一种与小麦抗条锈病基因Yr26紧密连锁的分子标记、引物及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁的分子标记、引物及其应用。

背景技术：

小麦条锈病是影响世界小麦安全生产的重要病害，每年都造成数百万吨的产量损失。我国曾多次发生全国性条锈病大流行。进入21世纪以来，由于高致病性新小种不断出现和发展，造成了西北、西南麦区小麦条锈病连年成灾，且呈现高发态势。由于主要依靠化学防治，农药残留与环境污染日趋严重，给我国粮食生产安全和生态环境造成严重威胁。培育抗病性持久而稳定的小麦品种是持续有效控制条锈病的最为经济且环境友好的措施。

在上世纪70年代，刘大钧院士和陈佩度教授等利用四倍体圆锥小麦γ80-1与簇毛麦杂交，再将后代与六倍体普通小麦多次回交，并从中鉴定选育出小麦-簇毛麦6vs/6al易位系。其亲本来源有“扬麦5号/4/γ80-1/簇毛麦//宁麦6号/3/扬麦2号”，该易位系包括92r137、92r89、92r90、92r149等种质，简称“92r系列”。随后先后定位到位于6vs上的抗白粉基因pm21和位于1bl上的抗条锈基因yr26。由于该易位系良好的抗性于上世纪90年代开始广泛应用在小麦育种中，育种家利用该易位系先后培育出内麦系列(8号—11号)、石麦14、远中175、扬麦18等十八个小麦抗病新品种。这些新品种累积推广面积超过六千万亩，为小麦累积增产15亿公斤(http://www.cutech.edu.cn/cn/gxkj/2013/01/1354173454039838.htm)。

yr26最初由马渐新等定位在1b染色体短臂上(1bs)，并与xgwm11、xgwm18和xgwm413连锁；而王春梅等利用中国春小麦的细胞遗传学特殊材料(缺体、缺失系)将yr26定位在1b染色体长臂上的c-1bl6-0.32区域，且开发出yr26基因两翼标记最近为xwe173(1.4cm)和xbarc181(6.7cm)；后张小娟等通过比较基因组学利用小麦est序列信息与水稻、短柄草共线区域开发设计了许多更紧密连锁标记，绘制了较为精细的遗传图谱。此外，其他科研工作者对来自贵州大学张庆勤教授培育的“贵农系”材料研究发现其抗条锈来源绝大部分为yr26；而来自cimmyt“合成小麦”由四川农科院引进并培育出的川麦42及其衍生系列材料经研究分析，其抗源来自yrch42(lietal.2006)，而后经证实yrch42与yr26(yr24)为同一个基因或同一等位基因。

由于yr26广泛的应用，导致条锈小种出现了变异，2008年首次在四川发现yr26毒性小种v26，随后几年里v26小种频率持续上升，且在西北、西南等地区大量存在，已对我国小麦粮食生产构成威胁。但含有yr26基因的品种广泛种植，短期内不可能全部淘汰，且yr26对仍然处于流行地位的cyr32和cyr33依旧保持良好抗性，因此，可以通过yr26与其他成株期基因聚合的方式提高及延长其抗病性，而开发与yr26基因更为紧密连锁的分子标记显得尤为迫切。

技术实现要素：

本发明提供了一种与小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁的分子标记、引物及其应用，以简便、快速、高通量地应用于小麦分子辅助育种。

本发明的第一个目的是提供一种与小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁的分子标记wrs1633，该标记位于小麦1b染色体第326913074-326914227位，与小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁，其核苷酸序列如序列表中的seqidno.1所示。

本发明的第二个目的是提供与小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁的分子标记的引物，所述引物的序列为：

上游引物wrs1633f如序列表中seqidno.2所示；

下游引物wrs1633r如序列表中seqidno.3所示。

本发明的第三个目的是提供一种所述分子标记在小麦抗条锈病基因yr26检测或小麦辅助育种中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种所述引物在小麦抗条锈病基因yr26检测或小麦辅助育种中的应用。

本发明提供的一种利用所述引物检测小麦抗条锈病基因yr26的方法，具体包括以下步骤：

s1，提取待检测小麦的基因组dna；

s2，以所述小麦的基因组dna为模板，以上游引物wrs1633f和下游引物wrs1633r为引物进行pcr扩增；

s3，琼脂糖凝胶电泳检测，如果扩增后的产物片段大小为1364bp，则待测小麦含有抗条锈病基因yr26，检测不到1364的扩增条带，则待测小麦不含有抗条锈病基因yr26。

优选地，利用所述引物检测小麦抗条锈病基因yr26的方法中：

所述pcr体系为：10×baffer的缓冲液1.5ul，25μm/μl的mgcl20.9ul，2.5mm/μl的4种dntp混合物各0.2ul，10μm/μl的wrs1633r和wrs1633f各1.0ul，5u/μl的taq酶0.15ul，50ng/μl的模板dna1.5ul，加ddh2o至15ul；

反应程序：1)94℃5分钟；2)94℃30秒，55℃1分钟，72℃1分钟，从第二步开始循环，共进行35个循环；3)72℃10分钟。

由于采用以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于本发明提供了与小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁的分子标记，有利于小麦分子标记辅助育种体系的建立所述的分子标记与yr26基因为共分离，本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于小麦分子辅助育种。

附图说明

图1、利用wrs1633引物组对感病亲本avocets、抗病亲本92r137、f7重组自交系群体的扩增结果电泳图，其中，泳道1-10分别为avocets、92r137、arf7-3、arf7-7、arf7-12、arf7-34、arf7-2、arf7-4、arf7-8、arf7-25。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件操作，未注明的材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

本发明提供了一种与小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁的分子标记wrs1633，该标记位于小麦1b染色体第326913074-326914227位，与小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁，其核苷酸序列如seqidno.1所示。在遗传连锁图谱中(用超过20000个f2代个体绘制的图谱)，该分子标记与小麦抗条锈病基因yr26共分离，或者在小麦的大于20000个样本中，具有条锈病抗性的样本中含有该分子标记。其中，叶片不产生条锈菌孢子且具有过敏性坏死反应症状的为条锈病抗性。

上述分子标记wrs1633的获得方法如下：

取供试小麦材料的小麦基因组dna(小麦材料为92r137与感病材料avocets杂交后f1自交产生的f2代中的具有条锈病抗性的个体)，小麦基因组dna的抽提参见常规的分子生物学操作步骤；设计引物；以供试小麦基因组dna为模板进行pcr扩增。

引物来源于前期本实验室进行的基因组重测序以捕获测序，经过sanger测序验证。

上游引物wrs1633f:5’-gagaggaaacaagcgagcga-3’，如seqidno.2所示；

下游引物wrs1633r:5’-cttcgtcttgtggcattccg-3’，如seqidno.3所示；

所述pcr体系为：10×baffer的缓冲液1.5ul，25μm/μl的mgcl20.9ul,2.5mm/μl的4种dntp混合物各0.2ul，10μm/μl的wrs1633r和wrs1633f各1.0ul，5u/μl的taq酶0.15ul，50ng/μl的模板dna1.5ul，加ddh2o至15ul；

反应程序：1)94℃5分钟；2)94℃30秒，55℃1分钟，72℃1分钟，从第二步开始循环，共进行35个循环；3)72℃10分钟。

扩增序列经测定为seqidno.1，该pcr产物即为小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁的分子标记wrs1633。

基于同一种发明构思，本发明还提供了上述引物小麦抗条锈病基因yr26检测中的应用，具体包括以下步骤：

以被检测小麦的基因组dna为模板，以引物wrs1633f(如seqidno.2所示)和wrs1633r(如seqidno.3所示)进行扩增，得到扩增产物，将得到的扩增产物进行测序以及凝胶电泳。

具体的pcr反应体系见表1：

表1

pcr程序为：1)94℃5分钟；2)94℃30秒，55℃1分钟，72℃1分钟，从第二步开始循环，共进行35个循环；3)72℃10分钟。

图1为wrs1633引物对感病亲本avocets、抗病亲本92r137、f7重组自交系群体的扩增结果，泳道1-10分别为avocets、92r137、arf7-3、arf7-7、arf7-12、arf7-34、arf7-2、arf7-4、arf7-8、arf7-25。结果表明wrs1633能在抗病亲本92r137和含有yr26的后代家系中成功扩增出一段1364bp大小的pcr产物，而感病亲本和不含有yr26的后代家系中则不存在这样的一段pcr产物，说明利用分子标记wrs1633可以进行小麦抗条锈病抗性的检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种与小麦抗条锈病基因yr26紧密连锁的分子标记、获得方法及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1364

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gagaggaaacaagcgagcgatcggctgacactgacaaaatgagaaaggaagaaacaaata60

aaagatctgagaaaataatcgatggtatgtggcacatccaagaacaggtggtaccaaata120

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<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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