一种适合凝结芽孢杆菌BC01的培养基及其发酵方法与流程

本发明属于发酵工程技术领域，更具体地说，涉及一种适合凝结芽孢杆菌bc01的高密度发酵和高产芽孢率的培养基。

背景技术：

凝结芽孢杆菌bc01是本公司从四川泡菜中筛选得到的一株具有极大益生潜力的菌株。

凝结芽孢杆菌bc01在分类学上属于芽孢杆菌属，在其生命周期中存在两种生命形态：

(1)营养体形态在该形态下凝结芽孢杆菌可以生长繁殖以及生成各种代谢产物。但营养体形态的凝结芽孢杆菌抗逆性能比较差，不耐高温、耐酸碱和化学试剂的能力也比较弱。

(2)芽孢体形态该形态是凝结芽孢杆菌的休眠形态，处于该形态时菌体不能生长繁殖，但具有超强的抗逆性，耐高温、耐酸碱，并且在营养条件合适时能够重新转化为营养体形态发挥益生功效。

因此，当凝结芽孢杆菌应用于健康产业时，我们多希望其产品形态为芽孢体，这样便于产品的存储、运输以及扩大产品的应用场景。当芽孢体态的凝结芽孢杆菌被人摄入进体内后，可以在小肠及大肠中重新萌发，转变成营养体形态发挥益生功效。

因此，在制备凝结芽孢杆菌活菌粉的时候，努力提高发酵液菌体的芽孢率就显得尤为重要。但凝结芽孢杆菌产芽孢需要具体的发酵条件和营养条件，在特定的发酵条件下，营养条件决定了发酵液中的菌体密度以及芽孢形成率。营养条件太丰富难以形成芽孢，营养条件太差则发酵液的菌体密度低，生产成本高且也难以形成芽孢。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供了一种适合凝结芽孢杆菌bc01的培养基，在特定的发酵条件下，发酵液中的菌体密度可以达到20亿cfu/ml～70亿cfu/ml。并且在菌体密度达到最大时，还有足够的营养将营养体细胞转化为芽孢体细胞。在发酵末期，发酵液的芽孢体率大于85％。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种适合凝结芽孢杆菌bc01的培养基，其特征在于：其以重量百分比计各组分为：乳糖：1％-5％、葡萄糖：2％-5％、蛋白胨：1％-3％、酵母粉：1％-3％、硫酸镁：0.1％-1％、硫酸锰：0.01％-1％、吐温80：0.1％-1％、生物素：0.1％-1％、氯化钙：0.2％-1％。

作为一种优化的技术方案，其以重量百分比计各组分为：

种子培养基：乳糖1％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母粉1％、硫酸镁0.1％、硫酸锰0.01％、吐温80：0.1％、生物素0.1％；

发酵培养基：乳糖2％、葡萄糖2％、蛋白胨2.5％、酵母粉2.5％、硫酸镁0.5％、硫酸锰0.05％、吐温80：0.5％、生物素0.2％、氯化钙0.5％。

作为一种优化的技术方案，其以重量百分比计各组分为：

种子培养基：乳糖3％、葡萄糖3％、蛋白胨2％、酵母粉2％、硫酸镁0.3％、硫酸锰0.11％、吐温80：0.2％、生物素0.2％；

发酵培养基：乳糖5％、葡萄糖5％、蛋白胨3％、酵母粉2％、硫酸镁0.8％、硫酸锰0.45％、吐温80：0.6％、生物素0.3％、氯化钙0.5％。

本发明还提供了一种适合凝结芽孢杆菌bc01的培养基的发酵方法，其特征在于：

步骤如下：

(1)配置种子培养基和发酵培养基：

种子培养基：乳糖1％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母粉1％、硫酸镁0.1％、硫酸锰0.01％、吐温80：0.1％、生物素0.1％；

发酵培养基：乳糖2％、葡萄糖2％、蛋白胨2.5％、酵母粉2.5％、硫酸镁0.5％、硫酸锰0.05％、吐温80：0.5％、生物素0.2％、氯化钙0.5％；

配置完毕后，调培养基初始ph至6.5，121℃灭菌20分钟。

(2)种子培养基接种与培养

待种子培养基温度降至45℃以下时，将凝结芽孢杆菌bc01从甘油管接种到一定量的种子培养基，接种量0.5％、40℃、摇床转速：220rpm，培养至种子od562＞4.0。

(3)发酵培养基的接种与培养

待发酵培养基温度降至45℃以下时，将凝结芽孢杆菌bc01从种子培养基接种到发酵培养基；接种量0.5％、发酵温度：40℃、转速300rpm、通气量：15l/min、发酵ph：5.8、发酵过程do＞85％。

(4)在此发酵条件和发酵培养基下，凝结芽孢杆菌bc01的发酵液最终芽孢体浓度可以＞30亿cfu/ml，芽孢率＞85％。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明中，乳糖为白色的结晶性颗粒或粉末；无臭，味微甜。甜度是蔗糖的15％，而β-乳糖比α-乳糖的甜度大。市场上有多种乳糖供应：无水α-乳糖、α-乳糖一水合物和叫少量的无水β-乳糖。

葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质，在糖果制造业和医药领域有着广泛应用。

蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。在胃内蛋白质的初步消化产物之一就是蛋白胨。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。它可以作为微生物培养基的主要原料，在抗生素、医药工业、发酵工业、生化制品及微生物学科研等领域中的用量均很大。

吐温80，即为：聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，简称聚山梨酯-80。吐温80易溶于水，溶于乙醇、植物油、乙酸乙酯、甲醇、甲苯，不溶于矿物油。低温时成胶状，受热后复原。有特臭，味微苦，对酞菁绿的分散有一定帮助。

生物素，即人们所熟知的维生素h，它能使身体将食物转化为自身能量。生物素有利于细胞的健康和再生。

氯化钙可增加细菌细胞壁的通透性。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明在特定的发酵条件下，发酵液中的菌体密度可以达到20亿cfu/ml～70亿cfu/ml。并且在菌体密度达到最大时，还有足够的营养将营养体细胞转化为芽孢体细胞。在发酵末期，发酵液的芽孢体率大于85％。

参照附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为本发明一种实施例中发酵过程的凝结芽孢杆菌营养体与芽孢体活菌数变化趋势图；

图2是本发明一种实施例中凝结芽孢杆菌bc01的芽孢率显微镜镜检图片。

具体实施方式

实施例

一种适合凝结芽孢杆菌bc01的培养基，其以重量百分比计各组分为：

种子培养基：乳糖1％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母粉1％、硫酸镁0.1％、硫酸锰0.01％、吐温80：0.1％、生物素0.1％。

发酵培养基：乳糖2％、葡萄糖2％、蛋白胨2.5％、酵母粉2.5％、硫酸镁0.5％、硫酸锰0.05％、吐温80：0.5％、生物素0.2％、氯化钙0.5％。

上述的重量百分比是在常温常压情况下最佳的配比。如果是在高原地区，气压较低，氧气含量交底，最佳的质量百分比是：

种子培养基：乳糖3％、葡萄糖3％、蛋白胨2％、酵母粉2％、硫酸镁0.3％、硫酸锰0.11％、吐温80：0.2％、生物素0.2％；

发酵培养基：乳糖5％、葡萄糖5％、蛋白胨3％、酵母粉2％、硫酸镁0.8％、硫酸锰0.45％、吐温80：0.6％、生物素0.3％、氯化钙0.5％。

高原地区仅为特定使用。

一种适合凝结芽孢杆菌bc01的培养基的发酵方法，其特征在于：

步骤如下：

(1)配置种子培养基和发酵培养基：

种子培养基：乳糖1％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母粉1％、硫酸镁0.1％、硫酸锰0.01％、吐温80：0.1％、生物素0.1％；

发酵培养基：乳糖2％、葡萄糖2％、蛋白胨2.5％、酵母粉2.5％、硫酸镁0.5％、硫酸锰0.05％、吐温80：0.5％、生物素0.2％、氯化钙0.5％；

配置完毕后，调培养基初始ph至6.5，121℃灭菌20分钟。

(2)种子培养基接种与培养

待种子培养基温度降至45℃以下时，将凝结芽孢杆菌bc01从甘油管接种到一定量的种子培养基，接种量0.5％、40℃、摇床转速：220rpm，培养至种子od562＞4.0。

(3)发酵培养基的接种与培养

待发酵培养基温度降至45℃以下时，将凝结芽孢杆菌bc01从种子培养基接种到发酵培养基；接种量0.5％、发酵温度：40℃、转速300rpm、通气量：15l/min、发酵ph：5.8、发酵过程do＞85％。

(4)在此发酵条件和发酵培养基下，凝结芽孢杆菌bc01的发酵液最终芽孢体浓度可以＞30亿cfu/ml，芽孢率＞85％。

附图1为步骤(3)中发酵过程的凝结芽孢杆菌营养体与芽孢体活菌数变化趋势图。

附图2为步骤(4)中发酵至20小时时，凝结芽孢杆菌bc01的芽孢率显微镜镜检图片。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明在特定的发酵条件下，发酵液中的菌体密度可以达到20亿cfu/ml～70亿cfu/ml。并且在菌体密度达到最大时，还有足够的营养将营养体细胞转化为芽孢体细胞。在发酵末期，发酵液的芽孢体率大于85％。

本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。