鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法及试剂盒与流程

本发明属于分子生物学鉴定技术领域，具体涉及一种用于乳制品等食品中动物源性成分鉴别的pcr高分辨熔解方法及试剂盒。

背景技术：

乳制品是人类健康膳食的主要营养来源，在蛋白质、矿物质、脂肪、维生素等方面含量及种类丰富，深受消费者喜爱，随着生活水平的提高，人们对乳制品的需求量不断提升，乳制品市场成为了一个很大的销售市场。在经济利益的驱使下，商家使用各种手段尽可能地缩减成本，掺假售假的现象层出不穷。主要的掺假行为有：在乳制品生产过程中，以次充好，制假造假，如在羊乳中混入营养价值和价格相对较低的其他动物乳或非乳原料，这种情况下，乳制品的品质已经无法保证，存在损害消费者健康的风险。因此，鉴别乳制品中的动物源性成分确有必要。

目前应用于乳制品的掺假检测方法，主要以乳制品中两大生物分子的检测为方向，一种是依据蛋白质分子在结构、性质之间的差异性所建立的方法，涉及色谱、质谱、免疫、电泳等。但是色谱和质谱价格昂贵，无法普及，而免疫法特异性较低，电泳法耗时长，并且以上检测方法均因蛋白质受热容易变性，对于经过均质、杀菌等热处理的乳制品而言，检测效果并不理想，所以实用价值不高。另外一种是基于dna差异建立的检测方法，尽管近年来专门提取dna的试剂盒法应用的比较广泛，但目前基于dna检测的方法也有一定的局限性。例如，琼脂糖凝胶电泳中pcr扩增产物易受污染，且速度较慢；荧光定量pcr中，探针设计比较复杂且成本比较高。最新应用的检测技术中，膜芯片法和液相芯片法都需要对pcr扩增产物进行杂交处理，存在污染的可能性，且无法判定掺假比例，只能确定某种动物源性成分的有无；基因条形码技术sanger测序法，需要进一步测序，步骤多且耗时长。即以上检测方法存在耗时、不经济、检测结果不准确等问题。

高分辨熔解曲线分析(highresolutionmeltinganalysis,hrm)是一种荧光pcr检测技术，其主要原理是双链的熔解行为取决于gc含量、dna双链的长度，以及碱基的互补性差异，通过在dna熔解过程中实时检测饱和荧光染料信号改变获得熔解曲线，实现样品差异的分析。这种分析方法，是一种闭管技术，由于使用了针对该方法所开发的饱和染料，出现非特异性扩增和抑制pcr扩增的可能性很少，结合采用的更加精密的分析仪器和软件，数据收集和分析更加全面，将其用于乳制品中动物源性成分的鉴定，可以实现关系密切物种间的精准鉴别。

由于乳制品等食品中的动物源性成分所含线粒体dna在经历高温、高压或化学处理等加工过程后，性质依旧稳定，以及具有种属特异性，所以更为适合用于分析动物源性成分的组成。但目前尚无利用通用引物进行高分辨熔解曲线分析并实现快速、经济、准确分析和鉴别动物源性成分的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法及试剂盒，本发明基于pcr高分辨熔解的方法，用以快速、经济、准确地鉴别乳制品等食品中的动物源性成分。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，包括以下步骤：

1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，利用物种间在某段基因组dna上的序列保守性和特异性选取或设计通用引物；

2)对通用引物进行扩增及扩增产物熔解的特异性检验；

3)以提取自所述样品中的dna为模板，利用经过检验确定的通用引物进行pcr扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，根据高分辨熔解曲线的位置、形状、差异化图的特征中的任意一种或多种鉴别样品中的动物源性成分的构成情况。

优选的，所述样品采集自乳制品或生乳。

优选的，所述动物种类包括山羊、绵羊、牛、水牛中的两种以上。

优选的，所述pcr扩增采用的反应体系包括dna模板、通用引物、pcr反应试剂(例如，2×tappcrmastermix)、双蒸水以及荧光染料。

优选的，所述pcr扩增采用的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃再延伸5min。

优选的，所述高分辨熔解的程序为：在闭管条件下，pcr扩增的产物的熔解温度从65℃以0.05℃/s逐渐升温到95℃，从65℃开始收集荧光信号。

优选的，所述步骤3)中，将样品对应的高分辨熔解曲线与对照品(采用通用引物进行pcr扩增后)对应的高分辨熔解曲线进行二维或三维主成分分析，根据分析结果确定样品与不同对照品所对应的高分辨熔解曲线的区分度，依据区分度确定样品中动物源性成分的构成(参考与样品区分度低，或者说，与样品分析得到的主成分属于相同的一类的对照品)，所述对照品选自不同动物源性成分各自的基因组dna或相应不同基因组dna的任意组合。

优选的，经过步骤3)后或直接对于确定含有两种动物源性成分的样品，对该样品对应的高分辨熔解曲线进行二维主成分分析，然后根据主成分-混合比例标准回归方程计算得到所述样品中两种动物源性成分的比例。

优选的，所述标准回归方程是通过将两种动物源性成分各自对应的基因组dna及两种动物源性成分对应的基因组dna不同比例的混合物分别作为模板进行pcr扩增及高分辨熔解，并将各扩增产物的高分辨熔解曲线经二维主成分分析所得到的主成分的横坐标与对应的动物源性成分混合比例进行线性回归分析而得到的。

一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解试剂盒，包括上述通用引物、pcr反应试剂、双蒸水、荧光染料、标准回归方程以及对照品对应的高分辨熔解曲线。

优选的，试剂盒还包括不同动物源性成分的基因组dna。

本发明的有益效果体现在：

本发明采用基于通用引物pcr高分辨熔解方法，通过分析高分辨熔解曲线的形状等特征来鉴别样品中的动物源性成分，保证了检测结果的可重复性，提高了检测的灵敏度，具有操作简单、检测快速、检测样品通量高、检测结果精准的优点，适用于乳制品等含有动物源性成分的食品的掺假检测及溯源鉴定。本发明采用通用引物扩增目标dna，不仅可以准确鉴别乳制品等食品中的动物源性成分，而且相对于传统的多重pcr，克服了引物对之间相互竞争、pcr反应条件优化难度大等问题，检测效率显著提高。

进一步的，本发明利用标准回归方程，可以快速、准确的得到某动物源性乳制品中掺入的另一种动物源性成分的比例。

附图说明

图1为山羊、绵羊、牛、水牛扩增目的基因序列选取及比对图；

图2为可行性分析结果图；其中：(a)理论拟合的山羊、绵羊、牛、水牛高分辨熔解曲线，(b)实验得到的山羊、绵羊、牛、水牛高分辨熔解曲线，(c)不同物种的扩增曲线和琼脂糖凝胶电泳图，(d)不同物种的熔解峰图；

图3为15种不同组分检测结果图；其中：(a)高分辨熔解曲线，(b)差异化图，(c)二维主成分分析图，(d)三维主成分分析图；

图4为不同掺假比例检测结果图；其中：(a)不同掺假比例的牛和水牛样品主成分分析图，(b)不同掺假比例的牛和水牛样品标准曲线，(c)不同掺假比例的牛和山羊样品主成分分析图，(d)不同掺假比例的牛和山羊样品标准曲线；

图中：英文字母g、s、b、w、d、h、c、r、du、do、f、p、ntc依次代表山羊、绵羊、牛、水牛、驴、马、鸡、兔、鸭、鸽子、鱼、猪、空白(双蒸水)。电泳泳道m代表marker，泳道1-10分别代表山羊、绵羊、牛、水牛、驴、马、兔、鸡、鸭、双蒸水。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

(一)实验材料来源

鲜牛乳样品采自西安市未央区草滩奶牛场；鲜羊乳采自西安市未央区市场；鲜水牛乳和绵羊乳购买自淘宝网，生乳于-20℃保存备用，样品中基因组dna提取采用磁珠分离法基因组dna提取试剂盒。非目标基因组dna(驴、马、兔子、鸡、鸭、鸽子、鱼、猪)均购于四川华汉三创生物科技有限公司。获取时间均为2018年6月。

(二)序列比对及目的基因选取

针对于牛、羊等选取的通用引物的序列为(gb/t21104-2007)：

上游引物：5’-tttggtcccagccttcctgtt-3’；

下游引物：5’-cttagtcaaactttcgttt-3’。

依据所选取的通用引物，以及nbci上牛、水牛、山羊、绵羊的完整的线粒体dna序列，利用bioedit软件对牛、水牛、山羊、绵羊4个物种的dna扩增序列进行比对(以山羊的扩增序列为参照)，比对结果如图1所示，可以很明显地看到，4个物种的碱基之间有差异，说明使用该通用引物，理论上可以扩增出这4个不同的物种的线粒体dna片段。

(三)可行性分析

对牛、水牛、山羊、绵羊的dna扩增序列，利用u-melt软件拟合高分辨熔解曲线，拟合结果如图2(a)所示，图中显示各扩增序列都有自己独特特征的高分辨熔解曲线，因此从理论上证明了应用此通用引物可以鉴别四种动物的dna。

进一步利用上述通用引物、以提取自牛、水牛、山羊、绵羊的生乳中的基因组dna为模板，进行pcr扩增，对扩增产物做高分辨熔解实验验证。

所述扩增采用的pcr反应体系为：1μl(20ng/μl)dna模板，各0.25μl(10μm)的上游引物和下游引物，5μl2×tappcrmastermix，0.5μl20×evagreen染料，加水补足至10μl。

所述扩增采用的pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃再延伸5min。在退火阶段采集荧光，用于获得扩增曲线。

所述高分辨熔解的程序为：扩增产物在闭管条件下，熔解温度从65℃以0.05℃/s逐渐升温到95℃，从65℃开始收集荧光信号。

实验结果见图2(b)，实验获得的熔解曲线与理论拟合的曲线类似，因此确证了利用高分辨熔解曲线对牛、水牛、山羊、绵羊4个物种dna鉴别分析的可行性。此外，利用上述通用引物扩增驴、马、兔子、鸡、鸭、鸽子、鱼、山羊、绵羊、牛、水牛、猪的dna以及做模板空白对照，图2(c)的实验结果显示，只有牛、水牛、山羊、绵羊这4个物种的dna具有对应的扩增曲线并出现扩增条带，并且只有以上4个物种存在明显的熔解峰且区分良好，见图2(d)，即上述通用引物对于牛、水牛、山羊、绵羊4个物种具有扩增特异性。综上所述，基于通用引物的高分辨熔解方法可以准确鉴别牛、水牛、山羊、绵羊的动物源性成分，特异性良好。

(四)不同组分检测

模拟实际样品，以可能存在的15种不同基因组dna组分(牛、水牛、山羊、绵羊4个物种中的一种或多种的混合)为模板，分别进行pcr扩增，扩增完成后，立即进行高分辨熔解，熔解结束后，分析实验得到高分辨熔解曲线和差异化视图。实验结果如图3(a)、(b)所示，各熔解曲线位置之间区分明显且稳定、物种关系比较近的山羊和绵羊、牛和水牛在差异化视图中也区分显著，图3(c)、(d)为对高分辨熔解曲线轮廓进行二维、三维主成分分析(https://www.metaboanalyst.ca//faces/moduleview.xhtml)的结果，分析结果中显示，不同组分组成的样品分属不同区域且具有一定的区分度，证明通过对扩增产物进行高分辨熔解曲线分析(主成分分析)，可鉴别不同的动物源性成分及其混合物。

(五)不同比例掺假样品检测

5.1区分不同比例的水牛/牛样品：

将水牛和牛的基因组dna作为模板(20ng/μl)，按照95:5、90:10、80:20、50:50、20:80、10:90的比例(v/v)混合，做7组扩增实验，再分别以水牛基因组dna和牛基因组dna做2组单一模板的对照扩增实验。每组实验均设置3个重复，扩增结束后分别进行高分辨熔解，并获得高分辨熔解曲线，对各曲线轮廓分别进行二维主成分分析，然后将混合比例与其在主成分分析图中对应的横坐标进行线性回归分析，得到图4(a)、(b)的实验结果。图4(a)所示主成分分析结果显示，虽然含有相同的动物源性成分，但由于混合比例不同，不同混合比例下的高分辨熔解曲线分布于不同的范围内，并且，每个混合比例下的三个重复被划为主成分相同的一类，随着牛dna掺入水牛dna中的比例上升，越靠近主成分为牛(对照组)的范围。根据图4(b)，混合比例和主成分分布位置呈明显的线性关系，且可以区分混合比例不同的牛和水牛dna样品。

5.2区分不同比例的山羊/牛样品：

将山羊和牛的基因组dna作为模板(20ng/μl)，按照95:5、90:10、50:50、20:80、10:90的比例(v/v)混合，做5组扩增实验，再分别以山羊基因组dna和牛基因组dna做2组单一模板的对照扩增实验，每组实验均设置3个重复，扩增结束后分别进行高分辨熔解，并获得高分辨熔解曲线，对各曲线分别进行二维主成分分析，将混合比例与其在主成分分析图中对应的横坐标进行线性回归分析，得到图4(c)、(d)的实验结果。图4(c)所示主成分分析结果显示，虽然含有相同的动物源性成分，但由于混合比例不同，不同混合比例下的高分辨熔解曲线分布于不同的范围内，并且，每个混合比例下的三个重复被划为主成分相同的一类，随着牛dna掺入山羊dna中的比例上升，越靠近主成分为牛dna(对照组)的范围。根据图4(d)，混合比例和主成分分布位置呈明显的线性关系，且可以区分混合比例不同的山羊和牛dna样品。

本发明的特点如下：

1.相对于传统的多重pcr，本发明采用通用引物，可以克服引物对之间相互竞争、灵敏度低、pcr反应条件优化难度大等问题。

2.利用通用引物选取的扩增序列，通过软件拟合高分辨熔解曲线，根据熔解曲线的区分度，可以预测未知物种检测的可能性。

3.检测样品通量高，在一次扩增反应中，可同时准确鉴别四个不同物种的dna。

4.检测步骤简单且快速，pcr扩增产物无需进行凝胶电泳分析或dna测序、或者杂交分析过程，只需将闭管的样品扩增产物放入高分辨熔解仪器熔解即可，耗时短且污染低。

5.本发明可以直接应用于水牛乳中掺入牛乳的掺假水牛乳制品的鉴定，以及山羊乳中掺入牛乳的掺假山羊乳制品的鉴定，并给出掺入比例。

6.结合一定的样品dna分离技术，本发明可以广泛应用于生乳、乳制品及其他食品原料、产品中动物源性成分的鉴别。

<110>陕西科技大学

<120>鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法及试剂盒

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<212>dna

<213>人工合成

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<212>dna

<213>人工合成

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