本发明涉及生物资源领域，尤其涉及一种纤维素降解复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
随着现有葡萄果品产业稳步发展，生产规模不断扩大和标准化，栽培面积连年上升，每年的葡萄修剪枝条废弃物成了不可避免的问题。葡萄农业果园随着每年正常果树养护、整形修剪、果树种苗更新换代，都会产生大量果树枝条。由于果树枝条中纤维素高度复合，在自然环境下降解极为缓慢。传统的方法是将农业果园废弃枝条分拣成堆，统一在露天焚烧或者在园中长期堆放。果树修剪枝条的堆积不仅会占用果园空间，而且会降低果园有效生产面积，对园区周年果实产量造成影响。同时枝条长期堆放会导致病虫害因素积累，对果树的长期发展有极大的威胁。露天焚烧枝条会造成大气污染等环境问题，不仅导致果园废弃物资源的浪费，也会改变园区小气候，从而影响农业生产。因此果园生产者通常利用自然界中丰富的微生物，对果树枝条进行高效降解，产生的堆肥可用作营养丰富的有机肥料或优良的土壤调理剂，从而解决这一矛盾。葡萄废弃枝条取材方便，而且含有丰富的植物生长所需的各类养分，尤其适用于这一高效的方式去解决和利用。
果树枝条废弃物是园艺果品生产过程中不可避免的残留物，也是一种可利用的宝贵生物资源，良好的将这些生物资源重新投放到农业生产循环中，这对于保证水果产业的健康发展和支持相关产业的发展都具有十分重要的意义。
近年来，现有对纤维素降解菌的研究工作的重心主要在秸秆的堆肥和沤肥生产沼气方面，在果树枝条纤维素降解和堆肥制作方面研究较少。这是由于在果树枝条堆肥过程中，由于果树枝条中含有大量的木质素和纤维素等难降解物质，抑制堆肥的腐熟，造成堆肥周期长、生物学效应低、堆肥腐熟不完全以及堆肥质量较差等问题。堆肥物料的腐熟主要是通过多种微生物分解和转化有机物来实现的，但是在实际应用中，往往单一的菌种具有对某些物料的专一高效作用，其适用范围并不广泛。例如目前商业化非常普遍的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶等，以它为主要成分的腐解剂往往菌落组成简单，仅可以用于强烈分解秸秆等作物的固体废弃物，对果树枝条的降解作用极为有限，堆肥过程中很难达到理想效果。
技术实现要素：
本发明提供一种纤维素降解复合菌剂及其制备方法和应用，所用菌种间通过协同作用解决现有菌剂适用范围窄，堆肥效果差的缺陷。
第一方面，本发明提供一种纤维素降解复合菌剂，包括：细菌和真菌；所述细菌包括寡养单胞菌(stenotrophomonas)、苍白杆菌(ochrobactrum)和无色杆菌(achromobacter)，所述真菌包括链格孢菌(nimbyaalternantherae)、耐冷酵母(guehomyces)、假丝酵母菌(candida)、特异腐质霉菌(vanrijahumicola)和镰刀菌(fusarium)。
本发明经过大量实验研究，综合利用了寡养单胞菌、无色杆菌、假丝酵母菌、特异腐质霉、链格孢菌和镰刀菌对枝条碎末纤维素的降解作用，寡养单胞菌和耐冷酵母对粪肥中蛋白类物质的降解作用，链格孢菌对空心莲子草的防治作用，耐冷酵母对毒性的有机磷的降解作用，相互协同可以更好地针对现有技术中果树枝条难处理，堆肥效果差的问题，可以在很大程度上降解堆肥腐熟过程中的纤维素，并促进堆肥中n元素向着植物易吸收的方向转化。
进一步地，所述纤维素降解复合菌剂的活菌总数不少于7.2lgcfu/ml。
进一步地，所述纤维素降解复合菌剂中：寡养单胞菌(stenotrophomonas)的活菌数为3.0～3.5lgcfu/ml，无色杆菌(achromobacter)的活菌数为2.5～3.5lgcfu/ml，苍白杆菌(ochrobactrum)的活菌数为1.0～1.2lgcfu/ml，链格孢菌(nimbyaalternantherae)的活菌数为0.04lg～0.055lgcfu/ml，耐冷酵母(guehomyces)的活菌数为0.4～0.5lgcfu/ml，假丝酵母菌(candida)的活菌数为0.25～0.3lgcfu/ml，特异腐质霉(vanrijahumicola)的活菌数为0.15～0.2lgcfu/ml，镰刀菌(fusarium)的活菌数为0.05～0.06lgcfu/ml。
优选地，所述纤维素降解复合菌剂中：寡养单胞菌(stenotrophomonas)的活菌数为3.03～3.11lgcfu/ml，无色杆菌(achromobacter)的活菌数为2.975～3.045lgcfu/ml，苍白杆菌(ochrobactrum)的活菌数为1.183～1.212lgcfu/ml，链格孢菌(nimbyaalternantherae)的活菌数为0.05～0.052lgcfu/ml，耐冷酵母(guehomyces)的活菌数为0.441～0.462lgcfu/ml，假丝酵母菌(candida)的活菌数为0.268～0.274lgcfu/ml，特异腐质霉(vanrijahumicola)的活菌数为0.194～0.2lgcfu/ml，镰刀菌(fusarium)的活菌数为0.058～0.06lgcfu/ml。
第二方面，本发明提供了上述纤维素降解复合菌的制备方法，包括如下步骤：
将含有寡养单胞菌(stenotrophomonas)、苍白杆菌(ochrobactrum)、无色杆菌(achromobacter)、链格孢菌(nimbyaalternantherae)、耐冷酵母(guehomyces)、假丝酵母菌(candida)、特异腐质霉(vanrijahumicola)和镰刀菌(fusarium)的混合菌液接种于lhe培养基中发酵即得纤维素降解复合菌剂。
进一步地，在所述混合菌液中，在所述混合菌液中，寡养单胞菌(stenotrophomonas)、苍白杆菌(ochrobactrum)、无色杆菌(achromobacter)、链格孢菌(nimbyaalternantherae)、耐冷酵母(guehomyces)、假丝酵母菌(candida)、特异腐质霉(vanrijahumicola)和镰刀菌(fusarium)的体积比为：1:0.064:0.98:0.01:0.39:0.039:0.029:0.01。
进一步地，所述lhe培养基包括：蛋白胨9.0g/l～9.5g/l、nacl7.0g/l～7.5g/l、酵母粉3.5g/l～4.0g/l、滤纸片0.1g/l～0.2g/l，nano22g/l～2.5g/l和cacl20.1g/l～0.15g/l。
进一步地，所述发酵条件为：温度33℃～37℃，转速140rpm～180rpm，时长12～14h。
第三方面，本发明提供了上述纤维素降解复合菌剂在果树废弃枝条堆肥、降解果树废弃枝条中纤维素的应用，所述果树废弃枝条优选为葡萄废弃枝条。
优选地，在果树废弃枝条和粪肥的混合物中施加所述纤维素降解复合菌剂，所述纤维素降解复合菌剂占所述混合物总质量的1.8％～2.5％。
本发明提供了一种纤维素降解复合菌剂及其制备方法和应用，将不同功能的细菌和真菌进行复合，通过它们之间的协同作用实现对果树废弃枝条中纤维素的降解，具有如下有益效果：
(1)本发明的复合菌剂可以显著提高了生物堆肥中可能被植物所利用的n元素含量，鸡粪肥在堆肥腐熟后nh4提升了163％，no3提升了245.4％；
(2)本发明的复合菌剂极大程度地降低了生物堆肥中纤维素形态的c元素含量，猪粪肥在堆肥腐熟后c/n比由25:1下降至10.03：1；
(3)本发明的复合菌剂适用范围广，对各种类型的生物堆肥都能起到很好的纤维素降解作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例以如下方法制备微生物菌剂：
将含有寡养单胞菌(stenotrophomonas)、苍白杆菌(ochrobactrum)、无色杆菌(achromobacter)、链格孢菌(nimbyaalternantherae)、耐冷酵母(guehomyces)、假丝酵母菌(candida)、特异腐质霉(vanrijahumicola)和镰刀菌(fusarium)的体积比为1:0.064:0.98:0.01:0.39:0.039:0.029:0.01的混合菌液接种于lhe培养基中发酵即得纤维素降解复合菌剂。
lhe培养基包括：蛋白胨9.0g/l～9.5g/l、nacl7.0g/l～7.5g/l、酵母粉3.5g/l～4.0g/l、滤纸片0.1g/l～0.2g/l，nano22g/l～2.5g/l和cacl20.1g/l～0.15g/l。
制得菌剂为菌液形式，包括：
寡养单胞菌(stenotrophomonas)的活菌数为3.0～3.5lgcfu/ml，无色杆菌(achromobacter)的活菌数为2.5～3.5lgcfu/ml，苍白杆菌(ochrobactrum)的活菌数为1.0～1.2lgcfu/ml，链格孢菌(nimbyaalternantherae)的活菌数为0.04lg～0.055lgcfu/ml，耐冷酵母(guehomyces)的活菌数为0.4～0.5lgcfu/ml，假丝酵母菌(candida)的活菌数为0.25～0.3lgcfu/ml，特异腐质霉(vanrijahumicola)的活菌数为0.15～0.2lgcfu/ml，镰刀菌(fusarium)的活菌数为0.05～0.06lgcfu/ml。
复合微生物菌剂1：由寡养单胞菌(stenotrophomonas)、苍白杆菌(ochrobactrum)和无色杆菌(achromobacter)，所述真菌包括链格孢菌(nimbyaalternantherae)、耐冷酵母(guehomyces)、假丝酵母菌(candida)、特异腐质霉(vanrijahumicola)和镰刀菌(fusarium)组成，菌剂1中前述8种微生物的有效活菌数分别为3.0lgcfu/ml、2.5lgcfu/ml、1.0lgcfu/ml、0.04lgcfu/ml、0.41lgcfu/ml、0.25lgcfu/ml、0.15lgcfu/ml、0.05lgcfu/ml。
复合微生物菌剂2：由寡养单胞菌(stenotrophomonas)、苍白杆菌(ochrobactrum)和无色杆菌(achromobacter)，所述真菌包括链格孢菌(nimbyaalternantherae)、耐冷酵母(guehomyces)、假丝酵母菌(candida)、特异腐质霉(vanrijahumicola)和镰刀菌(fusarium)组成，菌剂2中前述8种微生物的有效活菌数分别为3.3lgcfu/ml、3.2lgcfu/ml、1.2lgcfu/ml、0.055lgcfu/ml、0.49lgcfu/ml、0.32lgcfu/ml、0.22lgcfu/ml、0.06lgcfu/ml。
实施例2
本实施例取猪和鸡的粪肥进行肥料腐熟实验来测定肥料腐熟前后n素组成及含量的变化，具体步骤如下：
(1)取猪的粪肥10kg配以6kg的葡萄树枝木屑，再加入20kg水进行堆肥，通过凯氏定氮法法对其中n素组成及含量进行测定。
(2)向步骤(1)的堆肥加入800ml实施例1所得的复合微生物菌剂1：
(3)进行堆肥腐熟30天后通过凯氏定氮法方法对其中n素组成及含量进行测定。
结果显示在堆肥腐熟前堆肥中nh4含量为6236.2mg/l，no3含量为10.1mg/l；在堆肥腐熟后nh4含量为8151.4mg/l，no3含量为15.1mg/l，其中nh4提升了30.7％，no3提升了49.5％。
实施例3
本实施例步骤与实施例1中相同，区别仅在于将猪的粪肥替换为鸡的粪肥。
结果显示在堆肥腐熟前堆肥中nh4含量为2296.3mg/l，no3含量为2.2mg/l，在堆肥腐熟后nh4含量为6041.3mg/l，no3含量为7.6mg/l，其中nh4提升了163％，no3提升了245.4％。
实施例4
本实施例取猪的粪肥进行堆肥腐熟实验来测定在肥料腐熟前后c/n比的变化，具体步骤如下：
(1)取猪粪4kg、葡萄树枝锯末4kg、尿素460g和水11.5kg进行堆肥，其中堆肥c/n比为25:1，通过稳定同位素比值质谱仪90sirms对其中c和n的元素占比进行检测。
(2)向步骤(1)的堆肥加入400ml实施例1所得的复合微生物菌剂2：
(3)堆肥腐熟30天，再通过稳定同位素比值质谱仪90sirms对其中c和n的元素占比进行检测。
以上步骤重复3次。
结果显示堆肥腐熟后c含量26.79％，n含量2.67％，c/n比为10.03:1，相比于初始状态下的25:1大幅下降，这表明，堆肥中可利用n素比例大幅上升。
实施例5
本实施例于实施例4步骤相同，区别仅在堆肥原料调整为鸡粪5kg、葡萄树枝锯末4kg、尿素245g和水11.6kg，其c/n比维持在25:1。
结果显示堆肥腐熟后c含量33.78％，n含量2.83％，c/n比为11.93:1。
对比例1
本对比例步骤与实施例2中相同，区别仅在于将菌剂中的无色杆菌替换为等量枯草芽孢杆菌，
结果显示在堆肥腐熟前堆肥中nh4含量为6554.9mg/l，no3含量为16.3mg/l；在堆肥腐熟后nh4含量为7793.6mg/l，no3含量为17.7mg/l，其中nh4提升了18.9％，no3提升了8.6％。
对比例2
本对比例步骤与实施例4中相同，区别仅在于将菌剂中的寡养单胞菌去除，其他不变。
结果显示，堆肥腐熟的自发性放热效果差，高温期延迟两天且缩短，在温度稳定后测定c含量44.13％，n含量2.22％，碳氮比为19.88：1。与实施例4相比，对比例2在相同腐熟天数后物料有微恶臭气味，秸秆较硬，崩解程度较低，腐熟程度不彻底。
对比例3
本对比例步骤与实施例4中相同，区别仅在于将菌剂中的寡养单胞菌替换为哈茨木霉菌，
结果显示堆肥腐熟后c含量41.83％，n含量2.51％，c/n比为16.67:1，尽管哈茨木霉菌是产纤维素酶活性高的菌株之一,所产生的纤维素酶对作物秸秆有降解作用,并能强力分解粗纤维、木质素等大分子有机物。但是跟该菌剂其他的菌种并不能良好协同左右，导致堆肥的碳氮比数值较高，相对替换前的菌种组合腐熟效果并没有达到理想效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。