一种抑制circ_0054853表达的siRNA及其应用的制作方法

文档序号:17791127发布日期:2019-05-31 20:15阅读:401来源:国知局
本发明属于医学材料技术和药物领域,具体地本发明涉及一种环状rnas核苷酸,尤其是涉及人环状rnas核苷酸。该核苷酸可与circ_0054853互补,从而抑制人circ_0054853的表达,与其他抗肿瘤药物其起到抗肿瘤的作用。
背景技术
:circrnas是一种普遍的其分子呈封闭环状结构的rna,可由外显子或内含子、非编码rna等环化形成。adar1、qki和dhx9等参与了circrnas形成过程的调控。circrnas通过多种方式发挥作用,研究表明circrnas含有mirna应答元件可以竞争性结合mirna,通过影响mirna方式调节基因表达的;有的circrnas可与小核糖核蛋白相互作用,调控基因的转录;部分circrnas可以调节pre-mrna的剪接,改变mrna含量,从而影响蛋白质的产量。在细胞的生长、增值、分化、周期调控和应激等多个过程中circrnas均起重要作用,其表达变化与神经系统疾病、糖尿病、冠心病以及多种癌症的发生、发展、和预后密切相关。rna干扰(rnainterference,rnai)技术利用双链小rna高效、特异性降解细胞内同源rna从而沉默靶基因,从而实现干扰靶基因的功能。近年,尽管临床上肿瘤的联合疗法得到普及,但是联合疗法对肿瘤患者的5年生存率提高不大,中晚期患者生存率更低,约为20%。部分化疗药物副作用大限制了药物的运用。因此,寻找更安全有效的靶向性联合疗法是提高肿瘤患者生存的途径。技术实现要素:本发明的目的在于提供一种能够特异高效地抑制circ_0054853表达的sirna及其应用。本发明的目的是这样实现的,包括合成核苷酸的序列由uaaaacguaugaacucuuguaggugaggga(seqidno.1)序列中的18-25连续核苷酸序列组成或者互补序列中的18-25连续核苷酸序列组成。特别是其包含序列:uaaaacguaugaacucuug(seqidno.2)和ugaacucuuguaggugaggga(seqidno.3)。核苷酸为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。核苷酸进一步被核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种修饰。修饰选自氟代修饰、硫代修饰、2-甲氧基修饰、胆固醇修饰、lna修饰中的一种或几种。核苷酸和其他抗肿瘤治疗药物特别是三价无机砷。制备治疗癌症药物中的应用。癌症包括:肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、大肠癌、胃癌、、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌症、慢性或急性白血病、脑瘤、食道癌、口腔癌、贲门癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、牙龈癌、尿道癌、皮肤癌、直肠癌、中耳癌、骨癌、睾丸癌、内分泌系统的癌症、淋巴细胞性淋巴瘤。本研究受国家自然科学基金的支持(81860572)。本发明(优点):发明的核苷酸具有很好的circ_0054853抑制效果,作用于特异性的靶位点,特异性强、毒性低、副作用小和修饰半衰期长,可以与多种抗肿瘤药物合用。具体实施方式下面对本发明作进一步的说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变换或替换,均属于本发明的保护范围。具体实施方式:实施例1本实施例中的沉默rna序列为:uaaaacguaugaacucuugdtdt(seqidno.2),以及互补序列caagaguucauacguuuuadtdt(seqidno.4)。所有的序列都是从5端到3端,其中dtdt是不足19核苷酸加上去了tt尾巴,由上海吉玛制药技术有限公司合成,circ_0054853的rna序列信息存在于ucsc数据库中。本研究受国家自然科学基金的支持(81860572)。对照合成首先,由上海吉玛制药技术有限公司合成核苷酸,合成包含其互补序列的双链rna序列,对照组使用吉玛制药技术有限公司的a06001序列为uucuccgaacgugucacgudtdt(seqidno.5)以及互补的acgugacacguucggagaadtdt(seqidno.6)作为阴性对照。细胞培养:将a549或者mba-md-231细胞在含有10%胎牛血清的1640培养基中培养,胎牛血清购自cellmax公司,1640培养基来自于hyclone,于37℃,5%co2条件下培养。收集生长状态良好的细胞,离心计数,以5000个每孔铺于96孔板内200000个接种于六孔板内,37℃,5%co2培养。rna转染:采用碧云天公司lipo8000tm转染试剂,按照操作说明进行操作,a549使用六孔板转染时候,六孔板中sirna量为每孔20ul,转染试剂为15ul,培养基为2ml,mba-md-231使用六孔板转染时候,六孔板中sirna量为每孔10ul,转染试剂为7.5ul,培养基为2ml,96小时检测沉默效果,其结果见表1。表1.circ_0054853沉默效果沉默效果对照组沉默组1沉默组1a5491.02±0.070.21±0.020.19±0.02mba-md-2311.04±0.090.13±0.050.12±0.01表1为本发明sirna沉默的效果表1,对照组使用的是阴性对照片段,沉默组1为实施例1沉默核苷酸片段的结果;沉默组2为实施例2沉默核苷酸片段的的结果,数据使用2^-δδct表示。a549使用96孔板转染时候96孔板sirna量为每孔0.5ul,转染试剂为0.5ul培养基为0.1ml,mba-md-231使用96孔板转染时候96孔板sirna量为每孔0.25ul,转染试剂为0.25ul培养基为0.1ml,二者转染后24小时加入亚砷酸钠a549加入30um(微摩尔每升),mba-md-2315um,其中一排不加入亚砷酸钠,再培养48小时后mts检测细胞活力,其结果见表2。表2.circ_0054853沉默后加入砷后活力(%)活力%未加砷组对照组实验组1实验组2a549100±4.5383±3.5259±2.9158±3.58mba-md-231101±5.6284±3.7741±1.9943±3.90表2为本发明mtt的结果表2;未加入砷组:不加入亚砷酸钠,对照组:为使用阴性对照片段后加入亚砷酸钠的结果,定为100%,实验组1实施例1沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果,实验组2实施例2沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果。mts检测采用promega公司celltiteraqueousonesolutioncellproliferationassay,an说明书的方法进行操作计算。检测沉默效果采用荧光定量pcr,pcr的条件是1、95度2-10分,2、95度10秒,3、60度10秒,4、72度15秒,pcr试剂采用罗氏或者康为世纪的,引物序列如下:ccctcacctacaagagttca(seqidno.7)和gctgcttgactgtttcagga(seqidno.8)采用2^δδct表示表达量。实施例2本实施例中的rna序列为:ugaacucuuguaggugaggga(seqidno.3),以及互补序列ucccucaccuacaagaguuca(seqidno.9)。细胞培养和转染等试验方法同实施例1,仅使用的沉默rna序列不同。沉默效果,其结果见表1,mtt其结果见表2。sequencelisting<110>昆明医科大学<120>一种抑制circ_0054853表达的sirna及其应用<130><140><141><160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>30<212>rna<213>人工序列<400>1uaaaacguaugaacucuuguaggugaggga30<210>2<211>19<212>rna<213>人工序列<400>2uaaaacguaugaacucuug19<210>3<211>21<212>rna<213>人工序列<400>3ugaacucuuguaggugaggga21<210>4<211>19<212>rna<213>人工序列<400>4caagaguucauacguuuua19<210>5<211>19<212>rna<213>人工序列<400>5uucuccgaacgugucacgu19<210>6<211>19<212>rna<213>人工序列<400>6acgugacacguucggagaa19<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ccctcacctacaagagttca20<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8tgctgcttgactgtttcagga21<210>9<211>21<212>rna<213>人工序列<400>9ucccucaccuacaagaguuca21当前第1页12
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