本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种细菌耐药基因的检测方法及其专用试剂盒。
背景技术：
：细菌耐药基因检测在临床诊断中具有重要意义。现阶段应用较广的商业化细菌耐药基因检测方法主要包括以下四种：自动检测系统的vitek2，飞行质谱maldi-tof，快速的生化检测以及实时影像监测。vitek2进行临床样本检测时表现出较好的一致性，但是其检测样本需为阳性培养物，而一般血液样本报告阳性时间需要至少24小时，极大延误了治疗时机。实时影像监测也存在相同问题。飞行质谱以及生化检测只能确定产碳青霉烯酶以及beta内酰胺酶的病原体，对于其他耐药性的细菌很难进行准确检测。除此之外，以聚合酶链式反应为基础的细菌耐药性检测方法也应用较广，如proveit，filmarray，verigene等，但是这些方法只能检测几种常见的耐药基因，存在一定局限性。ampliseq技术是指在测序的过程中特异性的扩增靶标片段，最后对该片段进行测序确定碱基组成的方法。与传统的二代测序方法不同，该方法不采用超声的方式将基因组打断为短片段，而是在同一反应体系内，预先放置引物，利用引物特异性的扩增感兴趣的目标片段，从而产生符合后续测序读长的短片段。该方法能够在同一反应条件下，同一反应体系内，放置多达24000对引物，对目标片段进行扩增。目前ampliseq技术已被广泛应用到人常见疾病的筛查当中，如癌症的筛查、遗传疾病的筛查。在病原诊断方面，该技术被应用到ebola病毒的诊断以及结核分枝杆菌的耐药基因的诊断。ampliseq技术在多方面的诊断中表现出优异的鉴定能力以及突变位点的识别能力，在多重检测中表现出较强的优势。该技术已成为国内外疾病筛查、病原筛查和耐药筛查的主要技术方法。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供成套单链dna。本发明提供的成套单链dna由序列表中序列1-296所示的296条单链dna组成。本发明的第二个目的是提供上述成套单链dna的新用途。本发明提供了上述成套单链dna在如下a1)-a6)中任一种中的应用：a1)检测或辅助检测细菌耐药基因；a2)制备检测或辅助检测细菌耐药基因的产品；a3)检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类；a4)制备检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类的产品；a5)检测或辅助检测待测样品是否含有携带耐药基因的细菌；a6)制备检测或辅助检测待测样品是否含有携带耐药基因的细菌的产品。本发明的第三个目的是提供用于检测细菌耐药基因的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括上述成套单链dna。所述试剂盒的功能为如下1)或2)或3)：1)检测或辅助检测细菌耐药基因；2)检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类；3)检测或辅助检测待测样品是否含有携带耐药基因的细菌。所述试剂盒还可包括构建文库所需的试剂、进行pcr扩增所需的试剂、制备测序模板所需试剂和/或进行测序所需试剂。所述构建文库所需的试剂可为ionampliseqlibrarykit2.0(thermofisher公司，编号no.4480441)中试剂。所述制备测序模板所需试剂可为ionpgmot2200templatekit(thermofisher公司，编号no.448094)中试剂。所述进行测序所需试剂可为ionpitmhi-qtmsequencing200kit(thermofisher公司，编号no.26433)中试剂。本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类的方法。本发明提供的检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类的方法包括如下步骤：(1)提取待测细菌的基因组dna，利用上述成套单链dna对所述基因组dna进行扩增，得到扩增产物；(2)基于ampliseq技术利用所述扩增产物构建测序文库；(3)对所述测序文库进行测序，得到测序结果，并将所述测序结果与耐药基因序列进行比对，确定待测细菌是否携带耐药基因及携带耐药基因的种类。上述应用或试剂盒或方法中，所述耐药基因为如下至少一种：aac(2’)-lb、aada1、aada3、aadb、aadd、adeb、ant(4’-llb)、aph3-la、arma、blaz、catb3、catb6、catb8、cmla5、ctx-m-14、dfra19、dfrg、e.coli_gyra、e_coli_parc、imp-1、kpc-1、meca、mecc、mcr-1、mtrc、mtrd、mtre、mtrr、ndm-1、oprd、oqxa、oqxb、blaoxa-10、blaoxa-23、blaoxa-24、blaoxa-1、blaoxa-51、blaoxa-58、blaoxa-66、blaoxa-69、blaoxa-82、pao_gyra_parc、pata、patb、pbp1a、pbp2b、pbp2x、phop、phoq、pmra、pmrb、qaca、qnra1、qnrb4、rpsj、sat-1、blashv-60、stra、strb、sul1、blatem-12、teta、tetd、tetm、tetr、vana、vanb、vim-2。所述细菌为如下至少一种：鲍曼不动杆菌acinetobacterbaumannii、粪肠球菌enterococcusfaecalis、屎肠球菌enterococcusfaecium、肺炎克雷伯菌klebsiellapneumoniae、带beta-内酰胺耐药的肺炎克雷伯菌klebsiellapneumoniaewithbeta-lactamase、万古霉素耐药的肠球菌vancomycin-resistantenterococci、铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa、金黄色葡萄球菌staphylococcusaureus、表皮葡萄球菌staphylococcusepidermidis、溶血葡萄球菌staphylococcushaemolyticus、人葡萄球菌staphylococcushominis、甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌methicillin-resistantstaphylococcusaureus。所述待测样品可为血液样品。本发明提供了一种细菌耐药基因的检测方法及其专用试剂盒。本发明提供的试剂盒包括序列表中序列1-296所示的296条单链dna。本发明提供的细菌耐药基因检测方法包括如下步骤：(1)提取待测细菌的基因组dna，利用成套单链dna对所述基因组dna进行扩增，得到扩增产物；(2)基于ampliseq技术利用所述扩增产物构建测序文库；(3)对所述测序文库进行测序，得到测序结果，并将所述测序结果与耐药基因序列进行比对，确定待测细菌是否携带耐药基因及携带耐药基因的种类。本发明的检测方法在一次反应中，可高通量、快速、准确的同时检测待测样本的68个耐药基因，推测其耐药表型，为临床准确用药提供指导性作用，减少抗生素滥用以及因此产生的超级细菌，具有良好应用前景。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的带beta-内酰胺耐药的肺炎克雷伯菌记载于文献：fengj,yinz,zhaoq,etal.genomiccharacterizationofnovelincfii-typemultidrugresistantplasmidsp0716-kpcandp12181-kpcfromklebsiellapneumoniae[j].scirep,2017,7(1):5830.中，公众可从申请人处获得。下述实施例中的甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌记载于文献：lil,piany,chens,etal.phenol-solublemodulinalpha4mediatesstaphylococcusaureus-associatedvascularleakagebystimulatingheparin-bindingproteinreleasefromneutrophils[j].scirep,2016,6:29373.中，公众可从申请人处获得。实施例1、细菌耐药基因的获得及其检测引物的设计一、耐药基因的获得根据临床常用抗生素的种类以及临床常见病原体的种类，在thecomprehensiveantibioticresistancedatabase(card；http://apcard.mcmaster.ca)数据库和ardb数据库(http://ardb.cbcb.umd.edu)中下载耐药基因的相关片段，并按照病原体、抗生素、耐药基因的类型进行整理，整理方法如下：将在ardb数据库及card数据库下载的耐药基因的相关片段经过cd-hit聚类，以95％为阈值，去冗余序列；再使用blast对获得的片段进行种间比对，以97％为阈值，对耐药位点的特异性片段进行筛选，去除冗余序列。最终共得到68个对临床常使用抗生素产生耐药的耐药基因及其序列，68个耐药基因如下：aac(2’)-lb、aada1、aada3、aadb、aadd、adeb、ant(4’-llb)、aph3-la、arma、blaz、catb3、catb6、catb8、cmla5、ctx-m-14、dfra19、dfrg、e.coli_gyra、e_coli_parc、imp-1、kpc-1、meca、mecc、mcr-1、mtrc、mtrd、mtre、mtrr、ndm-1、oprd、oqxa、oqxb、blaoxa-10、blaoxa-23、blaoxa-24、blaoxa-1、blaoxa-51、blaoxa-58、blaoxa-66、blaoxa-69、blaoxa-82、pao_gyra_parc、pata、patb、pbp1a、pbp2b、pbp2x、phop、phoq、pmra、pmrb、qaca、qnra1、qnrb4、rpsj、sat-1、blashv-60、stra、strb、sul1、blatem-12、teta、tetd、tetm、tetr、vana、vanb、vim-2，其genbank及提交日期分别如表1所示。表1、耐药基因的genbank及提交日期注：|af078527|+|3770-4303|表示aadb耐药基因的序列是genbank为af078527所示的基因序列的第3770-4303位，其他同理。不同病原体产生的抗生素及耐药基因具体如表2所示。表2、不同病原体产生的抗生素及耐药基因二、引物的设计将步骤一获得的68条耐药基因序列提交至ampliseq引物设计网站ionampliseqdesigner(http://www.ampliseq.com/browse.action)上进行引物设计，对返回的引物序列在ncbi上进行比对，评价其特异性，并进行适当的调整和优化，最终获得用于检测68条耐药基因的引物共148对(表3)。表3、检测68条耐药基因的引物序列实施例2、用于检测细菌耐药基因的引物的应用(一)待测病原体的耐药基因检测一、病原体核酸的提取应用qiagen的magattracthmwdnakit试剂盒，采用磁珠法提取表4中的待检测病原体核酸。具体提取步骤按照试剂盒的说明书进行。表4、待检测病原体二、基因文库的构建基于ampliseq技术利用ionampliseqlibrarykit2.0(thermofisherscientific，cat.no.4480441)进行文库构建。具体步骤如下：1、建立2个引物池的dna目标扩增反应ampliseq引物分为引物池1(primerpool1)和引物池2(primerpool2)，引物池1中的引物由表2中标记为“pool＝1”的引物组成，引物池2中的引物由表2中标记为“pool＝2”的引物组成，每条引物在引物池1或引物池2中的浓度均为100nm。在96孔板中，每个样品共两个反应孔，引物分别为引物池1中引物和引物池2中引物。每个反应管的体系为10微升：2×primerpool：5微升、5×ionampliseqtmhifimix：2微升、nuclease-freewater：0.5微升、dna：2.5微升。按照要求将上述体系配好后，按照表5所示的反应条件进行反应(循环数19)。表5、反应条件step温度时间预变性99℃2分钟变性99℃15秒退火和延伸60℃4分钟-10℃hold2、将目标扩增反应合并完成步骤1后，对每个样品，将10微升引物池1得到的反应产物和10微升引物池2得到的反应产物进行合并，每个样品的总体积为20微升。3、部分消化产物(1)向每个样品管中加入2微升fupa试剂(棕色盖子)，此时总体积为22微升。(2)将96孔板放到pcr反应仪上，运行表6所示的程序。表6、反应程序温度时间50℃10分钟55℃10分钟60℃20分钟10℃(最多1小时)4、接头连接将接头(adapter)连接到扩增子上并进行纯化。具体步骤如下：(1)连接反应小心地移除96孔板封口膜，之后在每个反应孔中按顺序加入表7中的试剂。表7、试剂添加顺序成分体积1switchsolution(黄色盖子)4微升2稀释过的ionxpressbarcodeadaptermix2微升3dna连接酶(蓝色盖子)2微升-总体积30微升将96孔板放到pcr反应仪上，运行表8所示的程序。表8、反应程序温度时间22℃30分钟68℃5分钟72℃5分钟10℃(最多24小时)(2)纯化文库加入45微升(1.5×样品体积)的agencourttmampurereagent(beckmancoulter，cat.a63880)到文库中。上下吹打5次混匀，在室温下孵育5分钟，将96孔板放置到磁力架上，之后孵育2分钟直至溶液澄清，在不碰到沉淀物的前提下，小心移除并弃掉上清液。加入150微升新配置的70％乙醇，洗珠子，之后小心移除并弃掉上清液；重复使用70％乙醇清洗第二次；确保每个反应孔中的乙醇都被移除，将96孔板放置在磁力架上，室温放置5分钟。5、使用qpcr对未扩增的文库进行定量将未扩增的ionampliseqtm文库进行稀释，之后使用qpcr的方法通过ionlibraryquantitationkit(thermofisherscientific，cat.no.4468802)对文库的浓度进行定量。未扩增的文库的浓度一般为100-500pm。定量之后，将文库稀释至100pm，以便后续使用iontemplatekit进行模板制备。三、模板准备与测序将步骤二得到的文库使用ionpgmot2200templatekit(thermofisher公司，编号no.448094)试剂盒制备测序模板，将得到的测序模板进行上机测序，测序过程中模板的乳化与富集在iononetouchsystem(thermofisher公司)上操作完成，上机测序使用ionp1芯片在ionproton测序仪(thermofisher公司)上操作完成。所有步骤均按照说明书进行操作。四、测序结果分析测序所得bam格式的raw数据经过samtools(版本1.6)软件转为sam文件，之后提取有效的fasta格式的测序结果，过滤掉低质量的数据以及短片断后，使用bowtie(版本1.2.0)软件分别与ncbi下载的该病原体的耐药基因序列进行比对，提取比对结果，根据测序所得基因reads数以及比例，确定待测病原体含有的耐药基因种类。samtools命令行为：samtoolsview–h原始序列bam文件>输出的sam文件；bowtie命令行为：bowtie-f-a-m20-v1–al比对上文件的输出路径—un未比对上的输出路径—norcreference路径需要比对的序列文件比对结果输出路径。五、耐药基因检测结果各病原体的耐药基因检测结果如表9所示。表9、各病原体的耐药基因检测结果(二)待测病原体的耐药性评价一、病原体耐药表型检测使用表10所示的13种不同种类抗生素对表4所示的各个病原体的耐药表型进行筛查。具体步骤如下：将表4所示的各个细菌37℃摇床过夜培养8小时后，使用pbs稀释至0.5麦氏浊度。棉签蘸取稀释后的菌液，均匀涂布在mha培养基上。使用镊子夹取药敏纸片，按照clsi的要求在mha培养基上贴好对应的药敏纸片。根据clsi的要求对不同菌进行18-24小时培养，培养结束后使用游标卡尺量取抑菌圈的直径，并与2018版clsi的文件进行比较，确定该病原体的敏感、中介和耐药。耐药性评价的具体步骤参照文献“urbaniakc,sielaffac,freykg,etal.detectionofantimicrobialresistancegenesassociatedwiththeinternationalspacestationenvironmentalsurfaces[j].scirep,2018,8(1):814.”中的方法。表10、抗生素种类药物名称剂量单位抗生素种类庆大霉素10μgaminoglycosides头孢西丁30μgcephalosporins苯唑西林1μgpenicillins氯霉素30μgchloramphenicol四环素30μgtetracyclines盘尼西林10unitspenicillins左氧氟沙星5μgquinolones(fluoroquinolones)头孢他啶30μgcephalosporins亚胺培南10μgcarbapenems哌拉西林100μgpenicillins米诺环素30μgtetracyclines万古霉素30μgglycopeptides氨苄西林10μgpenicillins二、检测结果各个病原体对13种不同种类抗生素的耐药表型的筛查结果如表11所示。表11、各个病原体对13种不同种类抗生素的耐药表型的筛查结果各病原体的耐药表型检测结果与耐药基因检测结果基本一致，说明本发明的方法可准确、有效的检测待测细菌是否携带耐药基因及所携带的耐药基因种类。序列表<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院<120>一种细菌耐药基因的检测方法及其专用试剂盒<160>296<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgcacgccttcatctgtca20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2tgtggtgtcgagttccattcc21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3gacacagccagaggcatgta20<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4gccagtcgcaggtgatct18<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5cgcctttcacgtagtggacaaa22<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6ggttcctgaacaggatctatttgagg26<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>7ggctcgaagatacctgcaagaa22<210>8<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223><400>8gaagtatcgactcaactatcagaggtagt29<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>9ggtagcggtgaccatcgaaatt22<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>10tccataaggtcattgagcaatgct24<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223><400>11cccggttcctgaacaggatctat23<210>12<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223><400>12tctcgcctttcacgtagtgaataaatt27<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>13atggacacaacgcaggtcacat22<210>14<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>14atccatagtccaactcctccatga24<210>15<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223><400>15ctcgaggcaatagttgaaatgct23<210>16<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223><400>16cacgcaagacctcaacctttt21<210>17<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223><400>17atgaatatgaatggacctgcatcaatg27<210>18<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223><400>18cggttgcagcgtcttttaacagtata26<210>19<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>19gtggaaagcggaagttaacgtt22<210>20<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223><400>20gcttgccaacatattcatacatttccc27<210>21<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223><400>21ggcaccacaacaatataatcgttataacg29<210>22<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>22ccaataatggtaattagcccgattttgaag30<210>23<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223><400>23tcattgccattatgtctagagggttaatg29<210>24<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223><400>24ggaaaatagcttttctactgcaccca26<210>25<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>25ccgttgggttgatcgcctt19<210>26<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>26tctatccaggtgcggtaatcct22<210>27<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223><400>27gatatcgatttcgatgtattggtaagcac29<210>28<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223><400>28aacaatgtcggcactaactttgc23<210>29<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>29gtgagaaatcaccatgagtgacga24<210>30<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>30cagcattccaggtattagaagaatatcctg30<210>31<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>31ctgccagcgcatcaacaatatt22<210>32<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>32ccatattcaacgggaaacgtcttg24<210>33<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223><400>33atggataagaatgatgttgttaagaagatactt33<21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