一种壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶及其制备方法与流程

本发明属于生物医用水凝胶领域，具体涉及一种壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶及其制备方法。

背景技术：

水凝胶是一种具有三维网络结构的材料，具有一系列特质，包括易调节的物理、化学性能、生产制造多样性等，尤其是生物特性以及与细胞外基质的相似性，使水凝胶成为生物医用领域中最具有前景的材料之一。双网络水凝胶是一种新型的水凝胶，其中两种大分子相互作用而形成三维网络结构，通过二者之间的协同作用提高其性能，可显著增强增韧水凝胶。然而目前绝大多数的双网络水凝胶都采用纯化学交联或物理-化学交联的方式形成，体系中会残留具有生物毒性的单体、光引发剂、交联剂等，影响其生物相容性，使得它们在生物医用领域的应用中受到了极大的限制。在纯物理交联作用下制备的材料由于其制备过程纯净,在生物医用领域具有广泛的应用和显著的优势。但是仅由单纯的物理作用形成的大分子双网络水凝胶鲜有报道，主要是因为物理交联的作用力比化学交联要弱很多，想要达到对材料性能的大幅提升仍是一个巨大的挑战。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶及其制备方法，以获得生物相容性好、力学性能优良的生物医用水凝胶。

本发明采用以下技术方案实现：

一种壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶，利用琥珀酰化壳聚糖与壳聚糖之间的静电相互作用，以及分子内和分子间的氢键等相互作用，在碱性溶剂体系中，通过冷冻爆破法构筑一种纯物理作用交联的双网络复合水凝胶，具有良好的力学性能和优秀的生物相容性。

本发明还提供一种壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：

1)首先称取一定量的一水合氢氧化锂与尿素溶解于去离子水中，形成清澈的溶液，用该溶液作为后续实验的碱性溶剂体系，其中氢氧化锂、尿素的重量分数分别为3％～9％、6％～12％；

2)将琥珀酰化壳聚糖粉末加入到步骤1)中配制的碱性溶剂体系中，搅拌30-60分钟，然后将壳聚糖粉末加入上述溶液中，再搅拌10-30分钟；

3)将步骤2)中制得的混合物反复冷冻(-60～-80℃)-解冻(20～30℃)处理，且在解冻的过程中保持搅拌，冷冻-解冻反复3～5次后，获得较透明的琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖碱性溶液；

4)将步骤3)中制得的溶液注入模具，恒温水浴55～65℃加热2～5小时，脱模，得到水凝胶；

5)将步骤4)得到的水凝胶在去离子水中反复透析若干次，直至完全去除水凝胶中的氢氧化锂和尿素，得到纯物理作用交联的双网络复合水凝胶。

上述技术方案中，所述壳聚糖的脱乙酰度为80％～95％，分子量为200000～5000000，所述琥珀酰化壳聚糖分子量为20000～500000，琥珀酰化度为80％～90％。

进一步地，还可通过仿生矿化方法进一步提高采用上述方法制得的壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶的力学性能。

更进一步地，所述的仿生矿化方法具体包括以下步骤：

1)用滤纸快速吸去双网络复合水凝胶表面的水分，在氯化钙溶液中浸泡12～36小时，取出；

2)将步骤1)中得到的水凝胶放入去离子水中浸泡48～96小时，然后取出并用滤纸吸干表面的多余水分，然后放入到碳酸钠溶液中浸泡12～36小时，取出；

3)将步骤2)中得到的水凝胶放入去离子水中浸泡洗涤，直至将其中多余的离子完全洗净，得到矿化水凝胶。

更进一步地，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量分数为10％～40％，所述碳酸钠溶液中碳酸钠的质量分数为10％～20％。

本发明的发明原理为：

壳聚糖具有特别优异的生物相容性，但是纯壳聚糖水凝胶主要通过分子内或分子间氢键作用构筑物理交联的网络结构，其力学性能无法满足实际应用需求。琥珀酰化壳聚糖是一种壳聚糖衍生物，分子链上存在大量羧基，在水溶液中带负电，除了分子内与分子间氢键作用力外，还与壳聚糖链上质子化的氨基(带正电)之间存在强静电相互作用。因此，在碱溶剂体系中，壳聚糖和琥珀酰化壳聚糖在多种作用同时影响下，可以构筑一种纯物理交联的既具有双网络结构、又具有良好生物相容性的增强生物医用水凝胶。利用琥珀酰化壳聚糖上的羧基与钙离子配位结合的特点，采用仿生矿化手段在水凝胶中实现碳酸钙的原位生成，对双网络水凝胶进一步矿化增强，并且不影响其生物相容性。

本发明的有益效果在于：

本发明以碱溶壳聚糖为基础，选用了琥珀酰化壳聚糖为第二组分，以一种原位混合的方法制备得到了均一透明的壳聚糖/琥珀酰化壳聚糖溶液，进一步加热与透析得到结构致密规整的水凝胶。两种带有相反电荷的聚电解质间的静电相互作用，不仅加快了碱溶壳聚糖的凝胶化速度，还构筑了一种纯物理交联的双网络结构，大大增强了水凝胶的力学性能，同时保持了壳聚糖优秀的生物相容性，且其细胞毒性显著低于传统的物理-化学交联壳聚糖基双网络水凝胶(聚丙烯酰胺/壳聚糖复合水凝胶)。

本发明在壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶的基础上，将壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶进一步进行仿生矿化，可大幅提高其力学性能，而不影响其生物相容性，使其在生物医学领域具有更广泛的应用前景。

附图说明

图1是壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶的制备过程示意图；

图2是壳聚糖水凝胶(a)与琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖双网络水凝胶(b)内部结构形貌的扫描电镜照片；

图3是由mtt法评估的nih/3t3细胞在96孔板、琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖(scs/cs)双网络水凝胶、聚丙烯酰胺/壳聚糖(paam/cs)双网络水凝胶上的存活率。

具体实施方式

以下结合实例进一步说明本发明。如图1是壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶的制备过程示意图。

实施例1：

1)首先称取一定量的一水合氢氧化锂与尿素溶解于去离子水中，形成清澈的溶液，其中氢氧化锂、尿素的重量分数分别为3％、6％，用该溶液作为后续实验的碱性溶剂体系；

2)称取1克琥珀酰化壳聚糖(分子量100000，琥珀酰化度85％)粉末加入到步骤1)中配制的碱性溶剂中，搅拌30分钟，然后称取6克壳聚糖(分子量2000000，脱乙酰度95％)加入上述溶液中，再搅拌30分钟，配制成琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖质量分数为3％的溶液；

3)将步骤2)中制得的混合物反复冷冻(-80℃)-解冻(30℃)处理，且在解冻的过程中保持搅拌，冷冻-解冻反复3次后，获得较透明的琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖碱性溶液；

4)将步骤3)中制得的溶液注入模具，恒温水浴60℃加热2小时，脱模，得到水凝胶；

5)将步骤4)得到的水凝胶在去离子水中反复透析若干次，直至完全去除水凝胶中的氢氧化锂和尿素，得到纯物理作用交联的双网络复合水凝胶；

6)将步骤5)制得的壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶用滤纸快速吸去表面的水分，在10％的氯化钙溶液中浸泡12小时，取出，再放入去离子水中浸泡48小时，然后用滤纸吸干表面的多余水分，放入到10％的碳酸钠溶液中浸泡24小时，取出后放入去离子水中洗涤，直至其中多余的离子完全洗净，得到矿化水凝胶；

7)采用万能试验机进行水凝胶压缩性能测试，质量分数为3％的纯壳聚糖水凝胶的压缩模量只有66kpa，而步骤5)得到的纯物理交联双网络水凝胶压缩模量为100kpa，经仿生矿化处理后得到的矿化水凝胶压缩模量升高至115kpa。

实施例2：

1)首先称取一定量的一水合氢氧化锂与尿素溶解于去离子水中，形成清澈的溶液，其中氢氧化锂、尿素的重量分数分别为9％、12％，用该溶液作为后续实验的碱性溶剂体系；

2)称取1克琥珀酰化壳聚糖(分子量20000，琥珀酰化度90％)粉末加入到步骤1)中配制的碱性溶剂中，搅拌60分钟，然后称取5克壳聚糖(分子量5000000，脱乙酰度80％)加入上述溶液中，再搅拌10分钟，配制成琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖质量分数为2％的溶液；

3)将步骤2)中制得的混合物反复冷冻(-60℃)-解冻(20℃)处理，且在解冻的过程中保持搅拌，冷冻-解冻反复5次后，获得较透明的琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖碱性溶液；

4)将步骤3)中制得的溶液注入模具，恒温水浴55℃加热5小时，脱模，得到水凝胶；

5)将步骤4)得到的水凝胶在去离子水中反复透析若干次，直至完全去除水凝胶中的氢氧化锂和尿素，得到纯物理作用交联的双网络复合水凝胶；

6)将步骤5)制得的壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶用滤纸快速吸去表面的水分，在10％的氯化钙溶液中浸泡36小时，取出，再放入去离子水中浸泡96小时，然后用滤纸吸干表面的多余水分，放入到20％的碳酸钠溶液中浸泡12小时，取出后放入去离子水中洗涤，直至其中多余的离子完全洗净，得到矿化水凝胶；

7)采用万能试验机进行水凝胶压缩性能测试，质量分数为2％的纯壳聚糖水凝胶的压缩模量只有76kpa，而步骤5)得到的纯物理交联双网络水凝胶压缩模量为111kpa，经仿生矿化处理后得到的矿化水凝胶压缩模量升高至153kpa。

实施例3：

1)首先称取一定量的一水合氢氧化锂与尿素溶解于去离子水中，形成清澈的溶液，其中氢氧化锂、尿素的重量分数分别为6.3％、9.5％，用该溶液作为后续实验的碱性溶剂体系；

2)称取1克琥珀酰化壳聚糖(分子量500000，琥珀酰化度80％)粉末加入到步骤1)中配制的碱性溶剂中，搅拌40分钟，然后称取4克壳聚糖(分子量200000，脱乙酰度95％)加入上述溶液中，再搅拌20分钟，配制成琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖质量分数为5％的溶液；

3)将步骤2)中制得的混合物反复冷冻(-70℃)-解冻(25℃)处理，且在解冻的过程中保持搅拌，冷冻-解冻反复4次后，获得较透明的琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖碱性溶液；

4)将步骤3)中制得的溶液注入模具，恒温水浴65℃加热2小时，脱模，得到水凝胶；

5)将步骤4)得到的水凝胶在去离子水中反复透析若干次，直至完全去除水凝胶中的氢氧化锂和尿素，得到纯物理作用交联的双网络复合水凝胶；

6)将步骤5)制得的壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶用滤纸快速吸去表面的水分，在40％的氯化钙溶液中浸泡24小时，取出，再放入去离子水中浸泡72小时，然后用滤纸吸干表面的多余水分，放入到10％的碳酸钠溶液中浸泡36小时，取出后放入去离子水中洗涤，直至其中多余的离子完全洗净，得到矿化水凝胶；

7)采用万能试验机进行水凝胶压缩性能测试，质量分数为5％的纯壳聚糖水凝胶的压缩模量只有60kpa，而步骤5)得到的纯物理交联双网络水凝胶压缩模量为155kpa，经仿生矿化处理后得到的矿化水凝胶压缩模量升高至190kpa。

实施例4：

1)首先称取一定量的一水合氢氧化锂与尿素溶解于去离子水中，形成清澈的溶液，其中氢氧化锂、尿素的重量分数分别为6.3％、9.5％，用该溶液作为后续实验的碱性溶剂体系；

2)称取1克琥珀酰化壳聚糖(分子量100000，琥珀酰化度85％)粉末加入到步骤1)中配制的碱性溶剂中，搅拌30分钟，然后称取3克壳聚糖(分子量2000000，脱乙酰度95％)加入上述溶液中，再搅拌30分钟，配制成琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖质量分数为4％的溶液；

3)将步骤2)中制得的混合物反复冷冻(-80℃)-解冻(20℃)处理，且在解冻的过程中保持搅拌，冷冻-解冻反复3次后，获得较透明的琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖碱性溶液；

4)将步骤3)中制得的溶液注入模具，恒温水浴60℃加热4小时，脱模，得到水凝胶；

5)将步骤4)得到的水凝胶在去离子水中反复透析若干次，直至完全去除水凝胶中的氢氧化锂和尿素，得到纯物理作用交联的双网络复合水凝胶；

6)将步骤5)制得的壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶用滤纸快速吸去表面的水分，在10％的氯化钙溶液中浸泡36小时，取出，再放入去离子水中浸泡72小时，然后用滤纸吸干表面的多余水分，放入到10％的碳酸钠溶液中浸泡12小时，取出后放入去离子水中洗涤，直至其中多余的离子完全洗净，得到矿化水凝胶；

7)采用万能试验机进行水凝胶压缩性能测试，质量分数为4％的纯壳聚糖水凝胶的压缩模量只有72kpa，而步骤5)得到的纯物理交联双网络水凝胶压缩模量为165kpa，经仿生矿化处理后得到的矿化水凝胶压缩模量升高至212kpa。

实施例5：

1)首先称取一定量的一水合氢氧化锂与尿素溶解于去离子水中，形成清澈的溶液，其中氢氧化锂、尿素的重量分数分别为6.3％、9.5％，用该溶液作为后续实验的碱性溶剂体系；

2)称取1克琥珀酰化壳聚糖(分子量100000，琥珀酰化度85％)粉末加入到步骤1)中配制的碱性溶剂中，搅拌60分钟，然后称取6克壳聚糖(分子量2000000，脱乙酰度95％)加入上述溶液中，再搅拌10分钟，配制成琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖质量分数为3.5％的溶液；

3)将步骤2)中制得的混合物反复冷冻(-80℃)-解冻(20℃)处理，且在解冻的过程中保持搅拌，冷冻-解冻反复3次后，获得较透明的琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖碱性溶液；

4)将步骤3)中制得的溶液注入模具，恒温水浴60℃加热3小时，脱模，得到水凝胶；

5)将步骤4)得到的水凝胶在去离子水中反复透析若干次，直至完全去除水凝胶中的氢氧化锂和尿素，得到纯物理作用交联的双网络复合水凝胶；

6)将步骤5)制得的壳聚糖基纯物理交联双网络水凝胶用滤纸快速吸去表面的水分，在10％的氯化钙溶液中浸泡24小时，取出，再放入去离子水中浸泡48小时，然后用滤纸吸干表面的多余水分，放入到10％的碳酸钠溶液中浸泡24小时，取出后放入去离子水中洗涤，直至其中多余的离子完全洗净，得到矿化水凝胶；

7)采用万能试验机进行水凝胶压缩性能测试，质量分数为3.5％的纯壳聚糖水凝胶的压缩模量只有69kpa，而步骤5)得到的纯物理交联双网络水凝胶压缩模量为205kpa，经仿生矿化处理后得到的矿化水凝胶压缩模量升高至230kpa。

图2是壳聚糖水凝胶(a)与琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖双网络水凝胶(b)内部结构形貌的扫描电镜照片，由图可知采用本发明方法可制备得到结构致密规整的水凝胶。图3是由mtt法评估的nih/3t3细胞在96孔板、琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖(scs/cs)双网络水凝胶、聚丙烯酰胺/壳聚糖(paam/cs)双网络水凝胶上的存活率，可知本发明的琥珀酰化壳聚糖/壳聚糖双网络水凝胶的细胞毒性显著低于传统的物理-化学交联壳聚糖基双网络水凝胶(聚丙烯酰胺/壳聚糖复合水凝胶)。