本发明涉及一种基质循环连续发酵生产细菌纤维素的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术：
细菌纤维素(bacterialcellulose，bc)是一类由微生物产生的纯纤维素，是葡萄糖单体分子以由α-1,4-糖苷键聚合而成的高分子聚合物。与植物纤维相比，bc不含木质素和半纤维素，具有优良的生物相容性和生物可降解性，以及精细的网状结构、高结晶度、高抗张强度等独特性质，被公认为世界上安全的性能优异的新型生物材料。自然界中仅有少数几种菌产bc，主要集中于醋酐菌属和假胞杆菌属等微生物，其中醋杆菌中的木醋杆菌(acetobacterxylinus)发现最早、研究较为彻底的bc产生菌，该菌株的培养周期相对较长，限制了其在工业化生产中的应用。从传统发酵食品中分离到的komagataeibacterrhaeticus菌株具有很强的bc合成能力，与木醋杆菌产生的bc膜具有相似的理化、形态和力学性能，且未经处理的原膜的纤维素密度更高，可广泛应用于相同的领域，可作为bc生物合成的替代菌。
bc在食品、医用材料等领域有广泛的应用前景，但是产量一直是限制其进一步应用的重要因素。一方面，由于komagataeibacterrhaeticus是一个好氧菌，合成bc时对氧的需求量很大，发酵过程中纤维素膜总是在培养液的气液界面形成，菌体则富集在bc膜内。随着发酵时间的延长，膜厚度的增加，导致营养物质的传递受到影响，bc的合成速率下降，不利于产量的继续提高。另一方面，发酵过程中生成的bc膜占据了发酵空间，且膜具有极强的持水性，吸附了大量的含有营养物质的培养液，不利于菌体充分利用营养物质，从而降低底物的转化，增加生产成本。
技术实现要素：
为了提高bc的实际利用价值，应用高产菌株进行高强度发酵提高bc的产量，为bc的应用扫除障碍，本发明提供了一种连续发酵生产细菌纤维素膜的方法，在提高细菌纤维素膜的生产效率，控制细菌纤维素膜的生产稳定性。
本发明的第一个目的是提供一种减少种子液的制备时间，提高菌体的重复利用效率，连续发酵生产细菌纤维素膜的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将产细菌纤维素的菌株种子液接种至培养体系中培养至产生细菌纤维素膜；(2)定期将培养体系表面的细菌纤维素膜移离气液界面或将膜下沉到液面以下；(3)将步骤(2)移出的bc膜在一定量的培养液中振荡培养一定时间，以使菌体从膜中迁移至培养液中，然后将培养液回用到初始培养体系中以补充基质和回用菌体。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)具体为：将步骤(2)移出的纤维素膜在低浓度的培养液中振荡处理一定时间，使纤维素膜携带的营养物质置换至培养液中、纤维素膜上的菌体迁移至溶液中，以利于菌体和营养物质的进一步利用，同时降低膜中蛋白质含量；所述低浓度的培养液是指培养液中的营养成分浓度低于初始培养基中的营养成分浓度。
在本发明的一种实施方式中，所述低浓度的培养液是将发酵培养基稀释2～3倍后的溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述方法重复步骤(2)和(3)。
在本发明的一种实施方式中，所述产细菌纤维素的菌株为komagataeibacterrhaeticuswm407-1，已于2016年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016213，该菌株已在公开号为cn105802896a的专利申请中公开。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液是将菌株接种至种子培养基中，在150～200r/min，28～30℃培养1～2天。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的培养条件是在150-200r/min、30℃条件下间歇振荡或搅拌培养。
在本发明的一种实施方式中，每2～4天将培养体系表面的纤维素膜移出。
在本发明的一种实施方式中，所述移离气液界面是采用无菌涂布棒将生长在气液界面上的bc膜揿压入液面下方，再继续培养0.5-2小时后将培养体系中的纤维素膜取出。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)将纤维素膜携带的营养物质在低浓度培养液中交换0.5-2h。
在本发明的一种实施方式中，交换后的培养液全部回用至培养体系中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法在含有筛网的容器中进行，并采用筛网转移纤维素膜。
在本发明的一种实施方式中，所述培养体系中还补加乙醇。
在本发明的一种实施方式中，所述乙醇补料至培养体系中的浓度为10～30g/l。
本发明的第二个目的是提供应用上述方法制备的细菌纤维素膜。
本发明还要求保护所述方法制备的细菌纤维素膜在生物、医药、化工领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括但不限于作为面膜基材或创面敷料。
有益效果：(1)本发明通过发酵过程中进行取膜—培养基的营养基质及菌体置换—补加乙醇等操作，并控制发酵工艺条件，实现了bc膜的连续、高效生产。本发明解决了由于膜的积累导致的发酵体系空间变小从而不利于产量的继续提高的问题，相对于非补料模式，bc膜的生产周期缩短，生产效率显著提高。
(2)本发明通过在bc膜发酵过程中，定期将生成的bc膜移离或浸没到液面下方，用低浓度培养液对膜片中的基质进行交换，更有利于培养基成分和菌体的回用及纤维素膜的稳定生产，采用培养基营养成分和菌体回用技术比未采用回用技术时，bc膜产量的提高量至少提高29.57％，并大大降低了培养基的成本。
(3)本发明通过移离或揿压的方式，可实现bc膜在保持形状、大小、密度稳定的前提下的连续生产，且操作简单，有助于大规模生产条件下的工艺控制。
具体实施方式
所用固体斜面培养基：葡萄糖20g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l，na2hpo48g/l，mgso40.5g/l，琼脂20g/l，ph6.3，115℃灭菌20min，冷却待用。
所用液体种子培养基：葡萄糖20g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l，na2hpo48g/l，mgso40.5g/l，乙醇20g/l，调节ph至6.3，过滤除菌后待用。
所用发酵培养基：葡萄糖20g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l，乙醇20g/l，调节ph至6.3，过滤除菌后待用。
所用纤维素膜干重的测定方法：培养液中取出菌膜，用蒸馏水冲洗后，用l％的naoh溶液80℃水浴中浸泡30min，再用蒸馏水反复冲洗，直到凝胶膜透明无色，于80℃烘箱中烘至恒重，称重。
实施例1：
将保藏在甘油管中的菌株komagataeibacterrhaeticuswm407-1(cctccno:m2016213)菌种涂布在固体平板上活化1天后，挑取接入种子培养基中，在150-200r/min、30℃条件下培养2天，每4h振荡或搅拌5min。然后将上述种子液按体积分数6％的接种量接入三角瓶或发酵罐体系下的发酵培养基，在30℃下间歇振荡或搅拌培养1天(每4h振荡或搅拌5min，振荡转速为150-200r/min或搅拌转速为50-100r/min)。将培养1天的发酵液全部移入消毒后带有可移动筛网的不锈钢圆桶中(体积为1l，装液量600ml)，在30℃条件下继续静置培养，培养2天后，气液界面形成一层纤维素膜，采用无菌涂布棒将生长在气液界面上的bc膜揿压入液面下方，补加一定量乙醇使发酵体系中乙醇终浓度为20g/l，bc膜浸在液体中，膜上的菌体能够从膜表面迁移至培养体系中，再继续培养2天，至生成了新的纤维素膜，再采用无菌涂布棒将生长在气液界面上的bc膜揿压入液面下方，补入终浓度20g/l的乙醇，再继续培养2天。重复操作：揿压—补加乙醇，共培养16天得到8片bc膜，收集全部膜片，称重。然后将bc膜洗涤，烘干至恒重。测得总湿膜的重量为288.20g，干膜的总重量为6.61g，产量为11.02g/l培养基。
实施例2：
将保藏在甘油管中的菌株komagataeibacterrhaeticuswm407-1(cctccno:m2016213)菌种涂布在固体平板上活化1天后，挑取接入种子培养基中，在150-200r/min、30℃条件下振荡培养2天。然后将上述种子液按体积分数6％的接种量接入三角瓶或发酵罐体系下的发酵培养基中，在30℃下间歇振荡或搅拌培养1天，每4h振荡或搅拌5min，振荡转速为150-200r/min或搅拌转速为50-100r/min。将培养1天的发酵液全部移入经消毒的带有可移动筛网的不锈钢圆桶a中(体积为1l，装液量600ml)，在30℃条件下继续静置培养，培养2天后，将移动筛网取出，生成的细菌纤维素膜放入消毒后的不锈钢圆桶b中，并将圆桶b的筛网放入正在发酵的圆桶a中，供转移新生成的纤维素膜。在圆桶b中加入与在a桶中生成的一片bc膜等体积的低浓度培养液(发酵培养基稀释3倍)，让bc膜中含有的发酵液基质在低浓度培养液交换0.5h，然后将bc膜转移至无菌托盘c中。将移出bc膜后的溶液全部沿壁倒入不锈钢圆桶a中，补加一定量乙醇使发酵体系a中乙醇终浓度为20g/l，继续培养至2天。重复操作：取膜—交换—补加乙醇，重复操作7次，共培养得到8片bc膜，收集全部膜片，称重。然后将bc膜洗涤，烘干至恒重。测得总湿膜的重量为285.95g，干膜的总重量为6.48g，总产量为10.78g/l培养基。
实施例3
将保藏在甘油管中的菌株komagataeibacterrhaeticuswm407-1(cctccno:m2016213)菌种涂布在固体平板上活化1天后，挑取接入种子培养基中，在150-200r/min、30℃条件下培养2天，每4h振荡或搅拌5min。然后将上述种子液按体积分数6％的接种量接入三角瓶或发酵罐体系下的发酵培养基，在30℃下间歇振荡或搅拌培养1天(每4h振荡或搅拌5min，振荡转速为150-200r/min或搅拌转速为50-100r/min)。将培养1天的发酵液全部移入消毒后带有可移动筛网的不锈钢圆桶a中(体积为1l，装液量600ml)，在30℃条件下继续静置培养，培养2天后，气液界面形成一层纤维素膜，采用无菌涂布棒将生长在气液界面上的bc膜揿压入液面下方，半小时后，待bc膜中的菌体迁移至液面内部，再用可移动筛网将bc膜转移至消毒后的不锈钢圆桶b中。向不锈钢圆桶a中补加与取出的bc膜相同体积的低浓度培养基(发酵培养基稀释3倍)，再在30℃条件下继续静置培养2天，形成新的bc膜。采用无菌涂布棒将生长在气液界面上的bc膜揿压入液面下方，半小时后，待bc膜中的菌体迁移至液面内部，再用可移动筛网将bc膜转移至消毒后的不锈钢圆桶b中。重复操作：揿压—转移bc膜—补加低浓度培养基，共培养16天得到8片bc膜，收集全部膜片，称重。然后将bc膜洗涤，烘干至恒重。测得总湿膜的产量为286.42g，干膜的总重量为6.56g，总产量为10.80g/l培养基。
实施例4：
与实施例1基本相同，不同之处在于：补加一定量乙醇使发酵体系a中乙醇终浓度为15g/l，其余步骤相同。共培养16天，得到8片bc膜，收集全部膜片，称重。然后将bc膜洗涤，烘干至恒重。测得总湿膜的重量为285.36g，干膜的总重量为6.53g，总产量为10.88g/l培养基。
实施例5：
与实施例1基本相同，不同之处在于：补加一定量乙醇使发酵体系a中乙醇终浓度为30g/l，其余步骤相同。共培养16天，得到8片bc膜，收集全部膜片，称重。然后将bc膜洗涤，烘干至恒重。测得总湿膜的重量为292.16g，干膜的总重量为6.64g，总产量为11.07g/l培养基。
实施例6：
与实施例1相同，不同之处在于，补加与在a桶中生成的一片bc膜等体积的低浓度培养液(发酵培养基稀释3倍)，共培养16天，得到8片bc膜，收集全部膜片，称重。然后将bc膜洗涤，烘干至恒重。测得总湿膜的重量为297.62g，干膜的总重量为6.71g，总产量为11.13g/l。
对比例1：
与实施例1基本相同，不同之处在于：在30℃条件下持续静置培养，不移动膜的位置，每培养2天检测其发酵体系中乙醇浓度，并补入一定量纯乙醇控制乙醇浓度至20g/l，培养16天后共收集1片bc膜，称重。然后将bc膜洗涤，烘干至恒重。测得总湿膜的重量为256.21g，干膜的总重量5.27g，总产量为8.32g/l培养基。
对比例2：
与实施例2基本相同，不同之处在于：在30℃条件下继续静置培养，培养2天后，将移动筛网取出，生成的bc膜放入消毒后的不锈钢圆桶b中，并将圆桶b的筛网放入正在发酵的圆桶a中。不对生成的膜片进行菌体和培养液的置换，直接沿壁向不锈钢圆桶a中加入与生成的bc膜等体积当量的低浓度培养液(发酵培养基稀释2倍)，补加一定量乙醇控制发酵体系a中乙醇终浓度为20g/l，继续培养。重复操作：取膜—加培养液—补加乙醇，重复操作，由于bc膜上吸附的菌体较多，不进行菌体回迁，延长了bc膜的培养时间，共培养得到6片bc膜，收集全部膜片，称重。然后将bc膜洗涤，烘干至恒重。测得总湿膜的重量为235.73g，干膜的总重量4.78g，总产量为7.68g/l培养基。
对比例3：
与实施例1基本相同，不同之处在于：将培养1天的发酵液全部移入不锈钢圆桶a中(体积为1l，装液量800ml)，在30℃条件下继续静置培养，培养3天后，采用无菌涂布棒将生长在气液界面上的bc膜揿压入液面下方，再继续培养2天，将第二张膜采用无菌涂布棒将其压入液面下方。如此重复操作，直至容器中长满bc膜。重复4次以后，膜的形成速度减慢，且成膜不完整，揿压时易破碎。
对比例4：
具体实施方式同实施例1，区别在于，将低浓度溶液替换为水溶液，结果显示，采用水溶液置换纤维素膜中的菌体和营养物质，在转移纤维素膜时，极易导致纤维素膜破裂，无法获得完整的纤维素膜，不利于下游的工艺处理。
表1不同试验号中获得的bc膜干重
发明人在优化培养条件的过程中发现，在气液界面生成的bc膜会吸附一定量的培养基，并在液体界面附着大量的产bc膜的菌体。将移离液面的bc膜在低浓度培养基中静置，能够有效地使菌体自发地迁移至溶液体系内，有助于缩短种子液培养至产bc膜的时间，同时，bc膜吸附的培养基能够在低浓度培养基的环境下释放，回用该溶液能够同时起到补料和补入菌体的效果，一举多得。同理，揿压入液面下方的bc膜中的菌体也能够自发迁移回培养体系中，受到揿压过程的扰动作用，膜中吸附的培养基与培养体系中的培养基浓度处于动态的平衡，有助于菌体的连续培养。而bc膜的转移过程会对培养体系带来较大程度的扰动，会对菌体的连续培养产生一定的影响，但总体也能够达到较高的生产强度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。