本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一种可拮抗两种海水养殖病原性弧菌的假交替单胞菌及其应用。
背景技术：
近年来，我国海水养殖业发展迅速，已成为世界水产养殖大国，但随着养殖规模的不断扩大和集约化程度的不断提高，养殖水体污染日益严重，诸多疾病相继出现，特别是细菌性疾病，给水产养殖业造成严重的损失。国内外报道的海水养殖细菌性病原主要有弧菌属的鳗弧菌(vibrioanguillarum)、灿烂弧菌(vibriosolendidus)、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、海弧菌(vibriopelagius)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)及美人鱼弧菌(vibriodamsela)等。此外，嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)、迟缓爱德华氏菌(ewardsielatarda)、链球菌(streptococcusparauberis)等也可海水养殖动物致病并造成不同规模的死亡。弧菌目前已成为海水养殖鱼类的主要细菌性病原菌之一。弧菌病的典型症状是以体表形成溃疡为特征的，其症状随病鱼种类的不同而有所差异，较为共同的症状是发病初期体表部分褪色，随后充血或出血，鳞片脱落，形成溃疡，有的肛门红肿、眼球突出，肝脾肿大及腹水等症状。养殖病害的发生往往是由多种病原菌混合感染导致，因此积极寻找能同时抑制多种病原菌的预防和治疗措施显得尤为重要。
目前，对于海水养殖病原性弧菌病的治疗主要依赖于使用化学药物，包括长期大规模大量施用抗生素或化学制剂，这些药物虽然可暂时有效杀死或抑制病原菌，但长期使用会导致鱼体极易产生耐药性，引起抗生素等化学制剂在环境中的残留，破坏生态平衡，威胁人体的健康和安全。
为减少抗生素或一些化学水质净化剂的使用，使水产养殖业走上无公害养殖的可持续发展之路，一些国家开始利用生态防治方法来控制水产养殖病害，其原理是根据同一生态系统中的不同微生物之间的相互作用，如一些细菌和其他微生物可在环境中分泌抗生素，能很快杀死其它微生物，有的细菌则产生细菌素，杀死与其亲缘关系相近的种。从健康生物的体内或环境中分离出对病原菌具有拮抗作用的微生物，用于抑制病原菌的生长和水产养殖动物疾病的防治，是水产养殖健康可持续发展的迫切需求。目前已经报道的具有抑菌作用的海洋细菌主要有交替单胞菌(alteromonas)、弧菌(vibrio)、假单胞菌(pseudomonas)、气单胞菌(aeromonas)、芽孢杆菌(bacillus)、黄杆菌(flavobacterium)、假交替单胞菌(pseudoalteromonassp.)等。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可拮抗多种病原性弧菌的假交替单胞菌pseudoalteromonasagarivorans及其应用，该菌可有效预防鳗弧菌和溶藻弧菌引起的海水养殖弧菌性病害的发生和流行，可为弧菌性病害的预防和治疗提供产品和使用方法。
本发明从南极冰海水中筛选得到的假交替单胞菌，并于2019年01月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17154。
本发明筛选到的假交替单胞菌pseudoalteromonasagarivoranscgmccno.17154用于拮抗海水养殖环境的多种病原性弧菌；
本发明的弧菌的活菌用于制备菌液制剂，所制得的菌液制剂可以预防海水养殖鱼类出血和皮肤溃烂以致死亡的疾病的发生。
为了获得最好的防治效果，菌液制剂中弧菌cgmccno.17154的浓度为107～1010。
本发明筛选到的假交替单胞菌cgmccno.15174用于提取胞外产物，预防海水养殖弧菌性病害的发生。
本发明筛选的具有拮抗两种病原性弧菌的海洋细菌，拮抗活性强。该拮抗菌胞外产物的产量稳定，成本低，可具有较高的拮抗活性。该拮抗菌及其产物均为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留，不会对环境造成污染，在应用方面具有良好的前景。
附图说明
具体实施方式
为了更好了解本发明，以下通过实施例作进一步详细描述。
实施例1假交替单胞菌的分离鉴定与保藏
上述拮抗菌的筛选方法如下：首先分别以病原菌鳗弧菌(vibrioanguillarum)和溶藻弧菌(vibrioparahemolyticus)为指示菌，利用分离自南极冰海水和大菱鲆养殖池水的300余株细菌，采用点种法和滤纸片法，筛选拮抗菌。并将筛选得到的拮抗菌胞外产物，用于大菱鲆鳍部出血、溃疡流行性疾病的预防。具体技术方案如下：
拮抗菌的筛选：分别将指示菌鳗弧菌(vibrioanguillarum)和溶藻弧菌(vibrioparahemolyticus)接种于含有3％nacl的lb液体培养基中，28℃震荡培养12～16小时，取40μl～50μl指示菌均匀涂布于高盐营养琼脂培养基(蛋白胨10g/l，肉浸粉10g/l，nacl30g/l，琼脂20g/l，ph为7.4)平板上，用接种环或灭菌牙签挑取南极冰海水和大菱鲆养殖池水的细菌单菌落于涂有指示菌的平板上，每个平板涂2～3个单菌落。并进一步将涂有病原性弧菌的平板贴上灭菌后的小圆形滤纸片(5mm直径)，并用移液枪取50μl待筛选菌菌液滴加于滤纸片上，待滤纸片稍干后再次滴加待选菌液，每个平板上放两片或三片药敏片，并做三个平行平板。将平板放在恒温培养箱中28℃培养24h后，观察是否出现抑菌圈，并测量抑菌圈的大小。根据抑菌圈的大小筛选得到一株分离自大南极冰海水的强拮抗菌237。将该菌进行纯培养和16srrna菌株鉴定，获得菌株的种属信息为pseudoalteromonasagarivorans。
该假交替单胞菌(pseudoalteromonasagarivorans)菌株，于2019年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15174保藏地址为北京市朝阳区北辰西路3号院3号，中国科学院微生物研究所。
在本发明中，具有拮抗作用的假交替单胞菌菌株长期保藏方式为将菌株加入含30％的甘油的2216e液体培养基，在-80℃保存；短期保藏方式为将菌株接种在2216e固体培养基平板上，在4℃保存备用。
本发明涉及的菌株具有如下特征：
假交替单胞菌的培养条件：将该菌涂布于2216e固体培养基平板上，28℃培养18-36小时即可长出单菌落。
形态特征：假交替单胞菌弧菌接种于2216e固体培养基，28℃培养24h，观察菌落形态为圆形、菌落湿润、突起、边缘整齐，菌落呈白色、半透明。假交替单胞菌用磷钨酸负染3min，晾干后经透射电镜下观察，电镜下菌株呈短杆状、无芽孢、端生鞭毛，有分泌物，且菌体大小大约为1.85×0.65μm。
生理生化特征
假交替单胞菌为革兰氏阴性菌，可在1％～10％nacl蛋白胨水中生长，葡萄糖、枸椽酸盐、鸟氨酸、肝糖原、l-丝氨酸阳性，葡萄糖酸盐、葡磷胨水、赖氨酸、蛋白胨、氨对、硫化氢、乳糖、苯甲氨酸、棉子糖、山梨醇、木糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、尿素、卫矛醇、阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性。
抑菌特征利用滤纸片法对两种病原菌的抑菌特性进行测定，结果表明该菌对两种水产养殖病原弧菌鳗弧菌和溶藻弧菌的生长均有不同程度的抑制作用。pseudoalteromonasagarivorans对鳗弧菌的抑制圈直径为32±2mm，pseudoalteromonasagarivorans对溶藻弧菌的抑菌圈直径为28±1mm。
实施例2拮抗菌pseudoalteromonasagarivorans的应用
将健康、体形均一的大菱鲆100尾(平均体长为10±1cm，平均体重为12±2g)，饲养于30l海水的整理箱中，实验期间连续充气，水温20℃，每天换水，不投饵。将鳗弧菌(vibrioanguillarum)、溶藻弧菌(vibrioparahemolyticus)和筛选分离到的假交替单胞菌(pseudoalteromonasagarivorans)分别接种于含有3％nacl的lb培养基中，28℃培养24h后。鳗弧菌和溶藻弧菌，离心，用无菌海水分别重悬，得菌悬液，假交替单胞菌离心弃沉淀，取上清，经0.22μm微孔滤膜过滤。进行以下三组实验处理，每组30尾；(1)对照组，未加病原菌和拮抗菌；(2)水体中鳗弧菌和溶藻弧菌菌液终浓度为1.5×108cfu/ml；(3)在处理(2)的基础上加入等量培养的菌液，拮抗菌菌液比病原菌先1天加入，处理(2)和(3)每天换水补充菌液，定时观察记录各组发病和死亡情况。处理组(2)第2天出现死亡，第6天发病率是100％，死亡率是78％；处理组(3)中的大菱鲆第3天有1尾鳍部出现出血点，第6天，死亡5头，第六天，死亡8尾，死亡率为26.7％，处理组(1)则无一尾死亡。