一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法与流程

本发明涉及干细胞分离培养技术领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,msc)是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起源细胞。新近的研究表明，众多成体组织中(如骨髓、肌肉、胃肠道、皮肤、视网膜、外周及中枢神经系统等)均存在间充质干细胞。mscs它来源广泛、易体外分离扩增，具有向三种胚层细胞分化的多向分化潜能；具有低免疫原性、不能刺激产生同种异体免疫反应、不被细胞毒性t细胞和nk细胞杀伤，“归巢”修复作用，肿瘤趋向性以及免疫调节作用。

研究表明，脐带间充质细胞主要来源于脐带华通氏胶(wharton’sjelly)。uc-mscs的优势在于：①脐带为分娩后的废弃物，取材方便，来源广泛，易于收集、保存、冷冻、不受伦理、道德及法律方面的争论与限制；②相对纯净，与干细胞输注相关的病毒和病原微生物感染率远低于骨髓移植；③人uc-mscs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以为实验和临床提供充足的细胞来源；④人uc-mscs不表达或低表达组织相容性标记，免疫原性低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，不须经过严格配型即能使用，适宜于不同个体之间的移植；⑤uc-mscs可直接获取于新生儿脐带，进行储存库长期保存，不存在对机体产生创伤。因此uc-mscs已被当做是临床和科研工作中mscs的一个更佳来源。

人脐带组织中富含华通氏胶，如何高效地将华通氏胶中的脐带间充质干细胞分离出来是目前主要研究的难点，也是制约后期临床应用和产业化的关键技术。脐带间充质干细胞原代分离制备最常见分离方法主要为酶消化法和组织块贴壁培养法。

酶消化分离的经济成本高，消化时间长，一般需要4～6个小时，最长的有消化16小时，组织块大小同时也会影响细胞的消化效果，如消化不充分，无法得到足够数量的细胞，而消化时间过长，其消化酶对细胞的损伤太大，细胞会大量死亡。因为脐带主要富含华通氏胶，消化后的液体非常粘稠，离心后不宜分离出细胞。常规的组织块培养法原代培养时间较长，需要14-20d，主要为组织块大小和贴壁影响其分离效率。

技术实现要素：

本发明的提供一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法。

本发明的方案是：

一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，包括下列步骤：

1)清理，无菌条件下，获取新鲜脐带，将新鲜脐带用清洗液冲洗脐带表面，清洗去除脐带上的血管残留的血液与其他杂物；

2)处理，将清洗后的脐带用手术刀去除脐静脉与脐带表面的羊膜层，然后将脐带剪成细条状，再将细条状脐带剪碎为1～3mm³的脐带组织块；此操作方法较简单，节约时间，仅剩脐带为wharton’s胶，wharton’s胶为脐带间充质干细胞的主要来源；

3)培养，将所述脐带组织块平铺于细胞培养皿中，将水分挥发后加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；此操作的特点是组织块小，组织贴壁牢固，有利于脐带间充质干细胞从组织块中爬出，也能获得更多原代细胞；

4)接种传代，所述脐带组织块原代分离培养脐带间充质干细胞生长达到80～90％融合后，即可传代扩增培养，获得脐带间充质干细胞，用0.0625％胰酶/edta消化细胞，按3000～5000个/cm²接种，所述脐带间充质干细胞接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述脐带间充质干细胞可以扩增至25代次以上。消化方式胰酶浓度低，在消化过程中对细胞的损伤小，接种密度可以很好的控制细胞的生长周期，按此种消化，接种密度传代脐带间充质干细胞可以扩增25代次以上。

作为优选的技术方案，所述步骤1)中清洗液含青霉素、链霉素的磷酸盐缓冲液。

作为优选的技术方案，步骤3)中所述10～20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-mem基础培养液与胎牛血清，对干细胞的分离、增殖更有利，同时在长期扩增培养过程能更好的维持干细胞干性及生物学功能。

作为优选的技术方案，还包括步骤5)将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、无菌检测、支原体检测、安全性评估。

作为优选的技术方案，所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天换一次10～20％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换10～20％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见脐带间充质干细胞从所述脐带组织块中爬出，7～10天后脐带间充质干细胞可以达到80～90％融合。

作为优选的技术方案，所述步骤3)中加入20～50ml/皿的含有10～20％胎牛血清的培养液。

本发明还提供了一种用于建立了脐带间充质干细胞生产规范、质量控制体系及评估体系，采用如权利要求1所述的脐带间充质干细胞分离培养扩增方法。

由于采用了上述技术方案，一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，1)清理，无菌条件下，获取新鲜脐带，将新鲜脐带用清洗液冲洗脐带表面，清洗去除脐带上的血管残留的血液与其他杂物；2)处理，将清洗后的脐带用手术刀去除脐静脉与脐带表面的羊膜层，然后将脐带剪成细条状，再将细条状脐带剪碎为1～3mm³的脐带组织块；3)培养，将所述脐带组织块平铺于细胞培养皿中，将水分挥发后加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；4)接种传代，所述脐带组织块原代分离培养脐带间充质干细胞生长达到80～90％融合后，即可传代扩增培养，获得脐带间充质干细胞，用0.0625％胰酶/edta消化细胞，按3000～5000个/cm²接种，所述脐带间充质干细胞接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述脐带间充质干细胞可以扩增至25代次以上。

本发明的优点：

本发明采用的组织块分离法获得的间充质干细胞方法简单，成本低，细胞活性好，纯度高，最终收获细胞浓度高，获得的间充质干细胞方法简单，能快速高效分离msc，培养时间缩短，培养第4～5天即可看到细胞从组织块爬出，最终收获细胞浓度高，整个脐带间充质干细胞培养工艺能够标准化、程序化、规范化，细胞质量完全符合国家颁布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》，为临床应用提供保障。

本发明从去除脐带动脉，静脉及表层羊膜，控制组织块大小为1-3mm³，采用细胞培养皿进行平铺，水分挥发完全后再补液，对原代细胞的获得率得到明显的提高。

附图说明

图1为实施例3的脐带剪成细条状图；

图2为实施例3的脐带组织块贴壁图；

图3为实施例3的脐带间充质干细胞从组织块中爬出图；

图4为实施例3的脐带间充质干细胞p10代流式检测cd90图；

图5为实施例3的脐带间充质干细胞p10代流式检测cd105图；

图6为实施例3的脐带间充质干细胞p10代流式检测cd73图；

图7为实施例3的脐带间充质干细胞p10代流式检测negative图；

图8为实施例4的脐带间充质干细胞进行多向分化潜能鉴定图；

图9为实施例5的脐带间充质干细胞生长曲线图。

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明提供了一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法以解决上述背景技术中的问题。

一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，包括下列步骤：

1)清理，无菌条件下，获取新鲜脐带，将新鲜脐带用清洗液冲洗脐带表面，清洗去除脐带上的血管残留的血液与其他杂物；

2)处理，将清洗后的脐带用手术刀去除脐静脉与脐带表面的羊膜层，然后将脐带剪成细条状，再将细条状脐带剪碎为1～3mm³的脐带组织块；此操作方法较简单，节约时间，仅剩脐带为wharton’s胶，wharton’s胶为脐带间充质干细胞的主要来源；

3)培养，将所述脐带组织块平铺于细胞培养皿中，将水分挥发后加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；此操作的特点是组织块小，组织贴壁牢固，有利于细胞从组织块中爬出，也能获得更多原代细胞；

4)接种传代，所述脐带组织块原代分离培养脐带间充质干细胞生长达到80～90％融合后，即可传代扩增培养，获得脐带间充质干细胞，用0.0625％胰酶/edta消化细胞，按3000～5000个/cm²接种，所述脐带间充质干细胞接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述脐带间充质干细胞可以扩增至25代次以上。消化方式胰酶浓度，在消化过程中对细胞的损伤小，接种密度可以很好的控制细胞的生长周期，按此种消化，接种密度传代脐带间充质干细胞可以扩增25代次以上。

所述步骤1)中清洗液含青霉素、链霉素的磷酸盐缓冲液。

步骤3)中所述10～20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-mem基础培养液与胎牛血清，对干细胞的分离、增殖更有利，同时在长期扩增培养过程能更好的维持干细胞干性及生物学功能。

还包括步骤5)将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、无菌检测、支原体检测、安全性评估。

所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天换一次10～20％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换10～20％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见脐带间充质干细胞从所述脐带组织块中爬出，7～10天后脐带间充质干细胞可以达到80～90％融合。

所述步骤3)中加入20～50ml/皿的含有10～20％胎牛血清的培养液。

本发明还提供了一种用于建立了脐带间充质干细胞生产规范、质量控制体系及评估体系，采用如权利要求1所述的脐带间充质干细胞分离培养扩增方法。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：

1)清理，无菌条件下，获取新鲜脐带，将新鲜脐带用清洗液冲洗脐带表面，清洗去除脐带上的血管残留的血液与其他杂物；

2)处理，将清洗后的脐带用手术刀去除脐静脉与脐带表面的羊膜层，然后将脐带剪成细条状，再将细条状脐带剪碎为2mm³的脐带组织块；此操作方法较简单，节约时间，仅剩脐带为wharton’s胶，wharton’s胶为脐带间充质干细胞的主要来源；

3)培养，将所述脐带组织块平铺于细胞培养皿中，将水分挥发后加入含有10％胎牛血清的培养液中进行培养；此操作的特点是组织块小，组织贴壁牢固，有利于细胞从组织块中爬出，也能获得更多原代细胞；

4)接种传代，所述脐带组织块原代分离培养脐带间充质干细胞生长达到80％融合后，即可传代扩增培养，获得脐带间充质干细胞，用0.0625％胰酶/edta消化细胞，按3000～个/cm²接种，所述脐带间充质干细胞接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述脐带间充质干细胞可以扩增至25代次以上。消化方式胰酶浓度，在消化过程中对细胞的损伤小，接种密度可以很好的控制细胞的生长周期，按此种消化，接种密度传代脐带间充质干细胞可以扩增25代次以上。

所述步骤1)中清洗液含青霉素、链霉素的磷酸盐缓冲液。

步骤3)中所述10～20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-mem基础培养液与胎牛血清，对干细胞的分离、增殖更有利，同时在长期扩增培养过程能更好的维持干细胞干性及生物学功能。

还包括步骤5)将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、无菌检测、支原体检测、安全性评估。

所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天换一次10％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换10％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见脐带间充质干细胞从所述脐带组织块中爬出，7～10天后脐带间充质干细胞可以达到80～90％融合。

所述步骤3)中加入20ml/皿的含有10％胎牛血清的培养液。

实施例2：

一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，包括下列步骤：

1)清理，无菌条件下，获取新鲜脐带，将新鲜脐带用清洗液冲洗脐带表面，清洗去除脐带上的血管残留的血液与其他杂物；

2)处理，将清洗后的脐带用手术刀去除脐静脉与脐带表面的羊膜层，然后将脐带剪成细条状，再将细条状脐带剪碎为3mm³的脐带组织块；此操作方法较简单，节约时间，仅剩脐带为wharton’s胶，wharton’s胶为脐带间充质干细胞的主要来源；

3)培养，将所述脐带组织块平铺于细胞培养皿中，将水分挥发后加入含有20％胎牛血清的培养液中进行培养；此操作的特点是组织块小，组织贴壁牢固，有利于细胞从组织块中爬出，也能获得更多原代细胞；

4)接种传代，所述脐带组织块原代分离培养脐带间充质干细胞生长达到90％融合后，即可传代扩增培养，获得脐带间充质干细胞，用0.0625％胰酶/edta消化细胞，按5000个/cm²接种，所述脐带间充质干细胞接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述脐带间充质干细胞可以扩增至25代次以上。消化方式胰酶浓度，在消化过程中对细胞的损伤小，接种密度可以很好的控制细胞的生长周期，按此种消化，接种密度传代脐带间充质干细胞可以扩增25代次以上。

所述步骤1)中清洗液含青霉素、链霉素的磷酸盐缓冲液。

步骤3)中所述20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-mem基础培养液与胎牛血清，对干细胞的分离、增殖更有利，同时在长期扩增培养过程能更好的维持干细胞干性及生物学功能。

还包括步骤5)将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、无菌检测、支原体检测、安全性评估。

所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天换一次20％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换20％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见脐带间充质干细胞从所述脐带组织块中爬出，7～10天后脐带间充质干细胞可以达到80～90％融合。

所述步骤3)中加入50ml/皿的含有20％胎牛血清的培养液。

实施例3：

经过传染病等筛查，签署知情同意书和捐赠协议后的产妇，分娩后无菌收集脐带，无菌条件下，先用含青霉素、链霉素的磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗表面，清洗去除血管残留的血液和其他杂质。

剔除脐动脉，用手术刀片去除脐静脉及脐带表面的羊膜层，将脐带剪成细条状(见图1)，最后剪碎为1-3mm³大小的组织块。

将组织平铺于细胞培养皿中，待水分挥发后加入含10-20％胎牛血清的完全培养液。

细胞培养3天换液，每间隔2-3天换液，贴壁(见图2)4-5天后即可见细胞从组织块中爬出，7-10天后脐带间充质干细胞可以达到80-90％融合；

用0.0625％胰酶/edta消化细胞，按3000-5000个/cm²接种，细胞接种后4-5天可以达到95％融合传代。

所述述20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-mem基础培养液与胎牛血清。

将实施例3得到的脐带简充质干细胞进行脐带间充质干细胞干性维持，表面标记物流式分析三种培养液培养后的干细胞表面抗原，结果显示，获得的mscs均质性好。均表达cd73、cd105、cd90；不表达cd45,cd34,cd11b,cd19andhla-dr。结果为脐带间充质干细胞p10代流式检测cd73、cd90、cd105表达阳性，negative--cd45,cd34,cd11b,cd19andhla-dr表达阴性，见图4-图7。

实施例4：

将实施例3脐带间充质干细胞进行多向分化潜能鉴定，其中图8a为成骨分化对照，图8b为成骨分化后茜素红染色；图8c为成脂分化对照，图8d为成脂分化后油红“o”染色；图8e为成软骨分化对照，图8f为成软骨分化后阿辛利蓝染色。

实施例5：

采用此发明技术，对实施例3中脐带间充质干细胞进行扩增，其中p1代即可分离到140^10⁶细胞，传代p5可以获得1.47^10¹³扩增了100万倍。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。