵化禽胚蛋的胚盘附近加入15微升的含有质粒混合液的脂质体，37℃抚育5分钟后，注射到开始发育的囊胚附近，将整个胚蛋移至体外容器，加入双抗后用密封、孵化，在形成个体后对插入的片段进行验证筛选，获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。(5)完成转化胚蛋100枚，孵化形成个体65只小鸡，其中母鸡29只，经过对靶点序列检测发现成功插入卵清蛋白启动子的雌性个体3只，长大性成熟后存活2个，并产蛋。利用测定两个个体蛋品含量与对照组鸡蛋蛋清中溶菌酶含量比较见表1：表1鸡蛋溶菌酶含量与活性对比表组别溶菌酶含量(mg/ml)活性(u/mg)基因编辑组645.2±83.8515587.3±1343.27对照组5.7±0.1516479.2±1023.71实施例2(1)将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgrna(如seqidno:5所示)克隆到包含dna双链剪切的cas9基因的v2质粒中，得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒；(2)构建基因编辑模板dna，该模板dna为包含靶点互补链左侧同源序列(如seqidno:6所示)、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列(如seqidno:7所示)以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssdna(如seqidno:8所示)；(3)将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssdna按照分子量之比为1：9；混合；之后再与脂质体的按照体积比为1：1.5进行混合，混合后37℃抚育；(4)在体外孵化鸭胚蛋的胚盘附近加入15微升的含有质粒混合液的脂质体，37℃抚育5分钟后，注射到开始发育的囊胚附近，将整个胚蛋移至体外容器，加入双抗后用密封、孵化，在形成个体后对插入的片段进行验证筛选，获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。(5)完成转化鸭胚蛋100枚，孵化形成个体65只小鸭，其中母鸭29只，经过对靶点序列检测发现成功插入卵清蛋白启动子的雌性个体4只，长大性成熟后存活4个，并产蛋。利用测定两个个体蛋品含量与对照组鸭蛋蛋清中溶菌酶含量比较见表2：表2鸭蛋溶菌酶含量与活性对比表组别溶菌酶含量(mg/ml)活性(u/mg)基因编辑组213.5±34.162571.5±205.4对照组3.5±0.122571.3±529.3以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>台州学院浙江省农业科学院西北农林科技大学<120>一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法<141>2019-01-03<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>25<212>dna<213>gallusdomesticus<400>1cgactatacgcaaacgccttcccgt25<210>2<211>370<212>dna<213>gallusdomesticus<400>2agcgccgcagcagcccgagccgggcgggccggcagaggccccggcacccgccgggcggcc60ccgcgcccgccccgtccctccgcccgcgccgcaccttcaccctgcccccggagtcaggcc120cgaactcagccattctcttgaacatattgcaccggagggggcgccgcccgcagccgcgcc180gcgctcagctcccgccccggcccggcccggccccgccgcagcgctcagccccacggcccc240ggcgcccgcaccgcgtcacgggggcggggcggtgccgtcacggggcgacggttggccgcg300ggctcccgcccggcccccttcccgccctccccgcgagtgtcgccctggcggcggaaagag360acgcggaccg370<210>3<211>2100<212>dna<213>gallusdomesticus<400>3gcagggtactctatggtaggctacaacagtaaattacgagcagtttttaggcaattaaat60gttaacaagtagttttaaagtaattctgtggtaatgtgtctgttgctatatccacctctc120atgtgcatgttcaaaaccatattcataaatctatttatgtatttgcattcagttgtcttt180tgggtagcaaactgtcccagaagccagttgcctctacatatttttgttcagtgaaagcta240gaattcattgatacttttcagtacctctgattaaaacacaatctgataggcttgcaaaac300tggaaattcaaagagcaaatttcagtaaactttaggtttggacagatatatgagaaagca360gaggcttgctgactattttatttcttatttttattccctaaaaataaatgtagagaaata420tctgtttgttgcacactacttgctatgagtagatcttcaaaagtatttttacctttgttt480tggtgatggcagaatagataaggaatgtaatttatatggggtca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