OsSYF2蛋白及其编码基因及其在调控水稻粒重中的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及ossyf2蛋白及其编码基因及其在调控水稻粒重中的应用。
背景技术：
：水稻是一种广泛种植的重要的粮食作物，提高水稻的产量具有重要的经济和现实意义。水稻籽粒的大小是决定产量的重要的因素，一系列调控水稻粒型的基因已被克隆。细胞的分化和膨大是影响粒型的关键。根据目前的研究进展，主要集中在泛素介导的蛋白酶体途径，植物激素途径(主要是表油菜素内酯、生长素和细胞分裂素)、g蛋白和mapk信号途径以及一些转录因子调节途径。细胞周期进程的调控是影响细胞分化的重要因素。细胞周期是一个高度复杂的事件，是细胞内容物的复制和细胞的分裂，包括周期蛋白(cyclinprotein)、周期蛋白激酶(cyclin-dependentkinase)、原癌和肿瘤抑制基因和有丝分裂检验点蛋白的复制。细胞周期主要包括g1期、s期、g2期和分裂间期(m期)。在间期，细胞通过dna的复制，以此为细胞分裂做准备。g1期是上一次分裂的结束和s期起始的连接点，此间细胞的生长和dna的复制，决定细胞是否进行分裂或者滞留在静止期(g0)。因此，细胞周期由g1期向s期的转化是维持细胞正常分裂的重要节点。在s期，dna和染色体复制完成，形成姐妹染色单体，而g2期是s期的结束，同时也是有丝分裂的开始，合成rna和蛋白质，为有丝分裂做好准备。在细胞周期的各个时期中，精确的调控是保证细胞产生子代的关键。其中，周期蛋白和周期蛋白形成的复合体是催化细胞周期进程的关键。周期蛋白和周期蛋白激酶在特定的时期磷酸化专一的底物蛋白，驱使细胞周期的进行，完成细胞分裂。周期蛋白和周期蛋白激酶形成的复合体，通常在细胞周期检验点发挥功能。一旦完成，表明细胞周期可以进入下一个时期。因此，周期蛋白和周期蛋白激酶形成的复合体对于细胞周期进程的调控是至关重要。技术实现要素：本发明的目的是提供ossyf2蛋白及其编码基因及其在调控水稻粒重中的应用。本发明提供了一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入ossyf2基因，得到籽粒粒重大于所述出发植物的转基因植物。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物为禾本科植物。所述植物为水稻。所述水稻为粳稻。所述水稻为水稻中花11号。所述ossyf2基因具体通过重组表达载体导入所述出发植物。所述重组表达载体具体可为实施例中的重组质粒pun-ossyf2。本发明还保护一种培育籽粒粒重增加的植物的方法，包括如下步骤：增加植物中ossyf2蛋白的水平和/或活性，从而增加植物的籽粒粒重。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物为禾本科植物。所述植物为水稻。所述水稻为粳稻。所述水稻为水稻中花11号。本发明还保护ossyf2蛋白的应用，为如下(ⅰ)或(ⅱ)：(ⅰ)调控植物的籽粒粒重；(ⅱ)增加植物的籽粒粒重。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物为禾本科植物。所述植物为水稻。所述水稻为粳稻。所述水稻为水稻中花11号。所述ossyf2基因具体通过重组表达载体导入所述出发植物。所述重组表达载体具体可为实施例中的重组质粒pun-ossyf2。本发明还保护ossyf2基因、ossyf2基因的表达盒或ossyf2基因的重组表达载体的应用，为制备籽粒粒重增加的转基因植物。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物为禾本科植物。所述植物为水稻。所述水稻为粳稻。所述水稻为水稻中花11号。所述ossyf2基因的重组表达载体具体可为实施例中的重组质粒pun-ossyf2。本发明还保护一种增加植物籽粒粒重的产品，包括：ossyf2蛋白、ossyf2基因、ossyf2基因的表达盒或ossyf2基因的重组表达载体。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物为禾本科植物。所述植物为水稻。所述水稻为粳稻。所述水稻为水稻中花11号。所述ossyf2基因的重组表达载体具体可为实施例中的重组质粒pun-ossyf2。所述粒重为百粒重。所述ossyf2基因为编码ossyf2蛋白的基因。所述ossyf2蛋白为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)序列表的序列1所示的蛋白质；(b)来源于水稻且与(a)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；(c)将(a)进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的由其衍生的蛋白质；(d)在(a)或(b)或(c)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。标签具体如表1所示。表1标签的序列所述ossyf2基因为如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的dna分子：(1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；(2)序列表中序列3所示的dna分子；(3)与(1)或(2)具有75％以上同一性且编码植物籽粒粒重相关蛋白的dna分子；(4)来源于水稻且与(1)或(2)具有98％以上同一性且编码植物籽粒粒重相关蛋白的dna分子；(5)在严格条件下与(1)或(2)杂交且编码植物籽粒粒重相关蛋白的dna分子。术语“同一性”指与天然核苷酸序列或氨基酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的一致性。所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。可用现有的表达载体构建ossyf2基因的重组表达载体。构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对重组表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。本发明对于培育籽粒粒重增加的转基因植物，从而提高植物产量，具有重大的应用推广价值。附图说明图1为重组质粒pun-ossyf2的元件示意图。图2为ossyf2基因的相对表达水平。图3为百粒重统计结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。水稻品种中花11号简称水稻中花11号，用zh11表示，属于粳稻。粳稻中的ossyf2蛋白如序列表的序列1所示。粳稻cdna中编码ossyf2蛋白的开放阅读框如序列表的序列2所示。粳稻基因组dna中编码ossyf2蛋白的基因如序列表的序列3所示。n6d2培养基(ph5.8)：n6大量元素，b5微量元素，b5维生素，300mg/l水解酪蛋白，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，30g/l蔗糖，2mg/l2,4-d，7g/l琼脂，余量为水n6d2s1培养基(ph5.8)：n6d2，25mg/l潮霉素，600mg/l头孢霉素，余量为水。n6d2s2培养基(ph5.8)：含50mg/l潮霉素、300mg/l头孢霉素的n6d2培养基。分化培养基a(ph5.8)：ms盐分和维生素，300mg/l水解酪蛋白，50mg/l潮霉素，1mg/l6-ba，0.5mg/lkt，0.2mg/lzt，0.25mg/lnaa，30g/l蔗糖，30g/l山梨醇，7g/l琼脂，余量为水。分化培养基b(ph5.8)：ms盐分和维生素，300mg/l水解酪蛋白，50mg/l潮霉素，1mg/l6-ba，0.5mg/lkt，0.2mg/lzt，0.5mg/lnaa，30g/l蔗糖，20g/l山梨醇，7g/l琼脂，余量为水。生根壮苗培养基(ph5.8)：1/2ms盐分，ms维生素，1mg/l多效唑，0.5mg/lnaa，8g/l琼脂，余量为水。实施例、ossyf2蛋白及其编码基因的应用一、超表达载体的构建1、以载体puc19(北京百泰克生物技术有限公司，目录号dp7801)为出发载体，在hindiii和bamhi酶切位点之间插入序列表的序列4所示的dna分子(玉米泛素启动子ubipro)，在saci和ecori酶切位点之间插入序列表的序列5所示的dna分子(nosterpolya终止序列)，得到重组质粒pun19。2、取重组质粒pun19，用限制性内切酶hindiii和ecori进行双酶切，回收约2.3kb的片段。3、取pcambia1301(biovectorco.,ltd目录号biovec-11)，用限制性内切酶hindiii和ecori进行双酶切，回收载体骨架。4、将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pun1301。5、将序列表的序列2所示的dna分子(ossyf2基因)插入重组质粒pun1301的bamhi和kpni酶切位点之间，得到重组质粒pun-ossyf2(进行测序验证)。重组质粒pun-ossyf2中具有如下表达盒：玉米泛素启动子ubipro、ossyf2基因和nosterpolya终止序列。重组质粒pun-ossyf2的元件示意图见图1。二、转ossyf2基因水稻的获得1、将重组质粒pun-ossyf2导入农杆菌eha105，得到重组农杆菌。2、取中花11号的胚性愈伤组织，用步骤1得到的重组农杆菌的菌液进行侵染，然后用含300mg/l头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，然后用无菌滤纸吸干后转至n6d2s1培养基上培养2周。3、完成步骤2后，取愈伤组织，转移到n6d2s2培养基上培养2周，然后转移到新的n6d2s2培养基上培养2周。4、完成步骤3后，取生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基a上，培养7天。培养条件：12小时光照(28℃)/12小时黑暗(25℃)。5、完成步骤4后，将愈伤组织转移至分化培养基b上，培养直至获得再生苗。培养条件：12小时光照(28℃)/12小时黑暗(25℃)。6、取步骤5得到的再生苗，转移到生根壮苗培养基上进行培养，待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培。获得20棵t0代再生植株。7、gus组织化学染色将步骤6获得的20棵t0代再生植株的2-3mm长的根段进行gus染色，根部分表现为蓝色的植株即为转基因植株。20棵t0代再生植株中15棵为转基因植株。8、t0代转基因植株自交并收获种子，得到t1代种子。t1代种子长成的植株即为t1代植株。t1代植株自交并收获种子，得到t2代种子。t2代种子长成的植株即为t2代植株。抽样t2代植株，对2-3mm长的根段进行gus染色，根部分表现为蓝色的植株即为转基因植株。对于某一t1代植株，如果其抽样检测的t2代植株均为转基因植株，该t1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。得到oe3株系、oe6株系和oe9株系，均为纯合的转基因株系。9、取oe3株系、oe6株系和oe9株系的t2代植株，取中花11号植株，分别提取叶片的rna并反转录得到cdna，以cdna为模板，进行荧光实时定量pcr。用于定量分析的试剂为sybrgreenrealtimepcrmastermix(toyobo)。所用仪器为美国stratagene公司实时荧光定量pcr仪mx3000p。ubqtin基因作为内参。荧光实时定量pcr的引物如下：f3：5′-tctccaatatgggaaggtgtctaag-3′；r3：5′-aagtgttcgttccggtcattg-3′。ossyf2基因的相对表达水平见图2(4个生物学重复的平均值)。三、转空载体水稻的获得用载体pcambia1301代替重组质粒pun-ossyf2，按照步骤二操作，得到转空载体植株。四、百粒重的统计取oe3株系、oe6株系和oe9株系的t2代种子(各600粒)，取转空载体株系的t2代种子(600粒)，取中花11号的种子(600粒)。将600粒水稻籽粒平均分成六份，测定百粒重。oe3株系、oe6株系和oe9株系的籽粒百粒重依次为2.724g、2.766g和2.678g，而中花11号的百粒重为2.501g，利用t-test分析，具有显著性差异。转空载体株系的百粒重为2.49g，与中花11号无显著差异。结果见表2和图3。表2每份百粒重(克)中花11号oe3株系oe6株系oe9株系第一份2.5032.7192.7112.645第二份2.4822.7182.7622.705第三份2.4382.712.8582.616第四份2.5012.7622.7282.663第五份2.5482.7142.8242.787第六份2.5312.7212.7142.652sequencelisting<110>中国科学院植物研究所<120>ossyf2蛋白及其编码基因及其在调控水稻粒重中的应用<130>gncyx190425<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>340<212>prt<213>oryzasativajaponicagroup<400>1metalaserserserseralaalaserglylysserargproglucys151015ileasnserserasnprophehisglucysserasptyrcysleuarg202530lysilealaglualalysgluargilegluaspgluglnargpropro354045valaspargthrvalhisproaspcysileasnalaserasnprotyr505560hisvalcysserglutyrcysphelysargilealaaspalalysser65707580glyleugluargalagluglngluproproseralaaspalaglylys859095seraspalaalaglnalagluglyglyglyglyaspaspaspalaglu100105110glngluaspalaglyseraspaspglytyrproglnmetthrglulys115120125glnlyslysleuphegluleuargleulysmetasnglualaarglys130135140alaasnglnglnalametvalalaglulyslysargmetgluproarg145150155160alagluserargglyvalserlysglnlystrpleugluasparglys165170175lyslysileglylysleuleuaspserasnglyleuaspmetthrlys180185190sertyrmetleuaspthrglngluseralaglualalystyrlyslys195200205trpglulysgluproalaprotyrglytrpaspvalpheasnglnlys210215220thrleutyraspalatyrlyslysargthrlysasnilegluvalasp225230235240metglualatyrasnlysalalysglualaaspprogluphetyrarg245250255aspalaserserleuglntyrglylysvalserlysvalprogluglu260265270asnileaspargmetvalasngluleulysgluargaspglulysarg275280285lysalapheserargargarglysphehisgluasplysaspileasp290295300serileasnaspargasngluhispheasnlyslysvalgluargala305310315320pheglylystyrthrleugluilelysasnasnleugluargglythr325330335alaleuproasp340<210>2<211>1023<212>dna<213>oryzasativajaponicagroup<400>2atggcgtcgtcgtcgtcggcggcgtcggggaagtcgcggccggagtgcatcaactcgtcg60aacccgttccacgagtgctccgactactgcctccgcaagatcgccgaggccaaggagcgc120atcgaggacgagcagcggccgccggtggaccgcaccgtccaccccgactgcatcaacgcc180tccaacccctaccacgtctgctccgagtactgcttcaagaggatcgccgacgccaaatca240gggttggagcgtgcggagcaagaaccgccttctgcagacgctggcaaatccgacgctgcc300caagctgagggtggtggtggtgatgatgatgcggagcaggaggacgccggctcagacgac360ggttacccgcagatgacagagaagcagaagaagctatttgagttgcggctgaagatgaat420gaagctaggaaggcaaatcagcaagcgatggtggcagagaagaagaggatggagcctcgc480gctgagagtagaggtgtttctaaacaaaagtggctggaagacagaaaaaagaagatcgga540aagcttcttgactcaaatggcctggacatgacaaagtcttacatgctcgatacacaggag600tcggccgaagcaaaatacaagaagtgggaaaaggaacctgcaccatatggttgggatgtt660ttcaaccagaagaccttatatgatgcatacaaaaagaggaccaagaacattgaggttgac720atggaggcatacaacaaagcaaaggaagccgatcctgaattttatcgggacgcttcaagt780ctccaatatgggaaggtgtctaaggtcccggaagaaaacatagacaggatggttaatgag840cttaaggaacgggatgagaaacggaaagcattcagcaggaggcgcaagttccatgaagac900aaggacattgactcgatcaatgaccggaacgaacacttcaacaagaaggttgagagggca960tttggcaagtatactcttgagatcaagaacaatcttgaaagggggactgccttgccagat1020tag1023<210>3<211>2415<212>dna<213>oryzasativajaponicagroup<400>3aatccccaattcgcacgcggagctaatcctcttctagggttccgacgaatcccgagctcg60gaggccgatggcgtcgtcgtcgtcggcggcgtcggggaagtcgcggccggagtgcatcaa120ctcgtcgaacccgttccacgagtgctccgactactgcctccgcaagatcgccgaggccaa180ggagcgcatcgaggacgagcagcggccgccggtggaccgcaccgtccaccccgactgcat240caacgcctccaacccctaccacgtctgctccgagtactgcttcaagaggatcgccgacgc300caaatcaggtgctagccccgcctcctcctctcgcttctgtacgtattttctgatcggagc360aatttgcgccatgggtgatgtccatgaatccatactatagtggtaattctaattcgaggc420taggagtaattcgattcgtcctgagcctgtattgggtgcttatggagtgattcattggct480tcgatttagggttggagcgtgcggagcaagaaccgccttctgcagacgctggcaaatccg540acgctgcccaagctgagggtggtggtggtgatgatgatgcggagcaggaggacgccggct600cagacgacggttacccgcagatgacagagaagcagaagaagctatttgagttgcggctga660agatggtgcggtcatcggcaattccattgttttgtcatagctgttgtctgtgcagtcttg720ggtattcatctctttgctgtttctcgtgctgcagaatgaagctaggaaggcaaatcagca780agcgatggtggcagagaagaagaggatggagcctcgcgctgagagtagaggtgtttctaa840acaaaagtggctggaagacagaaaaaagaagatcggaaagcttcttgactcaaatggcct900ggacatgacaaagtcttacatgctcgatacacaggagtcggccgaagcaaaatacaagaa960gtgggaaaaggaacctgcaccatatggttgggatggtgagttccatctctcgaatttctt1020cattcaatttatattcagaggcatattctgtagctttggtgaatttcgacacatccgtat1080tcatattgctgtctctcatggccggttgtcgttgtggtgtttattatacgtgttttaagc1140taattccaaatgaattttctgaagttacttgaataattgtttgtcagtttgttacctagt1200agtatatggcatgttgttcctttcccatcagggtctaggttgtcatatcagtttctttgt1260tttataagtttaacctgtgctttgcaaactttaccaacatatgtttctgtttttcctgca1320tttaaatattaaacctgcaagtgtaaattactgatgttcttaaacaagattatatgttat1380atatgctcttgacaaatgctccctataatttttgcgtctagccttcagcaatgcaacatc1440tggttagcatttcttgttacatagtgcattgaatgtctggcaccatgagatgtctactta1500catgattctttatatctggaaatccctgatgcttatgttatagtcagaaatcagaaagca1560tcaaggtagccgccataggcccatggttatagcttgttgtttgaaacaatttgagtttgg1620ccatgaactccctttgatctttttaatttaaacctcgtacctctatataaatgggggtgt1680tctcacttgcagttttcaaccagaagaccttatatgatgcatacaaaaagaggaccaaga1740acattgaggttgacatggaggcatacaacaaagcaaaggaagccgatcctgaattttatc1800gggacgcttcaagtctccaatatgggaaggtacttgccatcgtaccaaactttgtactaa1860ttgaatttaaggcccttctgtcatggagtccttatcgatggcttgtgcgttgaacaggtg1920tctaaggtcccggaagaaaacatagacag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