一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法与流程

本发明涉及脂肪间充质干细胞技术领域，具体为一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法。

背景技术：

脂肪间充质干细胞，又叫脂肪干细胞，是一种成体干细胞。研究证明，人脂肪来源、脐带来源、胎盘来源、骨髓来源的间充质干细胞均具有自我更新和多向分化潜能，在一定的诱导培养条件下能够分化成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，上皮细胞等，且具有免疫调节作用。脂肪间充质干细胞分化成脂肪细胞的能力强于其他组织来源的间充质干细胞，脂肪间充质干细胞在美容抗衰老方面具有显著的优势。

脂肪间充质干细胞是成体干细胞库的一重要成员，现有的分离技术存在一定的缺陷。传统的分离培养方法是将脂肪与消化酶混合之后放入摇床消化或者是加入一些活性添加剂，这使得分离过程的成本增高、对细胞产生机械损伤，繁琐的操作步骤也增加了污染的风险；此外，该分离方法导致所分离出来的细胞质量差，培养周期长，细胞易老化等风险；再者，以含动物源成分的培养体系进行扩增培养具有动物源性污染的风险。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤一，采集脂肪；步骤二，脂肪除杂；步骤三，混酶消化；步骤四，收集离心；步骤五，培养传代；步骤六，消化冻存；

其中在上述步骤一中，采集脂肪包括以下步骤：

1）采集人来源的脂肪2-100ml，放入无菌储存运输液中；

2）将采集的脂肪，消毒，清洗；

其中在上述步骤二中，将消毒清洗后的脂肪组织，放入离心管中用眼科剪剪碎组织，加入4~10倍体积生理盐水，1500-2000rpm离心5min离心后，将上层脂肪块吸取至离心管中加入生理盐水，再次洗涤离心；

其中在上述步骤三中，混酶消化包括以下步骤：

1）将上述步骤二中所得的脂肪组织中加入等体积的混合酶；

2）利用2ml移液器吹打分散脂肪团块，放入恒温恒湿co2培养箱中，消化10-30min；

其中在上述步骤四中，将上述步骤三中所得脂肪组织收集并离心，得到细胞沉淀；

其中在上述步骤五中，无血清培养包括以下步骤：

1）利用红细胞裂解液破解红细胞，离心后得到白色细胞沉淀；

2）用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿co2培养箱中；

3）24-40h后，可观察到大约20-40%融合的长梭形贴壁细胞时换液；

4）培养至第三天或第四天，细胞达到90%以上融合时，采用tryple™express进行消化；

5）将所得的细胞按照1:3~1:8的比例进行传代，用无血清体系培养；

其中在上述步骤六中，当培养的细胞达到90%以上融合时再采用tryple™express进行消化后冻存。

根据上述技术方案，所述步骤一1）中，人来源的脂肪可以是腹部脂肪块，大腿脂肪块，或者是抽脂的脂肪悬液。

根据上述技术方案，所述步骤一1）中，人来源的脂肪采集后放入无菌储存运输液中储存运输的温度为4~20℃。

根据上述技术方案，所述步骤一1）中，人来源的脂肪采集后12~24小时内运输至实验室进行分离处理。

根据上述技术方案，所述步骤一2）中，消毒清洗的方法为，将脂肪组织放入75%的酒精中浸泡2~3s，加入1~5倍量的生理盐水洗涤，离心后用止血钳将脂肪转移至离心管加入4~10倍体积生理盐水，颠倒混匀数次离心，重复2-3次。

根据上述技术方案，所述步骤三1）中，消化脂肪的混合酶配方为基础培养基添加0.05~0.25%的胶原酶collagenasetypeⅰ、0.05~0.25%的胶原酶collagenasetypeⅳ和5~10%的tryple™express。

根据上述技术方案，所述步骤三1）中，细胞在接种前接种的培养皿需要用5~25ug/cm²的纤维连接蛋白铺皿30min以上。

根据上述技术方案，所述步骤三2）中，脂肪消化10~30min后，用2ml移液器或者1ml移液枪反复吹散脂肪团块，再继续消化，以达到更好的消化效果。

根据上述技术方案，所述步骤五2）中，无血清培养体系配方为：低糖的dmem/f12添加5-30%hpl，5~50ng/mlbfgf。

根据上述技术方案，所述步骤五3）中，细胞贴壁培养24小时后，培养基上层可见油滴及少量杂质，此时换液并用10mldpbs清洗一次，将杂质去除。

根据上述技术方案，所述步骤五5）中，脂肪间充质干细胞在传代或冻存的消化过程使用tryple™express消化细胞，消化后加入生理盐水进行稀释，无需血清中和。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：该人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，采用混合酶分离，消化时间短，所得到的细胞不需要淋巴细胞分离液和过滤网的进一步纯化，只需在细胞贴壁之后换液即可，此方法分离过程成本低；分离操作，所使用的试剂物料少，操作流程简化，减少操作过程中的污染风险；整个分离和培养过程中均无使用动物源血清，降低细胞毒性；采用的混合酶和无血清培养体系的组成及配方使得培养周期短。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的工艺步骤图；

图2是本发明的工艺流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：

实施例1：

一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤一，采集脂肪；步骤二，脂肪除杂；步骤三，混酶消化；步骤四，收集离心；步骤五，培养传代；步骤六，消化冻存；

其中在上述步骤一中，采集脂肪包括以下步骤：

1）采集人来源的脂肪2-100ml，人来源的脂肪可以是腹部脂肪块，大腿脂肪块，或者是抽脂的脂肪悬液，放入无菌储存运输液中，储存运输的温度为4~20℃，人来源的脂肪采集后12~24小时内运输至实验室进行分离处理；

2）将脂肪组织放入75%的酒精中浸泡2~3s，加入1~5倍量的生理盐水洗涤，离心后用止血钳将脂肪转移至离心管加入4~10倍体积生理盐水，颠倒混匀数次离心，重复2-3次；

其中在上述步骤二中，将消毒清洗后的脂肪组织，放入离心管中用眼科剪剪碎组织，加入4~10倍体积生理盐水，1500-2000rpm离心5min离心后，将上层脂肪块吸取至离心管中加入生理盐水，再次洗涤离心；

其中在上述步骤三中，混酶消化包括以下步骤：

1）将上述步骤二中所得的脂肪组织中加入等体积的混合酶，消化脂肪的混合酶配方为基础培养基添加0.05~0.25%的胶原酶collagenasetypeⅰ、0.05~0.25%的胶原酶collagenasetypeⅳ和5~10%的tryple™express；

2）利用2ml移液器吹打分散脂肪团块，放入恒温恒湿co2培养箱中，消化10-30min后，用2ml移液器或者1ml移液枪反复吹散脂肪团块，再继续消化；

其中在上述步骤四中，将上述步骤三中所得脂肪组织收集并离心，得到细胞沉淀；

其中在上述步骤五中，无血清培养包括以下步骤：

1）利用红细胞裂解液破解红细胞，离心后得到白色细胞沉淀；

2）用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿co2培养箱中，无血清培养体系配方为：低糖的dmem/f12添加5-30%hpl，5~50ng/mlbfgf；

3）24-40h后，可观察到大约20-40%融合的长梭形贴壁细胞时换液，细胞贴壁培养24小时后，培养基上层可见油滴及少量杂质，此时换液并用10mldpbs清洗一次，将杂质去除；

4）培养至第三天或第四天，细胞达到90%以上融合时，采用tryple™express进行消化；

5）将所得的细胞按照1:3~1:8的比例进行传代，用无血清体系培养，脂肪间充质干细胞在传代或冻存的消化过程使用tryple™express消化细胞，消化后加入生理盐水进行稀释；

其中在上述步骤六中，当培养的细胞达到90%以上融合时再采用tryple™express进行消化后冻存。

其中，此方法培养脂肪间充质干细胞经流式检测cd90+，cd73+，cd105+，cd45-符合internationalsocietyforcellulartherapy（isct）和internationalfederationofadiposetherapeuticandsciences(ifats)的定义。

实施例2：

一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1）采集人来源的脂肪2-100ml，人来源的脂肪可以是腹部脂肪块，大腿脂肪块，或者是抽脂的脂肪悬液，放入无菌储存运输液中，储存运输的温度为4~20℃，人来源的脂肪采集后12~24小时内运输至实验室进行分离处理；

2）将脂肪组织放入75%的酒精中浸泡2~3s，加入1~5倍量的生理盐水洗涤，离心后用止血钳将脂肪转移至离心管加入4~10倍体积生理盐水，颠倒数次离心，重复2-3次；

3）采用liberase消化酶消化脂肪，消化30min后用含10%胎牛血清培养基中和消化作用，离心；

4）用淋巴细胞分离液分离纯化，先后用100微米和40微米的过滤网过滤；

5）采用市面上的科技公司生产的无血清体系培养于用1～10μg/ml的重组人纤连蛋白和1～10μg/ml的透明质酸包被过夜的培养瓶中。

进一步地，此方法培养脂肪间充质干细胞经体外成脂成骨诱导分化试验显示，培养至p10代。

基于上述，本发明的优点在于，本发明培养的脂肪间充质干细胞4天便可进行传代培养，7-10天可完成p0，p1种子库的建立；脂肪间充质干细胞成长梭者多边形，细胞稳定传代至第10代，形态不变，且仍能诱导分化成脂肪细胞和骨细胞；具有操作过程温和、时间短、细胞得率高的优点；采用无血清培养体系下培养高效分离脂肪干细胞的方法，规避动物源性污染；与传统的分离培养方法相比，降低了分离成本，提高了分离培养效率。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。