一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法。

背景技术：

芥酸酰胺(erucamide)化学名称顺-13-二十二碳烯酸酰胺，是一种应用范围广泛且优良精细化工产品，可作为聚乙烯、聚丙烯的润滑剂、抗粘剂、泡沫稳定剂和防腐剂、照相感光材料、染料和颜料的分散剂等。有研究表明，芥酸酰胺可通过反硝化细菌荧光假单胞菌（pseudomonafluorescens）刺激硝基去除，进而刺激细菌氮同化和反硝化作用，对未来生态环境治理具有重要作用。文献报道芥酸酰胺的合成方法主要有直接氨化法、酯化法、过渡金属化合物催化法、烷基化催化剂催化法、常温常压无催化法，但因生产工艺和设备条件的限制导致其很难合成，并且残留的未反应原料芥酸及其衍生物等杂质也会造成其产品质量分数低、色泽较深，从而直接影响到产品的品质和应用，降低了产品的价值和竞争力。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低、培养基质容易获得的利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法。

本发明目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明的一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法，包括以下步骤：

（1）粗提物的制备

巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04-0.06mpa、温度为40-60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/5-1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；

（2）硅胶柱层析

将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40～80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，水浴挥干乙酸乙酯后上样在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚,石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇等比例洗脱，流速为10~20ml/min，通过薄层层析色谱分析，rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；

（3）凝胶柱层析

浓缩液对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为75%~85%的浓缩液，用体积比为1:1氯仿与甲醇溶液溶解后进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，并用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；

（4）再次硅胶柱层析

将浓缩组分再次进行硅胶层析，用氯仿:甲醇=30:1、20:1,100%甲醇进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；

（5）硅胶减压柱层析

将步骤（4）中目标粗品进行硅胶减压柱洗脱，用洗脱梯度为氯仿:甲醇=30:1,20:1、100%甲醇对样品进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩、干燥得白色粉末，即为芥酸酰胺。

上述利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法，其中：巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌l2（bacillusmegateriuml2），已于2012年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），生物保藏日期2012年9月26日，保藏号为：cctccno：m2012381。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术这群可知：本发明利用巨大芽孢杆菌l2菌体制备芥酸酰胺，可为解决芥酸酰胺来源提供一条新途径，且巨大芽孢杆菌l2（bacillusmegateriuml2）菌株来源可靠，对温度、ph等自然环境条件的适应范围广，容易培养和保存，可作为分离提取芥酸酰胺的供试菌株。该技术生产成本低，分离提取方法操作简单，重复性好，溶剂残留少且易回收，减少了能源的消耗和废气的排放，大大降低了环境污染。

附图说明

图1是实施例1提取的芥酸酰胺ei-ms质谱分析图；

图2是实施例2提取的芥酸酰胺ei-ms质谱分析图；

图3是实施例1提取的芥酸酰胺的¹hnmr谱图；

图4是实施例1提取的芥酸酰胺的¹³c-nmr谱图；

图5是实施例1提取的芥酸酰胺的dept谱图。

具体实施方式

实施例1：

一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法，包括以下步骤：

（1）粗提物的制备

本实验菌种为巨大芽孢杆菌l2（bacillusmegateriuml2），现已保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号为：cctccno：m2012381。

巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04mpa、温度为40℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，将该提取液减压浓缩至总体积的1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；

（2）硅胶柱层析

将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40目硅胶拌样，两者体积比为1:1.2，水浴挥干乙酸乙酯后上样在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚,石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇等比例洗脱，流速为10ml/min，通过薄层层析色谱分析，rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；

（3）凝胶柱层析

选取步骤（2）中的浓缩液对青枯雷尔氏菌活性最好抑菌率达75%的浓缩组分用体积比为1:1氯仿与甲醇溶液溶解后进行葡聚糖凝胶柱层析，并用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；

（4）再次硅胶柱层析

将浓缩组分再次进行硅胶层析，用氯仿:甲醇=30:1、20:1,100%甲醇进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；

（5）硅胶减压柱层析

将步骤（4）中目标粗品进行硅胶减压柱洗脱，用洗脱梯度为氯仿:甲醇=30:1,20:1、100%甲醇对样品进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩、干燥得白色粉末，即为芥酸酰胺。

实施例2：

一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法，包括以下步骤：

（1）粗提物的制备

本实验菌种为巨大芽孢杆菌l2（bacillusmegateriuml2），现已保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号为：cctccno：m2012381。

巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.05mpa、温度为50℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，将该提取液减压浓缩至总体积的1/8后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；

（2）硅胶柱层析

将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与60目硅胶拌样，两者体积比为1:1.2，水浴挥干乙酸乙酯后上样在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚,石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1,乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇等比例洗脱，流速为15ml/min，通过薄层层析色谱分析，rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；

（3）凝胶柱层析

选取步骤（2）中的浓缩液对青枯雷尔氏菌活性最好抑菌率达80%的浓缩组分用体积比为1:1氯仿与甲醇溶液溶解后进行葡聚糖凝胶柱层析，并用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；

（4）再次硅胶柱层析

将浓缩组分再次进行硅胶层析，用氯仿:甲醇=30:1、20:1,100%甲醇进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；

（5）硅胶减压柱层析

将步骤（4）中目标粗品进行硅胶减压柱洗脱，用洗脱梯度为氯仿:甲醇=30:1,20:1、100%甲醇对样品进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩、干燥得白色粉末，即为芥酸酰胺。

实施例3：

一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法，包括以下步骤：

（1）粗提物的制备

本实验菌种为巨大芽孢杆菌l2（bacillusmegateriuml2），现已保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号为：cctccno：m2012381。

巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.06mpa、温度为60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，将该提取液减压浓缩至总体积的1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；

（2）硅胶柱层析

将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与80目硅胶拌样，两者体积比为1:1.2，水浴挥干乙酸乙酯后上样在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚,石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1,乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇等比例洗脱，流速为20ml/min，通过薄层层析色谱分析，rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；

（3）凝胶柱层析

选取步骤（2）中的浓缩液对青枯雷尔氏菌活性最好抑菌率达85%的浓缩组分用体积比为1:1氯仿与甲醇溶液溶解后进行葡聚糖凝胶柱层析，并用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；

（4）再次硅胶柱层析

将浓缩组分再次进行硅胶层析，用氯仿:甲醇=30:1、20:1,100%甲醇进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；

（5）硅胶减压柱层析

将步骤（4）中目标粗品进行硅胶减压柱洗脱，用洗脱梯度为氯仿:甲醇=30:1,20:1、100%甲醇对样品进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩、干燥得白色粉末，即为芥酸酰胺。

试验例：

巨大芽孢杆菌（bacillusmegateriuml2）提取物芥酸酰胺的鉴定：

①样品的准备

取适量上述所得白色粉末用氯仿溶解后，采用ei-ms对所述样品进行波谱解析分析。并取0.5ml氯仿溶解上述所得白色粉末纯样品，转入核磁管进行nmr扫描，得到1h-nmr、13c-nmr谱图、dept谱图。

②ei-ms分析条件

质谱条件：离子源为ei源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70ev；发射电流34.6μa；倍增器电压1624v；接口温度280℃；质量范围29~500amu；溶剂延迟时间：5.0min。

③nmr分析条件

核磁共振：采用id-pfg探头，扫描宽度（sw）16.0ppm，中心频率（o1p）：4.9ppm;

脉冲序列s1pul;时间域数据点（td）：32k；测定温度：303k；延迟时间（dl）：20s；采样次数（ns）：32次；窗函数（lh）：0.3hz。

④结论：通过ei-ms与nmr检测，从巨大芽孢杆菌（bacillusmegateriuml2）菌体分离提取得到的样品rf值与标准品一致，该单体化合物为芥酸酰胺（cis-13-docosenoamide）。结果见图1、2、3、4、5，ei-msm/z:337[m]+。¹³c-nmr(101mhz，cdcl3)δ:176.2(c=o)，129.9(c=c)，129.8(c=c)，36.0，31.9，29.8，29.6，29.6，29.6，29.5，29.5，29.5，29.4，29.4，29.4，29.3，29.2，27.3，27.2，25.6，22.7，14.1，故鉴定为芥酸酰胺。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。