一种超低粘附包被液的制备及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种超低粘附包被液的制备及应用。

背景技术：

三维细胞培养是目前最接近体内环境的细胞模型。运用三维技术培养肿瘤细胞，可以形成由不同表型细胞构成的类似肿瘤组织，并且肿瘤细胞在发生侵袭、转移的能力以及对药物的反应等方面也与体内具有较高的一致性。采用低粘附培养板使细胞保持悬浮生长是三维细胞培养的一种方法，但现有的成品超低粘附三维培养板大多是在固定规格的培养板上喷涂一层抑制细胞粘附的物质，难以满足不同的实验需求，无法将抑制细胞粘附的物质应用到适当使用规格的培养板上，操作不便。

因此，急需一种方法简单，便于操作，可增加实验结果准确性的超低粘附包被液的制备及应用。

技术实现要素：

为了解决现有超低粘附包被液的制备及应用的问题，本发明提供一种超低粘附包被液的制备及应用。

本发明提供了如下的技术方案：

一种超低粘附包被液的制备，包括如下步骤：

s1.将3-5g琼脂糖加入到100ml去离子水中，制得浓度为3-5％的琼脂糖溶液，进行高压灭菌；

s2.将步骤s1中高压灭菌后的琼脂糖溶液冷却至45-55℃，按琼脂糖溶液体积：二甲基亚砜体积＝1：3的比例，边搅拌边向琼脂糖溶液中缓慢加入二甲基亚砜，使琼脂糖溶液的终浓度为0.75-1.25％；

s3.将步骤s2得到的琼脂糖溶液进行高压灭菌，灭菌后冷却至室温备用。

优选的,步骤s1中将4g琼脂糖加入100ml去离子水中，制得浓度为4％的琼脂糖溶液，在温度121℃、蒸气压103.4kpa的条件下高压灭菌30min。

优选的,取100ml步骤s2中4％的琼脂糖溶液冷却至50℃，边搅拌边缓慢加入300ml二甲基亚砜，使琼脂糖溶液的终浓度为1.00％。

优选的,取400ml步骤s3中的琼脂糖溶液，在温度121℃、蒸气压103.4kpa的条件下高压灭菌30min。

本发明的有益效果是：本发明是基于琼脂糖采用特殊工艺制备超低粘附包被液。琼脂糖是由1,3连结的β-d-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-l-半乳糖交替连接起来的长链，为不带电荷的中性物质，琼脂糖对细胞无毒害作用，对细胞没有粘附能力，不影响细胞的三维生长，经过本包被液包被的培养板或培养皿，培养的细胞均可保持悬浮状态，便于操作；本方法制得的包被液无色透明，具有良好的透光性能，不影响后续显微镜观察以及酶标仪测得的吸光度值，增加实验结果的准确度；可以根据不同的实验需求，使用该包被液制备超低粘附培养板或培养皿，制备方法简单，使用方便。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是经超低粘附包被液包被96孔的细胞培养板和未经超低粘附包被液包被的96孔细胞培养板的吸光度(od)值；

图2是人回盲肠癌细胞hct-8在未经超低粘附包被液包被的细胞培养板和经超低粘附包被液包被的细胞培养板中培养时的细胞悬浮率；

图3是人肝癌细胞hepg2在未经超低粘附包被液包被的细胞培养板和经超低粘附包被液包被的细胞培养板中培养时的细胞悬浮率；

图4是人回盲肠癌细胞hct-8在经超低粘附包被液包被的细胞培养板中培养第2天、第4天、第6天和第8天的细胞增殖情况；

图5是人肝癌细胞hepg2在经超低粘附包被液包被的细胞培养板中培养第2天、第4天、第6天和第8天的细胞增殖情况；

图6是人回盲肠癌细胞hct-8在二维培养条件和三维培养条件下的细胞形态；

图7是人肝癌细胞hepg2在二维培养条件和三维培养条件下的细胞形态；

图8是原代肿瘤细胞在三维培养条件下的细胞形态。

具体实施方式

实施例1

一种超低粘附包被液的制备，包括如下步骤：

s1.将4g琼脂糖加入到100ml去离子水中，制得浓度为4％的琼脂糖溶液，在温度121℃、蒸气压103.4kpa的条件下高压灭菌30min；

s2.将步骤s1中高压灭菌后的琼脂糖溶液冷却至50℃，按琼脂糖溶液体积：二甲基亚砜体积＝1：3的比例，边搅拌边向100ml琼脂糖溶液中缓慢加入300ml二甲基亚砜，使琼脂糖溶液的终浓度为1％；

s3.将步骤s2得到的400ml琼脂糖溶液，在温度121℃、蒸气压103.4kpa的条件下高压灭菌30min，灭菌后冷却至室温备用，即得超低粘附包被液。

在室温条件下，超低粘附包被液可保持无色透明的状态。将未经超低粘附包被液包被的96孔细胞培养板和经超低粘附包被液包被的96孔细胞培养板均用酶标仪检测各个孔的od值，结果如图1所示，各个孔的od值均没有显著性差异(p＝0.47)，提示经超低粘附包被液包被的细胞培养板不会影响原细胞培养板的透光性能。

应用实施例1

a预处理：拟包被的培养器皿中加入浓度为0.1mg/ml的多聚赖氨酸溶液，使多聚赖氨酸溶液完全覆盖细胞培养面。室温下放置2h后使用移液枪收集多聚赖氨酸溶液，将培养器皿放入37℃细胞培养箱中，烘干细胞培养面残余的多聚赖氨酸；

b包被：在预处理后的培养器皿中加入1％的琼脂糖溶液，使琼脂糖溶液完全覆盖细胞培养面，室温放置8分钟后使用移液枪收集琼脂糖溶液，将培养器皿在4℃条件下放置1h。

c清洁：将去离子水在温度121℃、蒸气压103.4kpa的条件下高压灭菌30min，将处理后的培养器皿在接种细胞前使用该去离子水清洗4次。

应用实施例2

准备四个相同规格的细胞培养板，其中两个是普通细胞培养板，另两个是按照应用实施例1处理过的细胞培养板，同等条件下，将人回盲肠癌细胞hct-8分别接种到一个未经超低粘附包被液包被的细胞培养板和一个经超低粘附包被液包被的细胞培养板中，将人肝癌细胞hepg2分别接种到一个未经超低粘附包被液包被的细胞培养板和一个经超低粘附包被液包被的细胞培养板中，培养24小时后用cck8方法检测细胞的悬浮情况，悬浮率结果如图2和图3所示，提示人回盲肠癌细胞hct-8(图2)和人肝癌细胞hepg2(图3)在经超低粘附包被液包被的细胞培养板中几乎完全保持悬浮生长状态。

应用实施例3

准备两个按照应用实施例1处理过的细胞培养板，同等条件下，将人回盲肠癌细胞hct-8和人肝癌细胞hepg2分别接种到两个细胞培养板中并进行细胞培养，分别在接种后的第2天、第4天、第6天和第8天均用cck8方法对细胞的增殖情况进行检测，结果如图4和图5所示，提示经超低粘附包被液包被的细胞培养板对人回盲肠癌细胞hct-8(图4)和人肝癌细胞hepg2(图5)的增值均不产生影响。

应用实施例4

三维培养通过多样化的细胞群体在生理上的细胞间或细胞与细胞外基质相互作用，建立功能密切相关的几何结构，这些结构可以模拟体内营养物质、代谢产物、氧气以及信号分子在空间上的梯度变化，更加真实反映细胞生物学功能。

准备五个相同规格的细胞培养板，其中两个是普通细胞培养板，另三个是按照应用实施例1处理过的细胞培养板，将人回盲肠癌细胞hct-8接种到一个未经超低粘附包被液包被的细胞培养板中，在二维培养条件下，如图6所示，细胞呈平面铺展生长；将人回盲肠癌细胞hct-8接种到一个经超低粘附包被液包被的细胞培养板中，在三维培养条件下，如图6所示，细胞均为圆形，并可聚集成肿瘤球体；

将人肝癌细胞hepg2接种到一个未经超低粘附包被液包被的细胞培养板中，在二维培养条件下，如图7所示，细胞呈平面铺展生长；将人肝癌细胞hepg2接种到一个经超低粘附包被液包被的细胞培养板中，在三维培养条件下，如图7所示，细胞均为圆形，并可聚集成肿瘤球体；

将原代肿瘤细胞接种到一个经超低粘附包被液包被的细胞培养板中，在三维培养条件下，如图8所示，细胞可形成大小不一的球体样结构。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。