一种产胆固醇氧化酶菌株的筛选方法与流程

本发明涉及一种细菌筛选的技术领域，具体是一种产胆固醇氧化酶菌株的筛选方法。

背景技术：

胆固醇氧化酶(3β-羟固醇氧化酶；chox，ec1.1.3.6)最早被发现在1943年，是黄素蛋白氧化还原酶家族中的成员之一。该酶主要作用于胆固醇碳3位置，发生氧化脱氢反应，此外它具有异构化酶作用，催化胆固醇氧化后的第一步产物胆甾-5-烯-3-酮发生异构反应生成终产物胆甾-4-烯-3-酮。

近年来，微生物胆固醇氧化酶因其广泛应用于血清胆固醇测定的医学应用而备受关注。由于胆固醇氧化酶对甾醇具有较强的氧化活性，它已被用于临床和食品样品中胆固醇和植物甾醇的测定。目前，胆固醇氧化酶在实验室中有广泛的临床应用，如在食物和血清中定量胆固醇水平，这对动脉粥样硬化、心血管疾病和其他脂类疾病的诊断很重要。此外，胆固醇氧化物酶也被用于许多非甾体化合物、烯丙醇和固醇的生物转化。现在的筛选技术在筛选过程中没有明显的颜色变化，不便于观察；或是利用薄层层析操作繁琐。

技术实现要素：

本发明的目的是针对目前筛选技术的不足环节，提供针对以胆固醇为唯一碳源且大量产生胆固醇氧化酶菌株的一种高效准确的筛选方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

(1)初筛：将样品用无菌水稀释后，经过富集，再涂布于以胆固醇为唯一碳源的筛选平板上，挑选能够产生蓝紫色的菌株；

(2)复筛：将上述初筛菌株经活化后接种到发酵培养基中，20-30℃培养48h测定胞外胆固醇氧化酶活性。

步骤(1)中所述初筛过程的筛选固体培养基成分如下：胆固醇1.5466g/l，酵母膏0.5-10g/l，氯化钠2-10g/l，磷酸二氢钾1-10g/l，磷酸氢二钾0.5-10g/l，硫酸镁0.5-10g/l，淀粉10-20g/l，碘化钾1-10g/l，琼脂20-40g/l。

步骤(2)中所述复筛过程的发酵培养基成分如下：葡萄糖10g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，胆固醇2g/l，tween-801ml/l，ph6.5。

所述酶活测定过程的测定体系成分如下：2,2-联氮(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(简称abts)与hrp混合液3ml，胆固醇工作液200μl，粗酶液50μl。

所述abts-hrp混合液配置如下：称取0.0183gabts和0.0021ghrp(250u/mg)，用0.05m磷酸钾缓冲液(ph7.2)溶解，定容至100ml。

其特征在于，所述胆固醇工作液配制如下：称取0.0190g胆固醇粉末溶解于脱氧胆酸钠(5％w/v)，定容至10ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)筛选方法高效准确，能够获得高产胆固醇氧化酶的菌株；现有的方法在筛选过程中没有明显的颜色变化，不便于观察，而本发明方法在产生胆固醇氧化酶时会有蓝紫色，从而能快速直观的观察到，再根据蓝紫色覆盖的大小和颜色深浅能一定程度上体现出产量。

(2)本发明的酶活测定方法，操作简便迅速、灵敏度高，同时保证了测定过程中的安全性。

附图说明

图1为有蓝紫色透明圈的菌落平板。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。实施例中所用样品为来自大连渤海湾海域海泥海水样品。

实施例1胆固醇氧化酶产生菌的初筛、复筛方法

本实施例提供的一种产胆固醇氧化酶菌株的筛选方法，具体包括以下步骤：

(1)将供试的深海海泥样品按5％的接种量接入富集培养基中，并放入恒温摇床培养箱，，温度设置在20-30度，恒温下培养2-3天，即可进行下一步；其中富集培养基(％)：胆固醇0.1-0.5，nh4no30.1-0.5，kh2po40.025-0.1，mgso40.025-0.1，feso40.0001-0.001,ph7.0，蒸馏水1.0-1.5l，高温灭菌后保存，温度控制在100-200℃；

(2)产胆固醇氧化酶菌株的分离：将步骤(1)中样品用无菌水稀释，稀释后涂布在筛选培养基中，温度设置在20-30度条件下恒温培养4-5天；

筛选培养基为：胆固醇1.5466g/l，酵母膏0.5-10g/l，氯化钠2-10g/l，磷酸二氢钾1-10g/l，磷酸氢二钾0.5-10g/l，硫酸镁0.5-10g/l，淀粉10-20g/l，碘化钾1-10g/l，琼脂20-40g/l。

(3)产胆固醇氧化酶菌株的初筛：挑取有蓝紫色透明圈的细菌菌落，通过三区划线进行分离纯化，温度设置在20-30度恒温下培养4-5天，获得单一菌落，进行镜检；

(4)产胆固醇氧化酶菌株的复筛：将上述菌株以1％接种量的菌株接种于lb液体培养基中振荡培养12h左右；将菌液按2％接种量接到含有10ml发酵培养基的50ml三角瓶中，25℃振荡培养48h至稳定期；将上述发酵液离心，取上清得到粗酶液，既无细胞提取物，作为胞外酶的来源。

发酵培养基成分如下：葡萄糖10g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，胆固醇2g/l，tween-801ml/l，ph6.5。

在比色皿(光程10mm)中加入2,2-联氮(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(简称abts)与hrp(辣根过氧化物酶)混合液3ml和200μl胆固醇工作液，混匀并在37℃下平衡5min；其中，abts-hrp混合液配置为：称取0.0183gabts和0.0021ghrp(250u/mg)，用0.05m磷酸钾缓冲液(ph7.2)溶解，定容至100ml；胆固醇工作液配制为：称取0.0190g胆固醇粉末溶解于脱氧胆酸钠(5％w/v)，定容至10ml；加入所得粗酶液50μl，再混合，在恒温分光光度计(37℃)中记录415nm处，3min内吸光度值得变化，取线性数据a415nm/min，带入公式计算：

其中，33代表氧状态abts的摩尔吸光系数(ε415nm＝3.3*10⁴m^-1cm^-1)。

一个酶活单位定义为37℃每分钟产生1μmol过氧化氢所需要的酶量。

本实施例得到的一株产胆固醇氧化酶菌株的新的筛选方法与应用，能够快速、准确的筛选出产胆固醇氧化酶的细菌，并且具有低温生长产酶酶活较高的优势，有利于后一步进行应用方面的研究。

实施例2胆固醇氧化酶产生菌的初筛、复筛方法

本实施例提供的一株产胆固醇氧化酶菌株的新的筛选方法，具体包括以下步骤：

(1)将供试的深海海泥样品按5％的接种量接入富集培养基中，并放入恒温摇床培养箱，温度设置在20度，恒温下培养2天，即可进行下一步；其中富集培养基(％)：胆固醇0.1，nh4no30.1，kh2po40.025，mgso40.025，feso40.0001,ph7.0，蒸馏水1.0，高温灭菌后保存，温度控制在100℃；

(2)产胆固醇氧化酶菌株的分离：将步骤(1)中样品用无菌水稀释，稀释后涂布在筛选培养基中，温度设置在20度条件下恒温培养4天；

筛选培养基为：胆固醇1.5466g/l，酵母膏0.5g/l，氯化钠2g/l，磷酸二氢钾1g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸镁0.5g/l，淀粉10g/l，碘化钾1g/l，琼脂20g/l。

(3)产胆固醇氧化酶菌株的初筛：挑取有蓝紫色透明圈的细菌菌落，通过三区划线进行分离纯化，温度设置在20度恒温下培养4天，获得单一菌落，进行镜检；

(4)产胆固醇氧化酶菌株的复筛：将上述菌株以1％接种量的菌株接种于lb液体培养基中振荡培养12h左右；将菌液按2％接种量接到含有10ml发酵培养基的50ml三角瓶中，25℃振荡培养48h至稳定期；将上述发酵液离心，取上清得到粗酶液，测得酶活为0.52u/ml，既无细胞提取物，作为胞外酶的来源。测定酶活方法同实施例1。

实施例3胆固醇氧化酶产生菌的初筛、复筛方法

本实施例提供的一株产胆固醇氧化酶菌株的新的筛选方法，具体包括以下步骤：

(1)将供试的深海海泥样品按5％的接种量接入富集培养基中，并放入恒温摇床培养箱，，温度设置在25度，恒温下培养2.5天，即可进行下一步；其中富集培养基(％)：胆固醇0.3，nh4no30.3，kh2po40.05，mgso40.05，feso40.0001,ph7.0，蒸馏水1.0，高温灭菌后保存，温度控制在150℃；

(2)产胆固醇氧化酶菌株的分离：将步骤(1)中样品用无菌水稀释，稀释后涂布在筛选培养基中，温度设置在25度条件下恒温培养4天；

筛选培养基为：胆固醇1.5466g/l，酵母膏4g/l，氯化钠5g/l，磷酸二氢钾5g/l，磷酸氢二钾5g/l，硫酸镁5g/l，淀粉15g/l，碘化钾5g/l，琼脂30g/l。

(3)产胆固醇氧化酶菌株的初筛：挑取有蓝紫色透明圈的细菌菌落，通过三区划线进行分离纯化，温度设置在25度恒温下培养4天，获得单一菌落，进行镜检；

(4)产胆固醇氧化酶菌株的复筛：将上述菌株以1％接种量的菌株接种于lb液体培养基中振荡培养12h左右；将菌液按2％接种量接到含有10ml发酵培养基的50ml三角瓶中，25℃振荡培养48h至稳定期；将上述发酵液离心，取上清得到粗酶液，测得酶活为0.57u/ml，既无细胞提取物，作为胞外酶的来源。

实施例4胆固醇氧化酶产生菌的初筛、复筛方法

本实施例提供的一株产胆固醇氧化酶菌株的新的筛选方法，具体包括以下步骤：

(1)将供试的深海海泥样品按5％的接种量接入富集培养基中，并放入恒温摇床培养箱，，温度设置在30度，恒温下培养3天，即可进行下一步；其中富集培养基(％)：胆固醇0.5，nh4no30.5，kh2po40.1，mgso40.1，feso40.001,ph7.0，蒸馏水1l，高温灭菌后保存，温度控制在200℃；

(2)产胆固醇氧化酶菌株的分离：将步骤(1)中样品用无菌水稀释，稀释后涂布在筛选培养基中，温度设置在30度条件下恒温培养5天；

筛选培养基为：胆固醇1.5466g/l，酵母膏10g/l，氯化钠10g/l，磷酸二氢钾10g/l，磷酸氢二钾10g/l，硫酸镁10g/l，淀粉20g/l，碘化钾10g/l，琼脂40g/l。

(3)产胆固醇氧化酶菌株的初筛：挑取有蓝紫色透明圈的细菌菌落，通过三区划线进行分离纯化，温度设置在30度恒温下培养5天，获得单一菌落，进行镜检；

(4)产胆固醇氧化酶菌株的复筛：将上述菌株以1％接种量的菌株接种于lb液体培养基中振荡培养12h左右；将菌液按2％接种量接到含有10ml发酵培养基的50ml三角瓶中，25℃振荡培养48h至稳定期；将上述发酵液离心，取上清得到粗酶液，测得酶活为0.68u/ml，既无细胞提取物，作为胞外酶的来源。