O型口蹄疫病毒新型基因工程亚单位疫苗的制作方法
本发明涉及动物免疫药物技术领域，具体而言，涉及一种O型口蹄疫病毒新型基因工程亚单位疫苗。
背景技术：
口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)，是一种由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，FMDV)感染偶蹄类动物(如猪、牛、羊、鹿等)所产生的疾病，其特征为受感染之偶蹄类动物的口、足等部位皮肤会出现水泡，从而造成部分动物死亡。
FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口疮病毒属(Aphthovirus)，是偶蹄类动物高度传染性疾病(口蹄疫)的病原。在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。FMDV的免疫是依赖T细胞的B细胞应答，疫苗接种主要诱导中和抗体的产生。FMDV包括A、O、C、Asia1和SAT1、SAT2、SAT3等7个没有交叉免疫保护的血清型，在长期的相互传播感染中又形成了80多个亚型，为口蹄疫的防控带来严峻挑战。
患口蹄疫的动物会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现泡状斑疹等症状。对于畜类，口蹄疫的症状主要是二至三天后快速下降的高烧；口中的水疱导致粘性或泡沫状唾液的过度分泌并流淌出口外；足部的水泡有可能破裂并导致残废。成年动物感染后可能会伴有数月无法恢复的体重减轻，以及成年雄性动物的睾丸肿胀，对于母牛，牛奶产量会明显减少。虽然大部分动物得病后可自行恢复，但该疾病严重时亦可能导致心肌炎(心脏肌肉感染)或死亡，对于新生动物特别如此。一些受感染动物可能没有症状，它们不会出现发烧或是任何得病症状；但这些动物也是口蹄疫载体，它们同样会传染该疾病。
口蹄疫的感染一般为地域性，病毒通过直接接触受感染的动物传播给易感染动物，或者通过被污染的畜舍或运输牲畜的货车。病畜和带毒畜是主要的传染源，它们既能通过直接接触传染，又能通过间接接触传染(例如分泌物、排泄物、畜产品、污染的空气、饲料等)传给易感动物。动物管理人(如农场工人)的外衣或皮肤、动物接触过的水，和未煮过的食物碎屑以及包含感染动物产品的饲料添加剂都可能是病毒的携带源。
过去，口蹄疫曾在全球许多地区(包括欧洲、非洲、亚洲和南美洲)发生，该病的大范围蔓延及迅速的传播引起了国际社会的广泛关注。世界动物卫生组织将其列在A类动物疾病名单之首，我国政府也将其排在一类动物传染病首位。我国作为世界第一的猪肉产销国，猪肉安全问题密切关系着我国畜牧业的良性可持续发展。现在随着分子生物学和免疫学不断发展进步，性价比高、安全性好的新型疫苗也是势在必行。
目前有一些研究是使用大肠杆菌分别表达VP1、VP3和VP0三个蛋白，然后体外组装，此方法蛋白纯化难度大，蛋白体外组装效率非常低；另有一些研究是使用多个杆状病毒分别表达VP1、VP0和VP3蛋白，然后以多个病毒共感染Sf9细胞从而共表达这三个蛋白，此方法需要病毒感染复数很大，同一个细胞需要同时感染2个或者更多的病毒，存在效率非常低的问题。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种免疫组合物，以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种免疫组合物，其包含：
采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3蛋白；
采用序列如SEQ ID NO:12所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:12的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1蛋白；
以及，选自O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2蛋白或O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4蛋白的一种或两种的任意组合。
本发明进一步的技术方案是：所述的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:19的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；
所述的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1蛋白包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:22的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。
本发明进一步的技术方案是：所述免疫组合物还包含O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2、VP4中的一种或者两种以上的任意组合；其中，
所述的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2蛋白包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:21的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；
所述的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4蛋白包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:23的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。
本发明进一步的技术方案是：其中，
所述的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2蛋白是通过序列如SEQ ID NO:8所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:8的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码获得；
所述的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4蛋白是通过序列如SEQ ID NO:16所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:16的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码获得。
本发明进一步的技术方案是：所述免疫组合物进一步包含O型口蹄疫病毒结构蛋白VP0，所述的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP0蛋白是通过序列如SEQ ID NO:4所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:4的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码获得。
本发明进一步的技术方案是：所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP0蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。
本发明进一步的技术方案是：所述免疫组合物为包含所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3、VP1、VP2蛋白的组合物。本发明进一步的技术方案是：所述免疫组合物为包含所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3、VP1、VP4蛋白的组合物。本发明进一步的技术方案是：所述免疫组合物为包含所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3、VP1、VP2和VP0蛋白的组合物。本发明进一步的技术方案是：所述免疫组合物为包含所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3、VP1、VP2、VP4蛋白的组合物。
本发明进一步的技术方案是：所述免疫组合物为包含所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3、VP1、VP4和VP0蛋白的组合物。
本发明进一步的技术方案是：所述免疫组合物为包含所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3、VP1、VP2、VP4和VP0蛋白的组合物。
本发明的另一目的在于提供一种所述免疫组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1、将O型口蹄疫病毒结构蛋白的基因克隆到对应的穿梭载体上，得到重组穿梭载体；
S2、将重组穿梭载体转化到含有杆状病毒基因组的DH10Bac菌中，重组穿梭载体中目的基因表达框定向插入杆状病毒基因组质粒中，获得含有目的基因表达框的重组杆状病毒基因组质粒；
S3、将重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；
S4、将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞，在反应器中大规模生产O型口蹄疫病毒结构蛋白；
S5、将S4步骤中获得的O型口蹄疫病毒结构蛋白加入到佐剂中，即得所述免疫组合物。
本发明进一步的技术方案是，步骤S1包括：将O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3和VP1的编码基因以及选自VP2、VP4、VP0中的任意一种、两种或者三种的表达框均克隆到同一穿梭载体上，即得到所述的重组穿梭载体。
优选的，步骤S1包括：将O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3和VP1的编码基因以及选自O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2、VP4中的任意一种或两种的表达框均克隆到同一穿梭载体上，即得到所述的重组穿梭载体。
更优选的，步骤S1包括：将O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3和VP1的编码基因，选自O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2、VP4中的任意一种或两种的表达框以及O型口蹄疫病毒结构蛋白VP0的表达框均克隆到同一穿梭载体上，即得到所述的重组穿梭载体。
尤其优选的，所述步骤S1包括：将VP1蛋白、VP3蛋白、VP0蛋白、VP2蛋白、VP4蛋白的基因均克隆到同一穿梭载体上，得到所述的重组穿梭载体。
本发明进一步的技术方案是：所述穿梭载体为pFastBac Dual。
本发明进一步的技术方案是：所述昆虫细胞选自Sf9、High Five、S2或Sf21细胞细胞中的任意一种，但不限于此。
本发明的前述实施方案中，使用一个病毒同时共表达VP1和VP3蛋白以及选自VP2、VP4、VP0中的任意一个、二个或三个蛋白。更为优选的，通过使用一个病毒同时共表达VP1、VP3、VP2、VP4以及VP0五个蛋白。其中VP2和VP4可以由VP0蛋白裂解而来。VP1、VP3和VP0蛋白能够自动组装成VLP，VP1、VP3、VP2和VP4蛋白也能自动组装成VLP，因此使用一个杆状病毒共表达多个蛋白，使得VLP的组装效率大大提高。
本发明的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对O型口蹄疫病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。
本发明的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受O型口蹄疫病毒感染的药剂的用途。
本发明的又一目的在于提供一种核酸分子组合物，其包括：用于编码O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3蛋白，包含SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列；
用于编码O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1蛋白，包含SEQ ID NO:12的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:12的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。
本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对O型口蹄疫病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。
本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子组合物用于生产用于预防动物受O型口蹄疫病毒感染的药剂的用途。例如，所述的药剂可以是O型口蹄疫病毒新型基因工程亚单位疫苗。
本发明的又一目的在于提供一种蛋白组合物，其包括：
SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:19的全长氨基酸序列95％以上相同的蛋白；SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:22的全长氨基酸序列95％以上相同的蛋白。
优选的技术方案中，步骤S3中，发酵培养中使用的培养基为传代培养基。
本发明公开了一种Sf9细胞表达的O型口蹄疫病毒重组亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在猪、牛体内产生较强的体液免疫，免疫后的猪、牛等哺乳动物能够抵御O型口蹄疫病毒的感染，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种可大规模工业化生产的O型口蹄疫病毒重组亚单位疫苗的制备方法。
采用上述方案后，本发明与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：
本发明O型口蹄疫病毒新型基因工程亚单位疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对动物没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，同时大大降低了疫苗生产成本。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为将VP3蛋白基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到0.7kbp附近出现一个条带；其中1为FMDV-VP3基因，2为阴性对照，M为分子量标记；
图2为多个VP3蛋白基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，0.7kbp条带附近出现阳性样品。其中1～5均为VP3蛋白基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；
图3为将VP0蛋白基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到0.9kbp附近出现一个条带；其中1为FMDV-VP0基因，2为阴性对照，M为分子量标记；
图4为多个VP0蛋白基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，0.9kbp条带附近出现阳性样品。其中1～5均为VP0蛋白基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；
图5为将VP2蛋白表达框PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到1.4kbp附近出现一个条带；其中1为FMDV-VP2蛋白表达框基因，2为阴性对照，M为分子量标记；
图6为多个VP2蛋白表达框转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，1.4kbp条带附近出现阳性样品。其中1～5均为VP2蛋白表达框转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；
图7为将VP1蛋白表达框PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到1.3kbp附近出现一个条带；其中1为FMDV-VP1蛋白表达框基因，2为阴性对照，M为分子量标记；
图8为多个VP1蛋白表达框转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，1.3kbp条带附近出现阳性样品。其中1～5均为VP1蛋白表达框转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；
图9为将VP4蛋白表达框PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到1.0kbp附近出现一个条带；其中1为FMDV-VP4蛋白表达框基因，2为阴性对照，M为分子量标记；
图10为多个VP4蛋白表达框转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，1.0kbp条带附近出现阳性样品。其中1～5均为VP4蛋白表达框转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；
图11为构建的含有目的基因的转移载体Dual-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4图谱；
图12为实施例3中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，VP3-VP0-VP2-VP1-VP4重组蛋白的细胞培养物分别在分子量约21kDa、33kDa、26kDa、24kDa、9kDa附近出现目的条带；其中1为阴性对照，2为实施例3中收获的细胞培养物，M为分子量标记；
图13为实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物WesternBlot检测结果；其中1为重组杆状病毒表达样品，2为阴性对照，M为分子量标记；
图14为免疫荧光检测结果；
图15为电镜观察结果；
图16为蛋白纯化后的结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明提供了一种免疫组合物，包含：
采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP3蛋白；
采用SEQ ID NO:12的核酸分子或者与SEQ ID NO:12的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1蛋白；
以及，选自O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2蛋白或O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4蛋白的一种或两种的任意组合。
本发明也涉及一种诱导针对O型口蹄疫病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的疫苗。
本发明也涉及一种保护受试动物免受O型口蹄疫病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的疫苗。
本发明还包括适用于诱导针对O型口蹄疫病毒的免疫反应的疫苗。本发明的疫苗可为包含上述核酸分子的质粒。核酸分子可被并入病毒颗粒中。疫苗可还包含佐剂分子。佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
本发明的疫苗包含蛋白分子组合物。本文提供选自由以下组成的组的蛋白：包含SEQ ID NO:19或22或21或23或20的蛋白；在SEQ ID NO:19或22或21或23或20的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白；SEQ ID NO:19或22或21或23或20的片段；与SEQ ID NO:19或22或21或23或20的片段95％相同的蛋白。
本文还提供一种选自由以下组成的组的蛋白组合物：(a)SEQ ID NO:19或22或21或23或20；(b)在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:19或22或21或23或20的包含SEQ ID NO:19或22或21或23或20的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:19或22或21或23或20的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。当然，本文还提供一种蛋白组合物，其还包括选自由以下组成的组中的一种蛋白分子或者多种蛋白分子的组合：(a)SEQ ID NO:20或21或23；(b)在如SEQ ID NO:20或21或23所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:20或21或23的包含SEQ ID NO:20或21或23的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:20或21或23的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。
本发明提供包含编码上文所述的一种或多种蛋白分子的序列的核酸分子组合物。在一些实施方案中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1或12或8或16或4；在SEQ ID NO:1或12或8或16或4的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序列；SEQ ID NO:1或12或8或16或4的片段；与SEQ ID NO:1或12或8或16或4的片段95％相同的核苷酸序列。所述的核酸分子组合物，其还包括选自由以下组成的组中的一种核酸分子或者多种核酸分子的组合：SEQ ID NO:4或8或16；在SEQ ID NO:4或8或16的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序列；SEQ ID NO:4或8或16的片段；与SEQ ID NO:4或8或16的片段95％相同的核苷酸序列。
本发明一些方面提供诱导针对O型口蹄疫病毒的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：向个体施用O型口蹄疫病毒抗原和/或其组合物。
本发明另外的方面提供保护个体免受O型口蹄疫病毒感染的方法。所述方法包括以下步骤：向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所述核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免疫反应。
本发明的一些方面提供一种诱导针对O型口蹄疫病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的核酸分子。
本发明的一些方面提供一种保护受试动物免受O型口蹄疫病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的核酸分子。
本发明的一些方面提供一种适用于在受试动物中产生针对O型口蹄疫病毒的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的核酸分子以及佐剂分子。所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
本发明的疫苗还包括一种或多种如上所述的核酸分子和一种或多种由所述核酸分子编码的蛋白。
1.定义.
本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。
对于本文所列举的数值范围，明确涵盖了在有相同精密度之间的每个插入的数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
如本文所用的“佐剂”意指被添加到本文所述的疫苗中来增强由下文所述编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。
如本文所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。
如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。
如本文所用的“互补体”或“互补”意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或者Hoogsteen碱基配对。
如本文所用的“共有”或“共有序列”意指基于分析特定O型口蹄疫病毒抗原的一队列的多个亚型的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含蛋白的疫苗可以被用来诱导针对特定O型口蹄疫病毒抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫，所述疫苗包含编码这些蛋白的共有序列和/或核酸分子。
如本文可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。
如本文所用的相对于核酸序列的“片段”意指编码能够在与全长野生型病毒株O型口蹄疫病毒抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。
就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型病毒株O型口蹄疫病毒抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽。蛋白的片段可以包含蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，蛋白的片段可以包含蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。
如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白的编码序列的必须的调控元件，以使得当存在于所述个体的细胞中时，编码序列将表达。
如本文所用的术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。
在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，如本文所用的“相同”或“同一性”意指在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST2.0来执行。
如本文所用的“免疫反应”意指响应于抗原如O型口蹄疫病毒共有抗原的引入，宿主的免疫系统(例如动物的免疫系统)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。
如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。
基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMVIE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。
“信号肽”和“前导序列”是指可以被连接在本文所述的O型口蹄疫病毒蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白的剩余部分裂解，所述蛋白在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白。信号肽/前导序列连接在所述蛋白的N端。
“严格的杂交条件”意指在所述条件下如在核酸的复杂混合物中第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)进行杂交。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格的条件在限定的离子强度pH下可以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10℃。所述Tm可以是这样的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)，在所述温度下与靶标互补的50％的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子，如在pH7.0至8.3下约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的探针(例如，约10-50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5xSSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2xSSC和0.1％SDS洗涤。
如本文所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补体至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。
如本文所用的“基本上相同”意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补，则第一序列和第二序列也这样相同。
“亚型”或“血清型”：如本文交换使用的并且关于O型口蹄疫病毒，意指O型口蹄疫病毒的基因变体，以使得一个亚型被免疫系统识别而从不同的亚型中分离。
本文就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物活性。变体还意指具有与参考蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来识别。凯特(Kyte)等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。在一个方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。
如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA载体。
2.疫苗
本发明的疫苗可被设计来控制受试动物中针对一种或多种O型口蹄疫病毒血清型的免疫反应的程度或强度。疫苗可包含抑制它整合至染色体中的元件或试剂。疫苗可为编码O型口蹄疫病毒结构蛋白的RNA。可将RNA疫苗引入细胞中。本发明的疫苗可包含O型口蹄疫病毒结构蛋白。O型口蹄疫病毒结构蛋白是通过诱导1)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应、2)T辅助细胞反应以及/或3)B细胞反应，或优选所有以上提及的反应，以达成交叉递呈来进行的免疫介导的病毒清除的靶标。
所述抗原可以包含使它们特别有效地作为免疫原的蛋白表位，可针对所述免疫原诱导抗O型口蹄疫病毒免疫反应。O型口蹄疫病毒抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。
一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有95％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有96％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有97％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有98％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有99％同源性的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文所公开的蛋白的编码序列同源的本文所公开的编码序列的核酸分子包含编码IgE前导序列的连接至编码本文所公开的同源蛋白序列的编码序列的5’末端的序列。
在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:1或12或8或16或4的片段。片段可以是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的SEQ ID NO:1或12或8或16或4。片段可与SEQ ID NO:1或12或8或16或4的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。片段可与SEQ ID NO:1或12或8或16或4的片段至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列的序列，例如免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，例如像IgE前导物的编码序列。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:19或22或21或23或20同源的蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的蛋白序列具有95％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的蛋白序列具有97％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的蛋白序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的蛋白序列具有99％同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:19或22或21或23或20相同的蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上80％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上85％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上90％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上91％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上92％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上94％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上96％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上97％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上98％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白不含IgE前导物。蛋白的片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的蛋白。可提供SEQ ID NO:19或22或21或23或20的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:19或22或21或23或20。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。
可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:19或22或21或23或20的免疫原性片段同源的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:19或22或21或23或2095％同源的蛋白。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。
可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:19或22或21或23或20的免疫原性片段相同的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的在SEQ ID NO:19或22或21或23或20中所述的氨基酸序列的整个长度上80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的蛋白。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。
3.疫苗构建体和质粒
疫苗可包括编码O型口蹄疫病毒结构蛋白、O型口蹄疫病毒抗原以及O型口蹄疫病毒结构蛋白/抗原的组合的核酸构建体或质粒。本文提供可以包含编码本文所公开的O型口蹄疫病毒抗原的核酸序列的遗传构建体，所述核心抗原包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列。另外，本文提供可包含编码本文公开的O型口蹄疫病毒表面抗原(包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列)的核酸序列的遗传构建体。所述遗传构建体可以作为功能性染色体外的分子而存在。所述遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线性微型染色体。
所述遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。遗传构建体可以是在减毒的活微生物或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。
遗传构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。
核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。所述载体能够以在动物中有效引发免疫反应的量在动物的细胞中表达抗原。所+述载体可以是重组体。所述载体可以包含编码抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述载体可以适用于用编码抗原的核酸来转染细胞，所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。
编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。
所述载体可以包含编码抗原的异源核酸，并且可以进一步包含可以在抗原编码序列的上游的起始密码子和可以在抗原编码序列的下游的终止密码子。起始密码子和终止密码子可以与抗原编码序列在框中。所述载体还包含可操作地连接至抗原编码序列的启动子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(EpsteinBarr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因的启动子，所述人基因如人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。所述启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。
所述载体还可以包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸化信号可以在O型口蹄疫病毒核心蛋白编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺苷酸化信号。
载体也可包含在共有O型口蹄疫病毒核心蛋白编码序列或共有O型口蹄疫病毒表面抗原蛋白编码序列的上游的增强子。所述增强子对于DNA表达是必须的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、HA、RSV或者EBV的一种增强子。
载体还可以包含动物的复制起点，以便将载体维持在染色体外并在细胞中产生载体的多个拷贝。所述载体可以是来自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAX1、pCEP4或者pREP4，其可以包含爱巴二氏病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区域，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者pVax1变体，如本文所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen，Carlsbad CA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137-724处。T7启动子/引发位点位于碱基664-683处。多克隆位点位于碱基696-811处。牛GH多聚腺苷酸化信号是在碱基829-1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因是在碱基1226-2020处。pUC起点是在碱基2320-2993处。
所述载体可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白。所述载体可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae strain)中产生蛋白。所述载体还可以具有MAXBACTM完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白。所述载体还可以是pcDNAI或者pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，其可用于在动物细胞如Sf9细胞系中产生蛋白。所述载体可以是通过常规技术和容易可得的起始物质来产生蛋白的表达载体或系统，所述技术和物质包括Sambrook等，Molecular Cloning and Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor(1989)。
本发明中VP1，VP3，VP0，VP2，VP4蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列。该病毒表达载体同时表达这五个蛋白中的任意三个，四个或者五个蛋白，其中VP1和VP3是必备表达的结构蛋白。重组杆状病毒载体中的杆状病毒表达系统转移载体为pFastBac Dual。五个蛋白的启动子可以是P10启动子、PH启动子、对虾β-actin基因启动子、OpIE启动子中任一个，但不限于这四个启动子，还有可能是其他的杆状病毒启动子。五个蛋白的转录终止信号是SV40polyA转染终止信号、HSV tk polyA转染终止信号或者OpIE poly A终止信号中的任一个，应不限于使用这三个转录终止信号，还可能是其他转录终止信号。昆虫细胞系可以是为Sf9、High Five、S2或Sf21细胞，优选的用Sf9。本发明所述的动物，特别是农畜动物，如牛、绵羊、猪、山羊物种。
本发明的原理在于通过构建一个重组杆状病毒穿梭质粒，该质粒上包含表达VP3、VP0、VP2、VP1以及VP4五个蛋白中的任意三个或者四个或者五个蛋白的表达基因(其中VP1和VP3蛋白是必备的)。VP3和VP0蛋白以及VP2，VP1以及VP4三个蛋白表达框可以使用P10启动子、PH启动子、对虾β-actin基因启动子、OpIE启动子中任一个(应不限于使用这四个启动子，还可能是其他启动子)，VP3和VP0蛋白以及VP2，VP1以及VP4三个蛋白表达框的转录终止信号可以是SV40 polyA转染终止信号、HSV tk polyA转染终止信号、OpIE poly A终止信号中的任一个(应不限于使用这三个转录终止信号，还可能是其他转录终止信号)。这样，一个载体上同时表达这五个蛋白或者其中的三个或者四个，但是必须包含VP1和VP3蛋白，表达和组装效率得到极大的提高。构建该穿梭质粒转化DH10Bac菌获得重组bacmid(Baculovirus plasmid，杆状病毒质粒)，获得的重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒，该重组杆状病毒接种Sf9细胞，能够同时表达VP3、VP0以及VP2，VP1，VP4五个蛋白，VP1、VP3、VP2，VP4和VP0蛋白能够自动组装成VLP，VP1、VP3和VP2、VP4蛋白也能自动组装成VLP。
具体的，首先将优化并合成的FMDV的VP3和VP0蛋白编码基因分别克隆到pFastBac Dual载体的PH启动子以及P10启动子下面。构建Dual-VP3-VP0载体。再在Dual-VP3-VP0载体的SnaBⅠ酶切位点处插入VP2蛋白表达框，该表达框包括对虾β-actin基因启动子，优化的VP2基因以及SV40polyA转录终止信号，从而构建Dual-VP3-VP0-VP2载体。再在Dual-VP3-VP0-VP2载体的AvrⅡ酶切位点处插入VP1蛋白表达框，该表达框包括OpIE启动子，它是Orgyia pseudotsugata multicapsid nuclear polyhedrosis virus(OpMNPV)病毒中第二个早期调节因子启动子，优化后的VP1基因以及OpIE poly A转录终止信号，从而构建Dual-VP3-VP0-VP2-VP1载体。在Dual-VP3-VP0-VP2-VP1载体的BsrGI酶切位点处插入VP4蛋白表达框，该表达框包括对虾β-actin基因启动子序列(Litopenaeus vannamei beta-actin gene promoter)，优化的VP4基因以及SV40 polyA转录终止信号，从而构建Dual-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4载体。将构建后的载体转化DH10Bac菌，挑选重组菌，抽提基因组转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒。
这样使用一个杆状病毒和Sf9细胞同时表达五个蛋白，即优化了的VP1，VP0以及VP3，VP2，VP4蛋白序列，表达的这五个蛋白能够自发的组装成VLP，并且因为里面包含VP0以及VP2和VP4，能够更好的和VP1，VP3进行组装，组装效率高。本发明同时表达VP1，VP3，VP2，VP4以及VP0五个蛋白，VP1，VP3和VP0蛋白能够组装成VLP，VP1，VP3和VP2，VP4蛋白也能组装成VLP，共表达这五个蛋白，使得VLP的组装效率大大提高。形成的FMDV的VLP的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对猪没有致病性，并且本发明的疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本，可以大规模批量生产，质控容易，安全性高，免疫原性好，批次间稳定。
实施例1实施例1转移载体Dual-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4构建与鉴定
1.转移载体Dual-VP3构建与鉴定
1.1VP3基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的VP3基因(SEQ ID NO:1)并克隆到pUC17载体上得到pUC-VP3质粒载体。以pUC-VP3质粒作为模板，VP3-F、VP3-R作为上下游引物进行PCR扩增(VP3-F、VP3-R的基因序列如SEQ ID NO.2、3所示)，扩增体系见表1。
表1 VP3基因扩增体系
反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在0.7kbp附近的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
1.2酶切与纯化将pFastBacDual质粒和VP3基因PCR扩增产物使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2、表3。
将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac Dual质粒以及VP3基因片段。
表2 VP3基因酶切反应体系
表3 pFastbacDual质粒酶切反应体系
1.3连接将双酶切的pFastBac Dual质粒和VP3基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表4。
表4 VP3基因与pFastBac Dual质粒连接体系
1.4转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
1.5菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，VP3-F和VP3-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图2所示，出现0.7kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。
2.转移载体Dual-VP3-VP0构建与鉴定
2.1VP0基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的VP0基因(SEQ ID NO:4)并克隆到pUC17载体上得到pUC-VP0质粒载体。以pUC-VP0质粒作为模板，VP0-F、VP0-R作为上下游引物进行PCR扩增(VP0-F、VP0-R的基因序列如SEQ ID NO.5、6所示)，扩增体系见表5。
表5 VP0基因扩增体系
反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图3所示，在0.9kbp附近的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
2.2酶切与纯化将Dual-VP3质粒和VP0基因PCR扩增产物使用Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ 37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表6、表7。
将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac Dual质粒以及VP0基因片段。
表6 VP0基因酶切反应体系
表7 Dual-VP3质粒酶切反应体系
2.3连接将双酶切的Dual-VP3质粒和VP0基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表8。
表8 VP0基因与Dual-VP3质粒连接体系
2.4转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
2.5菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，VP0-F和VP0-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图4所示，出现0.9kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。
3.转移载体Dual-VP3-VP0-VP2构建与鉴定
3.1 VP2基因表达框扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了VP2基因表达框(SEQ ID NO:7)并克隆到pUC17载体上得到pUC-VP2质粒载体，该基因表达框包括对虾β-actin基因启动子，密码子优化的FMDV VP2基因以及SV40 poly A终止信号序列。以pUC-VP2质粒作为模板，VP2-F、VP2-R作为上下游引物进行PCR扩增(VP2-F、VP2-R的基因序列如SEQ ID NO.9、10所示)，扩增体系见表9。
表9 VP2基因扩增体系
反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图5所示，在1.4kbp附近的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
3.2酶切与纯化将Dual-VP3-VP0质粒和VP2基因表达框PCR扩增产物使用SnaB Ⅰ37℃单酶切3小时，具体酶切反应体系见表10、表11。
将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的Dual-VP3-VP0质粒和VP2基因表达框PCR扩增产物。
表10 VP2基因酶切反应体系
表11 Dual-VP3-VP0质粒酶切反应体系
3.3连接将双酶切的Dual-VP3-VP0质粒和VP2基因表达框酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表12。
表12 VP2基因表达框PCR产物与Dual-VP3-VP0质粒连接体系
3.4转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
3.5菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，VP2-F和VP2-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图6所示，出现1.4kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。
4.转移载体Dual-VP3-VP0-VP2-VP1构建与鉴定
4.1VP1基因表达框扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了VP1基因表达框(SEQ ID NO:11)并克隆到pUC17载体上得到pUC-VP1质粒载体，该VP1基因表达框包括OpIE启动子，密码子优化的FMDVVP1基因以及OpIEpolyA转录终止信号序列。以pUC-VP1质粒作为模板，VP1-F、VP1-R作为上下游引物进行PCR扩增(VP1-F、VP1-R的基因序列如SEQ ID NO.13、14所示)，扩增体系见表13。
表13 VP1基因表达框扩增体系
反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图7所示，在1.3kbp附近的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
4.2酶切与纯化将Dual-VP3-VP0-VP2质粒和VP1基因表达框PCR扩增产物使用AvrⅡ内切酶37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表14、表15。
将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的Dual-VP3-VP0-VP2质粒和VP1基因表达框PCR扩增产物。
表14 VP1基因表达框PCR产物酶切反应体系
表15 Dual-VP3-VP0-VP2质粒酶切反应体系
4.3连接将双酶切的Dual-VP3-VP0-VP2质粒和VP1基因表达框酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表16。
表16 VP1基因表达框与Dual-VP3-VP0-VP2质粒连接体系
4.4转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
4.5菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，VP1-F和VP1-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图8所示，出现1.3kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。
5.Dual-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4载体的构建
5.1VP4基因表达框扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了VP4基因表达框(SEQ ID NO:15)并克隆到pUC17载体上得到pUC-VP4质粒载体，该VP4基因表达框包括对虾β-actin，密码子优化的FMDV VP4基因以及SV40 poly A转录终止信号序列。以pUC-VP4质粒作为模板，VP4-F、VP4-R作为上下游引物进行PCR扩增(VP4-F、VP4-R的基因序列如SEQ ID NO.17、18所示)，扩增体系见表17。
表17 VP4基因表达框扩增体系
反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图9所示，在1.0kbp附近的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
5.2酶切与纯化将Dual-VP3-VP0-VP2-VP1质粒和VP4基因表达框PCR扩增产物使用BsrG Ⅰ内切酶37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表18、表19。
将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的Dual-VP3-VP0-VP2-VP1质粒和VP4基因表达框PCR扩增产物。
表18 VP4基因表达框PCR产物酶切反应体系
表19 Dual-VP3-VP0-VP2-VP1质粒酶切反应体系
5.3连接将双酶切的Dual-VP3-VP0-VP2-VP1质粒和VP4基因表达框酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表20。
表20 VP4基因表达框与Dual-VP3-VP0-VP2-VP1质粒连接体系
5.4转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
5.5菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，VP4-F和VP4-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图10所示，出现1.0kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含有目的基因的转移载体Dual-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4其示意图如图11。
实施例2重组杆状病毒基因组Bac-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4构建
1.DH10Bac菌转化取实施例1中1μl Dual-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4质粒加入100μl的DH10Bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，各加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时。取100μl菌液稀释81倍后，取100μl稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上，37℃培养48小时。
2.挑选单克隆分别使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒。获得重组质粒Bacmid-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4。
实施例3重组杆状病毒转染
六孔板中每个孔接种0.8×106个Sf9细胞，细胞汇合度为50～70％。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μl转染培养基T1稀释4μl的Cellfectin转染试剂，短暂的漩涡震荡；用100μl转染培养T1基稀释3μg实施例2中的重组Bacmid-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4质粒，将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。待细胞贴壁后加入上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2mlSF-SFM新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清。获得重组杆状病毒rBac-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4，对收获的P1代重组杆状病毒使用MTT相对效力法检测病毒滴度，rBac-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4P1种毒病毒滴度为5.4×107pfu/mL。扩增重组杆状病毒rBac-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4作为种毒备用。
实施例4 SDS-PAGE检测
将实施例3中收获的细胞培养物进行SDS-PAGE检测，同时分别使用感染空杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。如图12所示，在分子量约21kDa、33kDa、26kDa、24kDa和9kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。
实施例5 Western Blot鉴定
将实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，猪源抗FMDV阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗猪多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图13所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。
实施例6间接免疫荧光检测
分别向96孔细胞培养板中加入转染过rBac-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4的Sf9细胞悬液，100μl/孔(细胞浓度为2.5×105～4.0×105个/ml)，接种4孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板底壁，然后每孔加入10μl稀释10倍的毒种。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃恒温培养箱中培养72-96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮(1:1)固定。首先与猪源抗FMDV多抗血清反应，然后与FITC标记的羊抗猪IgG反应，倒置荧光显微镜观察结果。如图14所示，接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察到荧光，说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病毒构建正确。
实施例7电镜检测
将重组杆状病毒细胞培养物超声破碎，12000r/min离心30分钟，取上清，0.22μm滤膜过滤，去除杂质，使用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩10倍。每个离心管加入浓度为40％的蔗糖溶液10ml，然后加入2.0ml超滤浓缩样品，29000r/min超速离心2小时，弃上清，沉淀用2.0ml PBS重悬。然后将悬液经过浓度分别为50％、60％、70％、80％的梯度浓度蔗糖离心，29000r/min超速离心2小时，然后收集位于60％～70％浓度交界处的条带。使用磷钨酸负染观察收集的产物，电镜下观察到与O型FMDV病毒粒子大小相当、形态学相近的病毒样颗粒，电镜结果见图15。
实施例8昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及VP3-VP0-VP2-VP1-VP4表达定量
在1000ml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×106cell/mL，活力大于95％时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×105cell/mL。当细胞浓度达到3-55×106cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3-55×106cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-85×106cell/mL时，接种重组杆状病毒rBac-VP3-VP0-VP2-VP1-VP4，反应器培养条件为pH值6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80％、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50％、搅拌速度100-180rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48h后，加千分之二终浓度Na2S2O3终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8℃保存疫苗原液。
实施例9蛋白纯化
将收获的原液使用阳离子交换层析法进行纯化
使用强阳粒子层析填料POROS50HS进行粒子交换层析，填料使用前使用0.5M NaOH进行消毒。然后用微滤缓冲液在室温平衡，然后将疫苗原液以125mL/min的速率上柱，然后用漂洗bufferA(0.05M MOPS(钠盐)，pH＝7.0，0.5M NaCl)洗脱8个柱体积。然后线性梯度进行洗脱，从0％ bufferA到100％ buffer B(0.05M MOPS(钠盐)，pH＝7.0，1.5M NaCl)，其中线性洗脱一共洗脱了10个柱体积，然后平均分别收获这10个柱体积的洗脱物。线性洗脱完了后，再用bufferB洗脱2个柱体积，并分别收集。将收集的样品放在2L的无菌的塑料瓶中放置在4℃。然后将最后一个洗脱峰(A280)下收集的组份无菌过滤储存在4℃。
2.3羟基磷灰石疏水层析
使用预装羟基磷灰石柱(CHTTMCeramic Hydroxyapatite Type II Media)，首先使用50mM MOPS(钠盐)，pH＝7.0，1.25M NaCl进行平衡，然后将上面初步纯化的样品以90cm/hour进行上样，上完样后使用8体积的平衡液进行洗脱直至UV值为零。然后使用洗脱液(0.2M磷酸盐，pH＝7.0，1.25MNaCl)进行梯度洗脱，洗脱液浓度从0％到100％，速度仍然是90cm/h,洗脱体积是4个柱体积。纯化得到目的蛋白。
将纯化的目的单边使用BCA总蛋白定量，然后结合灰度扫描确定目的蛋白纯度，纯化后的蛋白如图16所示，目的蛋白浓度为312ug/mL,纯度为92％。
实施例10疫苗的制备
将适量纯化的O型口蹄疫病毒VP3-VP0-VP2-VP1-VP4蛋白加入到MONTANIDE ISA 206 VG佐剂中(体积比为1:1)，使蛋白终浓度为100ug/mL，乳化，质检合格后置于4℃保存。
实施例11免疫实验
1月龄左右猪(抗体效价<1:16)，21头，随机分为3组，每组7只，A组注射实施例10制备的基因工程疫苗；B组注射生理盐水；C组注射某品牌市售O型FMDV全病毒灭活疫苗。分别颈部肌肉注射2ml疫苗，于首免后28天加强免疫，间隔2周采血1次，分离血清，检测抗体效价。使用购自兰州兽医研究所的口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒进行抗体检测。实验结果如下
1、结果判定：抗体效价≥1:128判为口蹄疫O型抗体阳性；1:64～1:128时，判为可疑；<1:64，判定为阴性。可疑血清样品，可以重测，重测抗体效价≥1:128判为阳性，<1:128判为判为阴性。
根据图上结果可以看出，阴性对照组整个实验过程中，抗体都是阴性的。免疫重组基因工程疫苗，猪在免疫后21d时全部转阳，二免后七天，抗体水平有一个非常高的提高，并且持续到一免后56d。抗体激发水平和抗体持续期优于市售某品牌全病毒灭活疫苗。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州世诺生物技术有限公司
<120> 口蹄疫病毒新型基因工程亚单位疫苗
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ggatccatgg gcatcttccc agtggcttgc tcggatggat acggaggact ggtgaccacc 60
gatccaaaga ccgccgatcc agtgtacggc aaggtgttca accccccacg caacatgctg 120
ccaggacgtt tcaccaacct gctggacgtg gccgaggcct gcccaacctt cctgcacttc 180
gacggagacg tgccatacgt gaccaccaag accgatagcg atcgcgtgct ggctcagttc 240
gatctgtcct tggccgccaa gcacatgagc aacaccttcc tggccggact ggctcagtac 300
tacacccagt acagcggcac cgtgaacctg cacttcatgt tcaccggccc aaccgacgct 360
aaggcccgtt acatgatcgc ctacgcccca ccaggcatgg aaccaccaaa gaccccagag 420
gccgccgctc attgtattca cgccgaatgg gacaccggcc tgaacagcaa gttcaccttc 480
agcatcccat acctgagcgc cgccgattac gcttacacag ctagcgacgc cgccgaaaca 540
accaacgtgc agggttgggt ctgcctgttc caaatcaccc acggaaaggc cgagggagac 600
gctttggtgg tgttggcttc ggccggaaag gatttcgagc tgcgactgcc agtggacgct 660
cgccagcagt aaaagctt 678
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 2
ataggatcca tgggcatctt cccagtggct tgctc 35
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 3
ataaagcttt tactgctggc gagcgtccac tggcagtcgc ag 42
<210> 4
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ctcgagatgg gagctggaca aagtagccca gctaccggaa gccagaatca gagcggaaac 60
accggcagca tcatcaacaa ctactacatg cagcagtacc agaacagcat ggacacccag 120
ctgggcgata atgccatcag cggaggaagc aacgagggca gcacagatac caccagcacc 180
cacaccacca acacccagaa caacgattgg ttcagcaagc tggctagcag cgcctttagc 240
ggactgttcg gagctctgct ggccgataag aagaccgagg agaccaccct gctggaagat 300
cgcatcctga ccacccgcaa cggacataca accagcacca cccagagcag cgtgggaatt 360
acccacggat acgccacagc cgaggatttc gtgaacggcc caaataccag cggcctggag 420
acacgagtgg tgcaagccga gcgcttcttc aagacccacc tgttcgattg ggtgaccagc 480
gaccccttcg gacgttgcta tctgctggag ctgccaaccg accacaaggg agtgtacggc 540
tccctgaccg acagctacgc ctacatgcgc aacggttggg acgtggaagt gacagccgtg 600
ggaaaccagt tcaacggcgg ttgtctgctg gtggcgatgg tgcccgagtt gtgctccatt 660
gagcgtcgag agctgttcca actgaccctg ttcccacacc agttcatcaa cccccgcacc 720
aacatgaccg cccatatcaa ggtgccattc gtgggcgtga accgctacga ccagtacaag 780
gtgcacaagc cctggacatt ggtggtgatg gtggtggctc cactgacagt gaacaccgag 840
ggagctccac agatcaaggt gtacgccaac atcgccccaa ccaacgtgca cgtggccgga 900
gagttcccca gcaaggagta aggtacc 927
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 5
atactcgaga tgggagctgg acaaagtagc ccagctaccg 40
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 6
ataggtacct tactccttgc tggggaactc tcc 33
<210> 7
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
tacgtaaaaa tgaggcggcg gcaatgattt acgggcatat attcggtcga ggaggacgaa 60
atattctgaa atgggacgaa aggggatgac gcggcgcggc tctcgtcttc ccgcctcgca 120
ttcaacgctc ggctcgacca atcagcggcc gagttttgcg ctatgaccat ataaggcgat 180
acgtttgtcc gggtggggtg ggacgagcca ttgcggctta tcgcgcgggg gagtaccctc 240
tcaaaatgca ctatgcactg ccgtaacact ctttcggaaa gaatataata catcagtaga 300
tacctcttga aaattaggat ccgatgcata ccataaatcc ccaaattaga gagaataaaa 360
ggggttaatt cgatcgagag taatgacact tggaacgacc tcccctctgg agaaagtcga 420
cgatccgaga ggtggagtaa gcgccctact cactctctca tggataagaa gaccgaggag 480
accaccctgc tggaagatcg catcctgacc acccgcaacg gacatacaac cagcaccacc 540
cagagcagcg tgggaattac ccacggatac gccacagccg aggatttcgt gaacggccca 600
aataccagcg gcctggagac acgagtggtg caagccgagc gcttcttcaa gacccacctg 660
ttcgattggg tgaccagcga ccccttcgga cgttgctatc tgctggagct gccaaccgac 720
cacaagggag tgtacggctc cctgaccgac agctacgcct acatgcgcaa cggttgggac 780
gtggaagtga cagccgtggg aaaccagttc aacggcggtt gtctgctggt ggcgatggtg 840
cccgagttgt gctccattga gcgtcgagag ctgttccaac tgaccctgtt cccacaccag 900
ttcatcaacc cccgcaccaa catgaccgcc catatcaagg tgccattcgt gggcgtgaac 960
cgctacgacc agtacaaggt gcacaagccc tggacattgg tggtgatggt ggtggctcca 1020
ctgacagtga acaccgaggg agctccacag atcaaggtgt acgccaacat cgccccaacc 1080
aacgtgcacg tggccggaga gttccccagc aaggagtaat gagtcgagaa gtactagagg 1140
atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 1200
ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca 1260
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 1320
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc 1380
tacgta 1386
<210> 8
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
atggataaga agaccgagga gaccaccctg ctggaagatc gcatcctgac cacccgcaac 60
ggacatacaa ccagcaccac ccagagcagc gtgggaatta cccacggata cgccacagcc 120
gaggatttcg tgaacggccc aaataccagc ggcctggaga cacgagtggt gcaagccgag 180
cgcttcttca agacccacct gttcgattgg gtgaccagcg accccttcgg acgttgctat 240
ctgctggagc tgccaaccga ccacaaggga gtgtacggct ccctgaccga cagctacgcc 300
tacatgcgca acggttggga cgtggaagtg acagccgtgg gaaaccagtt caacggcggt 360
tgtctgctgg tggcgatggt gcccgagttg tgctccattg agcgtcgaga gctgttccaa 420
ctgaccctgt tcccacacca gttcatcaac ccccgcacca acatgaccgc ccatatcaag 480
gtgccattcg tgggcgtgaa ccgctacgac cagtacaagg tgcacaagcc ctggacattg 540
gtggtgatgg tggtggctcc actgacagtg aacaccgagg gagctccaca gatcaaggtg 600
tacgccaaca tcgccccaac caacgtgcac gtggccggag agttccccag caaggagtaa 660
tga 663
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 9
atatacgtaa aaatgaggcg gcggcaatga tttacg 36
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 10
atatacgtag atccagacat gataagatac at 32
<210> 11
<211> 1330
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
cctaggtcat gatgataaac aatgtatggt gctaatgttg cttcaacaac aattctgttg 60
aactgtgttt tcatgtttgc caacaagcac ctttatactc ggtggcctcc ccaccaccaa 120
cttttttgca ctgcaaaaaa acacgctttt gcacgcgggc ccatacatag tacaaactct 180
acgtttcgta gactatttta cataaatagt ctacaccgtt gtatacgctc caaatacact 240
accacacatt gaaccttttt gcagtgcaaa aaagtacgtg tcggcagtca cgtaggccgg 300
ccttatcggg tcgcgtcctg tcacgtacga atcacattat cggaccggac gagtgttgtc 360
ttatcgtgac aggacgccag cttcctgtgt tgctaaccgc agccggacgc aactccttat 420
cggaacagga cgcgcctcca tatcagccgc gcgttatctc atgcgcgtga ccggacacga 480
ggcgcccgtc ccgcttatcg cgcctataaa tacagcccgc aacgatctgg taaacacagt 540
tgaacagcat ctgttatgac aacaagtacc ggagagagcg ccgatccagt gacagccaca 600
gtggagaact acggaggaga aacacaggtg cagcgtcgcc accataccga cgtgtccttc 660
atcctggacc gcttcgtgaa agtgaccccc aaggacagca tcaacgtgct ggacctgatg 720
cagaccccca gtcataccct ggtgggagct ctgctgcgta ccgccaccta ctacttcgcc 780
gatctggagg tcgccgtgaa gcacgaggga gatctgactt gggtgcccaa cggagctcca 840
gaagccgctc tggataacac caccaacccc accgcctacc ataaggctcc actgacacgc 900
ctggctctgc catataccgc tccacatcgc gtgctggcta ccgtgtacaa cggcaattgc 960
aagtacgccg gaggaagcct gccaaacgtg cgaggagatc tgcaagtgct ggcccaaaaa 1020
gccgctcgtc cactgccaac cagcttcaac tacggagcca tcaaggccac acgcgtgaca 1080
gagctgctgt accgcatgaa gcgcgccgag acctattgcc cacgtccatt gttggccgtg 1140
catccaagcg ccgcccgtca taagcagaag atcgtggctc ccgtgaagca gtaaatctta 1200
gtttgtattg tcatgtttta atacaatatg ttatgtttaa atatgttttt aataaatttt 1260
ataaaataat ttcaactttt attgtaacaa cattgtccat ttacacactc ctttcaagcg 1320
cgtgcctagg 1330
<210> 12
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
atgacaacaa gtaccggaga gagcgccgat ccagtgacag ccacagtgga gaactacgga 60
ggagaaacac aggtgcagcg tcgccaccat accgacgtgt ccttcatcct ggaccgcttc 120
gtgaaagtga cccccaagga cagcatcaac gtgctggacc tgatgcagac ccccagtcat 180
accctggtgg gagctctgct gcgtaccgcc acctactact tcgccgatct ggaggtcgcc 240
gtgaagcacg agggagatct gacttgggtg cccaacggag ctccagaagc cgctctggat 300
aacaccacca accccaccgc ctaccataag gctccactga cacgcctggc tctgccatat 360
accgctccac atcgcgtgct ggctaccgtg tacaacggca attgcaagta cgccggagga 420
agcctgccaa acgtgcgagg agatctgcaa gtgctggccc aaaaagccgc tcgtccactg 480
ccaaccagct tcaactacgg agccatcaag gccacacgcg tgacagagct gctgtaccgc 540
atgaagcgcg ccgagaccta ttgcccacgt ccattgttgg ccgtgcatcc aagcgccgcc 600
cgtcataagc agaagatcgt ggctcccgtg aagcagtaa 639
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 13
atacctaggt catgatgata aacaatgtat ggtg 34
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 14
atacctaggc acgcgcttga aaggagtgtg taa 33
<210> 15
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
tgtacaaaaa tgaggcggcg gcaatgattt acgggcatat attcggtcga ggaggacgaa 60
atattctgaa atgggacgaa aggggatgac gcggcgcggc tctcgtcttc ccgcctcgca 120
ttcaacgctc ggctcgacca atcagcggcc gagttttgcg ctatgaccat ataaggcgat 180
acgtttgtcc gggtggggtg ggacgagcca ttgcggctta tcgcgcgggg gagtaccctc 240
tcaaaatgca ctatgcactg ccgtaacact ctttcggaaa gaatataata catcagtaga 300
tacctcttga aaattaggat ccgatgcata ccataaatcc ccaaattaga gagaataaaa 360
ggggttaatt cgatcgagag taatgacact tggaacgacc tcccctctgg agaaagtcga 420
cgatccgaga ggtggagtaa gcgccctact cactctctca tgggagctgg acaaagtagc 480
ccagctaccg gaagccagaa tcagagcgga aacaccggca gcatcatcaa caactactac 540
atgcagcagt accagaacag catggacacc cagctgggcg ataatgccat cagcggagga 600
agcaacgagg gcagcacaga taccaccagc acccacacca ccaacaccca gaacaacgat 660
tggttcagca agctggctag cagcgccttt agcggactgt tcggagctct gctggcctaa 720
tgagtcgaga agtactagag gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt 780
gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt 840
gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 900
ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 960
gtatcttatc atgtctggat ctgtaca 987
<210> 16
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
atgggagctg gacaaagtag cccagctacc ggaagccaga atcagagcgg aaacaccggc 60
agcatcatca acaactacta catgcagcag taccagaaca gcatggacac ccagctgggc 120
gataatgcca tcagcggagg aagcaacgag ggcagcacag ataccaccag cacccacacc 180
accaacaccc agaacaacga ttggttcagc aagctggcta gcagcgcctt tagcggactg 240
ttcggagctc tgctggccta atga 264
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 17
atatgtacaa aaatgaggcg gcggcaatga tttacg 36
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工引物(人工序列)
<400> 18
atatgtacag atccagacat gataagatac attgatgag 39
<210> 19
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 19
Met Gly Ile Phe Pro Val Ala Cys Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val
1 5 10 15
Thr Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Lys Val Phe Asn
20 25 30
Pro Pro Arg Asn Met Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val
35 40 45
Ala Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu His Phe Asp Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Val Thr Thr Lys Thr Asp Ser Asp Arg Val Leu Ala Gln Phe Asp Leu
65 70 75 80
Ser Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Phe Leu Ala Gly Leu Ala
85 90 95
Gln Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Val Asn Leu His Phe Met Phe
100 105 110
Thr Gly Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Ile Ala Tyr Ala Pro
115 120 125
Pro Gly Met Glu Pro Pro Lys Thr Pro Glu Ala Ala Ala His Cys Ile
130 135 140
His Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile
145 150 155 160
Pro Tyr Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Ala Ala
165 170 175
Glu Thr Thr Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Leu Phe Gln Ile Thr His
180 185 190
Gly Lys Ala Glu Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Ala Ser Ala Gly Lys
195 200 205
Asp Phe Glu Leu Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Gln Gln
210 215 220
<210> 20
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 20
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
1 5 10 15
Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
20 25 30
Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu
65 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr
100 105 110
Gln Ser Ser Val Gly Ile Thr His Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe
115 120 125
Val Asn Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala
130 135 140
Glu Arg Phe Phe Lys Thr His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro
145 150 155 160
Phe Gly Arg Cys Tyr Leu Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val
165 170 175
Tyr Gly Ser Leu Thr Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp
180 185 190
Val Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu
195 200 205
Val Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Ser Ile Glu Arg Arg Glu Leu Phe
210 215 220
Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met
225 230 235 240
Thr Ala His Ile Lys Val Pro Phe Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln
245 250 255
Tyr Lys Val His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro
260 265 270
Leu Thr Val Asn Thr Glu Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn
275 280 285
Ile Ala Pro Thr Asn Val His Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu
290 295 300
<210> 21
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 21
Met Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu
1 5 10 15
Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly
20 25 30
Ile Thr His Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val Asn Gly Pro Asn
35 40 45
Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu Arg Phe Phe Lys
50 55 60
Thr His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro Phe Gly Arg Cys Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val Tyr Gly Ser Leu Thr
85 90 95
Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val Glu Val Thr Ala
100 105 110
Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Met Val Pro
115 120 125
Glu Leu Cys Ser Ile Glu Arg Arg Glu Leu Phe Gln Leu Thr Leu Phe
130 135 140
Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Lys
145 150 155 160
Val Pro Phe Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Val His Lys
165 170 175
Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu Thr Val Asn Thr
180 185 190
Glu Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile Ala Pro Thr Asn
195 200 205
Val His Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu
210 215
<210> 22
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 22
Met Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp
20 25 30
Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Ser
35 40 45
Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ser His Thr Leu Val Gly
50 55 60
Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala
65 70 75 80
Val Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu
85 90 95
Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro
100 105 110
Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala
115 120 125
Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn
130 135 140
Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu
145 150 155 160
Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu
165 170 175
Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu
180 185 190
Leu Ala Val His Pro Ser Ala Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala
195 200 205
Pro Val Lys Gln
210
<210> 23
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 23
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
1 5 10 15
Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
20 25 30
Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu
65 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Leu Ala
85
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！